用于鉴别检验非洲猪瘟病毒的PCR扩增引物对、及其制备的试剂盒

技术领域

本发明属于病毒的检测领域，具体涉及用于鉴别检验非洲猪瘟病毒的PCR扩增引物对，以及包含该PCR扩增引物对的试剂盒。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的猪的一种烈性、高度接触性传染病。非洲猪瘟病毒是一种有囊膜的单分子线状双链DNA病毒，其基因组长约170kb～193kb。ASF具有高发病率、高死亡率等特点，一旦发生，经济损失巨大；目前缺乏有效疫苗和特异性治疗手段，使ASF成为目前危害养猪业的最严重疫病之一。目前对ASF的控制只能依赖实验室的快速诊断、对发病动物的捕杀，以及采取有效的检疫措施和严格的卫生措施。

目前，ASF在我国首次爆发，国内多个地区流行，疫情持续扩大。有效疫苗的研发成为防控疫情的可能手段，鉴于目前全病毒灭活疫苗不能引起有效免疫反应，基因缺失活疫苗成为另一种可能的选择，为针对基因缺失活疫苗和野毒株的区分鉴别，现有技术中急需提供一种简便、准确的检测方法以及其相应的检测物质。

发明内容

本发明的目的是提供鉴别检验非洲猪瘟病毒株的PCR引物，该引物具有特异性强、敏感性高等优点。

为此，本发明提供了一种用于鉴别检验非洲猪瘟病毒的PCR扩增引物对，其中，所述PCR扩增引物对的上游引物如SEQ.ID.NO.1所示，其下游引物如SEQ.ID.NO.2所示。

本发明首次公开了用于鉴别检验非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗株的PCR引物对，能同时鉴别检验非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失疫苗株，特异性强、灵敏度高；且对不同地域来源的野毒株均能有效检测。

本发明还提供了一种用于鉴别检验非洲猪瘟病毒的试剂盒，其中，所述试剂盒包括所述的PCR扩增引物对。

本发明的针对必需毒力基因缺失鉴别检验的试剂盒，能有效区分疫苗株和野毒株，提供了疫病精确监测和精准防控疫情的关键技术。由于本发明PCR检测引物对具有特异性强、敏感性高的特点，包含本发明引物对的试剂盒灵敏、便捷、特异性强、敏感性高、可靠性好，只需一次检测便能准确鉴定样本是含有非洲猪瘟病毒疫苗株或野毒株，可以同时进行大批量的样本分析，为非洲猪瘟病毒疫情的监测、防控提供有力的技术支持。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述试剂盒还包括Taq DNA聚合酶、5×反应缓冲液、dNTPs、ddH

本发明试剂盒不仅特异性强、敏感性高，且能针对多种样本进行检测，不仅能应用于血清样本，还能应用于肝脏、淋巴结、流产胎儿、脾脏、肺、肾脏多种组织。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述Taq DNA聚合酶浓度为5U/μl，5×反应缓冲液为5×Tris-HCl(pH8.3)，浓度为50mM，dNTPs浓度为2.5mM，所述上游引物浓度为10μΜ，所述下游引物浓度为10μΜ。

本发明的试剂盒灵敏度高，可用于非洲猪瘟感染早期的临床检测。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述试剂盒还包括酶混合液和PCR反应液；其中，所述酶混合液由Taq DNA聚合酶、Tris-HCl、EDTA、DTT、甘油和Tween-20组成，所述PCR反应液由所述扩增引物对(其中上游引物、下游引物体积比为1:1)、5×反应缓冲液(5×Tris-HCl50mM)、dNTPs和ddH

本发明通过建立多组分微量组合工艺技术，将试剂盒原有多种化学试剂成分组配成2类：合并酶反应试剂，优化各组分比例；合并PCR反应液，优化各组分比例；本工艺技术意外发现酶活性增强，提高了试剂盒灵敏度。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述Taq DNA聚合酶、Tris-HCl、EDTA、DTT、甘油和Tween-20含量分别为0.5U/μl、25mM、0.05mM、0.05mM、40％V/V、0.2％V/V，所述扩增引物对(其中上游引物、下游引物体积比为1:1)、5×反应缓冲液(5×Tris-HCl)、dNTPs和ddH

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述试剂盒还包括非洲猪瘟病毒DNA提取试剂。

非洲猪瘟病毒DNA提取试剂可以是本领域公知的DNA病毒基因组提取试剂。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述试剂盒还包括阳性对照1、阳性对照2、阴性对照，所述阳性对照1为含有能为所述PCR扩增引物对扩增出的如SEQ.ID.No.3所示非洲猪瘟病毒基因片段的重组质粒，所述阳性对照2为含有能为所述PCR扩增引物对扩增的如SEQ.ID.No.4所示非洲猪瘟病毒基因片段的重组质粒，所述阴性对照为蒸馏水。

