PDCL3作为肝癌诊断、预后生物标志物和治疗靶标的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及PDCL3作为肝癌诊断、预后生物标志物和治疗靶标的应用。

背景技术

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球癌症致死亡的第三大原因。目前，许多肝癌患者由于早期症状并不明显，进入晚期才被明确诊断，且复发率高、存活率低。近年来，尽管HCC的早期诊断和管理有所改善，但恶性进展、复发和耐药性的挑战导致了HCC患者的生存率不令人满意。由于HCC缺乏有效的治疗靶点和有限的免疫治疗选择，仍然迫切需要进一步探索HCC的新生物标志物及其发病机制，提供有针对性的治疗策略来改善临床症状，提高HCC患者的生存效益。

复杂的病因因素、肝细胞癌的高度异质性以及有限的治疗策略，使得肝细胞癌的预后预测具有挑战性。虽然目前国内外对于肝细胞癌的治疗方案有所改善，但临床预后仍然较差，且肝细胞癌的预后标志物很少。因此，临床上急需能够精准预测肝细胞癌预后的生物标志物。

PDCL3(英文全称Phosducin-like protein 3，光导蛋白样蛋白)，也称为光蛋白样蛋白2A(PhPL2A)或病毒凋亡相关因子抑制剂(VIAF)，属于编码光素样蛋白家族。PDCL3是参与CCT依赖的蛋白折叠的必要基因。有研究报道，在一些实体肿瘤和血液系统恶性肿瘤中，伴侣蛋白持续升高，它们通过允许持续的蛋白翻译和细胞增殖来促进肿瘤细胞的存活、生长和转移。有趣的是，PDCL3和CCT可能在调节细胞周期进程所需成分的折叠中发挥共同伴侣作用。此外，PDCL3被发现在细胞凋亡中发挥重要作用，可能是因为PDCL3佐剂促进了一个或多个促凋亡的折叠。但PDCL3在肝细胞癌中的作用却未见相关研究报道。

发明内容

本发明通过生物信息学技术和体外实验研究了PDCL3在肝细胞癌中的作用，实验发现PDCL3可作为肝细胞癌诊断或预后的生物标志物以及治疗新靶点。基于此，本发明提供了如下技术方案：

本发明的第一方面提供检测生物标志物PDCL3表达的试剂在制备用于对肝癌对象进行诊断或预后的产品中的应用。

所述诊断的方法包括：从疑似患有肝癌的对象中获得测试样品，确定所述测试样品中PDCL3的表达水平，如果较正常对照PDCL3高表达，提示对象为肝癌患者。

所述预后的方法包括：从患有肝癌的对象中获得测试样品，确定所述测试样品中PDCL3的表达水平用于提供对象的预后，PDCL3高表达患者预示着患者的不良预后。

本发明的第二方面提供PDCL3作为靶点在筛选治疗肝癌的药物中的应用。

其中，PDCL3作为免疫治疗靶点。

所述药物抑制PDCL3的表达，从而抑制肝癌细胞增殖能力，进而减缓或阻止肝癌发展。

本发明的第三方面提供PDCL3表达抑制剂在制备治疗肝癌的药物中的应用。

所述表达抑制剂为siRNA，包括siRNA-1和siRNA-2，其核苷酸序列为：

siRNA-1的正义链为：5’CCAAGGAAAGUCUGAAAGAAUTT3’，反义链为：5’AUUCUUUCAGACUUUCCUUGGTT3’；

siRNA-2的正义链为：5’GCACCUUUACAAACAAGGAAUTT3’，反义链为：5’AUUCCUUGUUUGUAAAGGUGCTT3’。

优选地，在上述任一项所述的应用技术方案中，所述肝癌为肝细胞癌。

本发明的有益效果是：通过生物信息技术和体外细胞实验发现肝细胞癌组织中PDCL3在mRNA和蛋白质水平的表达量都高于正常肝组织，并且随着肝细胞癌的发展，PDCL3的表达量呈递增趋势，这提示PDCL3的高表达可能参与了HCC细胞的增殖生长过程。进一步的生存分析结果显示PDCL3与HCC预后有关。体外实验结果证明，干扰PDCL3的表达能够抑制HCC细胞的增殖能力。并且基于对HCC免疫微环境的评估，发现PDCL3低表达组的HCC患者更有可能从免疫治疗获益。本发明研究发现PDCL3可以作为肝癌早期的诊断指标、预后标志物以及作为HCC治疗的新靶点，为肝癌的早发现、早治疗以及预后提供新的方向及靶点。

附图说明

图1为通过生信分析和实验验证所得PDCL3在mRNA和蛋白质水平的表达差异。

图2为生信分析所得PDCL3对生存和预后的影响。

图3为体外细胞实验验证PDCL3表达量的敲低以及对HCC细胞增殖的影响。

图4为与PDCL3表达与HCC免疫浸润的关系和突变分析。

图5为PDCL3发挥作用相关的功能和通路研究。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1

1.生物信息分析

1.1表达分析

为了评估肿瘤与肿瘤附近正常组织之间PDCL3表达的差异，我们对TCGA-LIHC数据以及GEO数据库中的GSE54236和GSE174570数据集进行了差异分析和可视化。利用UALCAN数据库分析LIHC的蛋白表达数据，以获得PDCL3的差异蛋白表达水平。

1.2 Kaplan-Meier生存分析

PDCL3 mRNA表达及其在HCC组织中HCC mRNA表达数据和HCC患者预后生存数据来自TCGA-LIHC队列和LIRI-JP数据库集。采用生存R包分析PDCL3表达与HCC患者预后的关系。使用R包绘制Kaplan-Meier(K-M)生存曲线。采用单因素和多因素Cox回归分析来评估PDCL3的预测价值和临床参数，包括肿瘤分期、肿瘤分级、年龄和性别。

1.3 PDCL3表达与HCC免疫浸润的关系

采用R软件包“GSVA”对368例患者进行了16种免疫细胞的比例和13种免疫功能的定量分析。采用R软件包“GSVA”对368例患者进行了16种免疫细胞的比例和13种免疫功能的定量分析。采用Wilcoxon检验分析PDCL3高表达组与PDCL3低表达组患者免疫细胞浸润程度和免疫功能的差异。

1.4突变分析

从TCGA数据库中收集了354例HCC患者的体细胞突变数据。为了PDCL3高表达组和低表达组中突变基因的变异，我们使用R软件包“TCGA突变”和“maftools”进行了突变分析。

1.5富集分析

使用ggstatsplot R包计算TCGA-LIHC队列中与PDCL3共表达的基因。采用京都基因和基因组百科全书(KEGG)分析，探索PDCL3相关基因的功能。结果使用ggplot2 R软件包绘制。当p<值为0.05时，认为结果有显著性差异。

2.实验部分

2.1细胞培养

人肝癌细胞HepG2、Hep3B、Huh7和人正常肝细胞MIHA细胞在添加10％胎牛血清(ExCell Bio，上海)和1％青霉素-链霉素(Solarbio，北京)的DMEM高糖培养基(GIBCO，美国)中生长。将细胞放在温度为37℃、二氧化碳浓度为5％的培养箱中培养。

2.2细胞转染

PDCL3在NCBI的登录号是NM_024065.5。

提前一天在6孔板中接种Hep3B和Huh7细胞，待细胞汇合度达到60％-70％左右时进行转染。使用小干扰RNA(siRNA)购自上海三工生物技术公司(中国)，并根据lip3000(生命技术公司，卡尔斯巴德，加州，美国)转染siRNA转染细胞。所用到的siRNA的序列如表1所示：