本发明还公开了所述试剂盒在鉴别检验非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗株和野毒株中的应用，包括以下步骤：(1)提取待检测样品的DNA；(2)以待检测样品的DNA为模板，采用SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2所示核苷酸序列组成的引物对建立PCR反应体系进行PCR扩增；(3)对扩增引物进行分析，如果扩增产物出现933bp的条带，说明待检测的样品中含有非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗株，如果扩增产物出现8492bp的条带，说明待检测的样品中含有非洲猪瘟病毒野毒株。

本发明还提供一种鉴别检验非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗株的PCR扩增反应程序：95℃预变性5min；40个循环，每个循环为95℃30sec，52℃30sec，72℃30sec，72℃延伸10min。

作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒使用的PCR反应体系为50μl，由酶混合液5μl、PCR反应液40μl和待测DNA模板5μl组成。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1非洲猪瘟病毒的扩增引物

本发明使用的一对扩增引物见序列表1。

表1用于非洲猪瘟病毒PCR扩增引物

非洲猪瘟病毒PCR方法的反应体系见表2，反应条件见表3。

表2非洲猪瘟病毒PCR方法的反应体系

表3非洲猪瘟病毒PCR方法的反应条件

实施例2非洲猪瘟病毒PCR检测方法的优化

1、非洲猪瘟病毒PCR方法的反应体系

非洲猪瘟病毒PCR方法的优化原则是：通过优化以下各个条件使同一样本获得最大的扩增效率。

商品化5U/μl Taq酶在50μl反应体系中一般添加2μl，终浓度为0.2U/μl，本实施例在进一步降低Taq酶终浓度的条件下，通过建立多组分微量组合工艺技术，将试剂盒原有多种化学试剂成分组配成2类，制备特定的酶混合液和PCR反应液，来实现试剂盒检测条件的进一步优化，大大提高了敏感性和特异性。经过优化，非洲猪瘟病毒实时荧光PCR方法的反应体系见表4。酶混合液在50μl反应体系中一般添加5μl，终浓度为0.05U/μl。

表4优化后的非洲猪瘟病毒PCR反应体系

2、结果判定

用紫外光源检查凝胶，参考DNA分子量标准，计算试验样品和阳性对照PCR产物的分子量。

(1)试验成立条件

阳性对照1应出现933bp的DNA条带，阳性对照2应出现8492bp的DNA条带，阴性对照无条带。

(2)试验结果判定

样品出现一条孤立的、与阳性对照1的PCR产物迁移距离相同的带，则样品为非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗株；样品出现一条孤立的、与阳性对照2的PCR产物迁移距离相同的带，则样品为非洲猪瘟病毒野毒株。

(3)样品检测试验及结果

试验对猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)进行扩增，结果只有非洲猪瘟病毒得到特异性的条带。

实施例3 PCR检测试剂盒敏感性和特异性比较试验

按照实施例1条件优化前组分组装非洲猪瘟病毒PCR试剂盒1，实施例2条件优化后组分组装非洲猪瘟病毒PCR试剂盒2。比较两个试剂盒的敏感性和特异性。

将非洲猪瘟病毒DNA模板连续10倍稀释后，试剂盒1和试剂盒2分别按照优化前、优化后条件进行PCR敏感性试验。

结果显示，试剂盒1敏感度最低可达80拷贝，试剂盒2敏感性最低可达8拷贝。表明，本发明筛选的引物具有很高的敏感性，条件优化后进一步提高了试剂盒的敏感性。

使用试剂盒1和试剂盒2分别按照优化前、优化后条件对猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪副流感病毒、猪细小病毒、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒及非洲猪瘟病毒阴性猪肺脏、淋巴结、扁桃体进行特异性试验，结果显示，非洲猪瘟病毒检测结果为阴性。实验结果证实，本申请的试剂盒具有相当高的特异性。

实施例4疑似非洲猪瘟病料样品检测比较

取采自不同地区临床发病猪场的疑似病猪的组织样品，包括猪肝脏9份、肺脏10份、肾脏5份、淋巴结9份、脾脏8份、流产胎儿6份，使用试剂盒1和试剂盒2分别按照优化前、优化后条件进行非洲猪瘟病毒野毒检测。检测结果见表5。

表5临床疑似非洲猪瘟病毒感染猪样品的检测

结果表明，在47份病料中，试剂盒1检出21份非洲猪瘟阳性病料，检出率为44.7％；试剂盒2同样能检出试剂盒1所检出的阳性病料，二者符合率达100％；试剂盒2检出34份非洲猪瘟阳性病料，检出率为72.3％，比试剂盒1的检出率高27.6％；试剂盒2检出阳性而试剂盒1未检出的病料病毒含量均较少，DNA模板量为10～30拷贝；试剂盒1和试剂盒2检出的非洲猪瘟阳性病料均为野毒感染。条件优化后的试剂盒2检测敏感性明显高于试剂盒1，能检测出病毒含量较低的病料，而同样对于阴性样品均不能检测出。