表1

2.3实时荧光定量PCR

使用TRIzol试剂(Takara，日本)从细胞中提取总RNA，并测量其浓度。采用Evo M-MLV反转录预混型试剂盒(AG，中国)将提取的总RNA逆转录为cDNA。采用SYBR Green ProTaq HS预混型qPCR试剂盒(AG，中国)进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测基因表达水平。结果归一化为GAPDH的表达水平，采用2-ΔΔct法计算目的基因的表达水平。所用到的引物如表2所示：

表2

2.4免疫印迹试验

将培养好的细胞使用提前预冷的PBS清洗2次，使用RIPA细胞裂解液(Beyotime，中国)完全裂解细胞，收集上清液，用Bradford法(Beyotime，中国)检测蛋白浓度。使用12.5％的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，根据目的蛋白的分子量剪裁出对应区间大小，并转移到PVDF膜上(Merck-Millipore,德国)，然后用快速封闭液封闭10分钟，并与一抗在4℃下孵育过夜。第二天，将膜与相应的二抗(EarthOx,美国)室温孵育1.5h，并使用ECL化学发光底物((GE Healthcare,美国)检测，使用Image J软件分析蛋白条带的灰度值。本研究中使用的目的蛋白一抗为anti-PDCL3 antibody(CUSABIO，中国)，抗体稀释比为1：1000，内参一抗为anti-GAPDH antibody(Proteintech，中国)，抗体稀释比为1：5000。

2.5细胞增殖试验

为了检测细胞的增殖速度，我们将细胞以每孔3×10

3.统计分析

生物信息分析结果采用R软件(version 4.1.2)进行统计分析。体外细胞实验使用GraphPad Prism 9进行统计分析，每个实验至少包括三个独立重复实验，采用Student’s ttest进行统计学分析，p值<为0.05被认为有统计学意义。

4结果

4.1 PDCL3在人HCC组织和细胞系中表达上调

首先，为了确定PDCL3在HCC进展中的作用，我们分析了与HCC相关的TCGA和GEO数据库。与正常组织相比，HCC组织中PDCL3 mRNA水平明显升高(图1A-C)。通过对CPTAC样本的分析，HCC组织中PDCL3蛋白水平显著升高(图1D)。此外，qRT-PCR和WB实验表明，HCC细胞系HepG2、Hep3B和Huh7中PDCL3 mRNA和蛋白水平始终高于人正常肝细胞系MIHA(图1E-G)。这些结果表明，PDCL3在人HCC组织和HCC细胞系中的表达特征显著上调。

4.2 PDCL3的高表达与HCC患者的预后不良有关

通过分析TCGA数据库中368例HCC患者的数据，我们接下来研究了PDCL3的表达是否与预后相关。结果显示，HCC组织中PDCL3的mRNA水平与HCC患者的总生存期(OS)呈负相关(图2A)。然后，对LIRI-JP数据集的分析结果同样证实了PDCL3的HCC组织表达与OS呈负相关(图2B)。单因素和多因素Cox回归分析进一步评估了PDCL3的预测价值和临床参数，包括肿瘤分期、肿瘤分级、年龄和性别，证实PDCL3的表达确实是HCC患者的独立预后标志物(图2C-D)。

4.3 PDCL3基因敲低抑制了HCC细胞的增殖

为了研究PDCL3对HCC细胞的增殖作用，我们检测了在没有或存在两种特异性siRNA干扰HCC的情况下，HepG2和Hep3B细胞的功能。siPDCL3-1和siPDCL3-2能够显著降低PDCL3蛋白和mRNA的表达水平，证实了sirna靶向敲除的有效性(图3A-C)。CCK8结果显示，敲除PDCL3后，HepG2和Hep3B细胞的增殖能力减弱(图3D)。这一体外实验证据表明，PDCL3能够影响HCC细胞的增殖能力。

4.4免疫浸润分析和突变分析结果

探索免疫活性和生存状态之间的关系，低表达组患者使用单样本基因集富集分析(ssGSEA)分析免疫细胞浸润和免疫相关信号通路，这表明巨噬细胞和调节性T细胞的数量(Treg)PDCL3高表达组大于PDCL3低表达组(图4A)。此外，与PDCL3低表达组相比，PDCL3高表达组表现出更高的APC_co_inhibition、APC_co_stimulation、CCR、免疫检查点、HLA、MHC_class_I、T_cell_co_stimulation、T_cell_co_stimulation，但较低的II型IFN反应信号(图4B)。由于基因突变有助于癌症的发展，我们随后分析了突变与PDCL3表达之间的关系。结果显示，PDCL3高表达组和PDCL3低表达组中前20个突变基因的突变率分别为90.45％和85.14％。PDCL3高表达组的前5位基因为TP53、TTN、CTNNB1、MUC16和LRP1B，而PDCL3低表达组的基因为CTNNB1、TTN、TP53、MUC16和ALB(图4C-D)。

4.5与PDCL3发挥作用相关的功能和通路研究

富集分析显示(图5)，PDCL3相关基因被富集到Hippo通路中。因此，PDCL3可能也在这些通路中发挥了复杂的作用。

5分析

HCC的诊断和治疗仍然是肿瘤学领域的一个令人信服的挑战。基于生物信息学的方法可以为肿瘤的诊断和治疗标志物筛选提供有效的策略。PDCL3最初在视网膜中被识别，因为它与纯化的传感器蛋白Gbg和视觉系统相连，其表达特性也存在于多种其他组织中，如大脑、肝脏、松果体和嗅觉上皮。在本研究中，我们发现PDCL3是一种在HCC组织中高表达的新的生物标志物，它与HCC的不良预后密切相关。此外，PDCL3能够增强HCC细胞的增殖，并与Hippo等通路表达相关。

基于生物信息学挖掘的基因组策略提供了寻找可靠的预测和治疗性HCC标记物的可能性。基于单一的生物标志物或多种标志物的组合可为肿瘤诊断提供丰富的信息，包括早期诊断、治疗监测、预后评估，甚至是免疫浸润信息和耐药性评估。PDCL3是一种研究不足的指标，其在肿瘤学中的作用和价值很少被报道。通过进行多种生物信息学分析和siRNA实验，我们确定PDCL3可以作为HCC的独立预后评估者，这是一个创新的发现。

在这项工作中，我们通过生物信息技术和体外细胞实验发现肝细胞癌组织中PDCL3在mRNA和蛋白质水平的表达量都高于正常肝组织，并且随着肝细胞癌的发展，PDCL3的表达量呈递增趋势，这种基因表达量的增高可能是拷贝数变异和基因甲基化共同作用的结果，这提示PDCL3的高表达可能参与了HCC细胞的增殖生长过程。进一步的生存分析结果显示，PDCL3表达量高的HCC患者生存率较低，暗示了PDCL3与HCC预后有关。体外实验结果证明，干扰PDCL3的表达能够抑制HCC细胞的增殖能力。这些结果提示，PDCL3的异常高表达与HCC的生长与增殖可能有密切的正相关关系，PDCL3有可能作为肝癌早期的诊断指标，也有可能是HCC治疗的新靶点。

癌细胞的主要特征之一是获得持续的增殖能力，并逃避肿瘤抑制途径的影响，这些过程在体内受到多种信号通路的调控。我们发现PDCL3促进HCC细胞增殖可能与其参与了Hippo信号通路有关。此外，由于核受体超级家族包含在适应肿瘤生长的多种基质细胞和实质细胞中，其既定的生理作用表明了在肿瘤微环境中作为治疗和预防靶标的潜力。因此，PDCL3可能成为指导HCC治疗的一个免疫靶点。

总之，我们推测PDCL3在促进HCC进展方面具有巨大的潜力。PDCL3可作为一种新的预后生物标志物和临床治疗靶点用于对肝细胞癌患者预后和治疗产品中的应用。