实施例5试剂盒的临床应用

抽样采取不同地区未发生临床症状猪场的血清样品36份，使用试剂盒1按照优化前条件进行非洲猪瘟野毒检测，同时，使用试剂盒2按照优化后条件进行非洲猪瘟野毒检测复核。检测结果见表6。

表6试剂盒临床应用非洲猪瘟检测结果

结果表明，在36份血清中，试剂盒1检出9份非洲猪瘟病毒阳性样品，检出率为25.0％；试剂盒2同样能检出试剂盒1所检出的阳性样品，符合率达100％；试剂盒2检出19份非洲猪瘟病毒阳性样品，检出率为52.8％，比试剂盒1的检出率高27.8％；试剂盒1和试剂盒2检出的非洲猪瘟阳性病料均为野毒感染。条件优化后的试剂盒2检测敏感性明显高于试剂盒1，能检测出病毒含量较低的样品，而同样对于阴性样品均不能检测出。且本发明试剂盒对不同地域来源的疑似感染样本均能准确检测。

实施例6非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗株的检测

将免疫非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗株(MGF360-505R基因缺失)的猪只20只分别隔离饲养，并每天采集血清，用试剂盒1按照优化前条件进行非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗株检测，同时，用试剂盒2按照优化后的条件进行非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗株检测复核，检测结果见表7。

表7非洲猪瘟病毒基因缺失株检测结果

所有猪只单独隔离饲养，结果显示，第0天和第1天两个试剂盒均未能检测阳性；试剂盒2在第2天能检测到4头阳性，检出率20.0％，试剂盒1未能检测到阳性；试剂盒1在第3天检测到5头阳性，试剂盒2检测到10头阳性，试剂盒1检测阳性的猪只试剂盒2检测也均为阳性；试剂盒1和试剂盒2在第4天检测全部猪只均为阳性，之后检测至第7天，也均为阳性；试剂盒1就同样阳性猪只需要到第4天才能检出与试剂盒2相同的结果。

表明，本发明条件优化后的试剂盒2检测敏感性明显高于试剂盒1，能检测出病毒含量较低的样品；也说明本发明条件优化后的试剂盒2能较早检测到非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗株，能区分开野毒感染或是基因缺失疫苗株免疫，能及早处置，为非洲猪瘟病毒感染进行及早防控。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 洛阳普泰生物技术有限公司

<120> 用于鉴别检验非洲猪瘟病毒的PCR扩增引物对、及其制备的试剂盒

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 1

gatctaccgg tatacactgc c 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 2

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<210> 3

<211> 933

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒疫苗株（African swine fever virus vaccine strain）

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<210> 4

<211> 8492

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒野毒株（African swine fever virus wild strain）

<400> 4

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acatgccttt ccatcctttg acggaaatca aattatctac taataactat cagtgtttat 120

attaagtatt tagatattat cccgggctgg atacgtagta tcgctattca catgtacttc 180

caactctagc cggagcctgc agggtcattt atttttaata ttgattcttt tttgtattta 240

atcatttaga gaaggtcatc ataggagcca gatgttctct ctccagaact tatgtcgaaa 300

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atgatgtcct taaatggata gagcaaacca tacatgttta cgacctaaag attatgttta 6240

atattgccat ctccaagagg gatctgacta tgtactcctt aggatatatt ttcctttttg 6300

atagagggaa caccgaagct acgttgctaa cgcaacatct caagaagaca gcggccaaag 6360

ggctcctcca ctttgtgcta gaaacgttaa aatacggcgg caacatagat accgtcctga 6420

cccaagccgt aaagtacaat catagaaaac ttttagatta ttttctgcgt caactacctc 6480

gtaaacatat tgaaaaactt ttgttgctgg ccgtgcagga aaaggcttct aaaaaaacat 6540

tgaacttact gttgtcacat ttaaactact ccgtgaaacg catcaaaaaa ctaccgcgct 6600

atgtgataga gtacgagtcc accttggtga taaagatttt attaaaaaaa agagtgaacc 6660

tgatagatgc catgttggaa aagatggtaa gatatttttc tgcgacgaaa gtgaggacga 6720

tcatggatga gctttcgatt agtccggaaa gagtcattaa gatggctata cagaaaatga 6780

gaacggatat cgtaatccat acttcttatg tttgggagga tgatctagaa cgtcttactc 6840

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ggttgtgtgg atagagggag ttctaggcgt cggcaaagtt acatctcttt tcaccattgc 7920

gattagcaac agagacctac agctgtattc tctgggctac tcaattatcc ttgagaattt 7980

gtactcctgt ggacaggacc ccaagttttt actaaatcat ttcctgcgag acgtttcaat 8040

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agtcttatca tacattaaaa ttccagtaaa atttatattt tttttggtaa acaaatgttt 8340

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gacgctgtgt ttgtacagcg aaacatcgtc ct 8492