一种三肽化合物及其铜离子螯合物在预防和治疗矽肺中的应用

技术领域

本发明涉及矽肺的治疗领域，尤其涉及一种基于三肽化合物及其铜离子螯合物在矽肺预防和治疗中的应用。

背景技术

矽肺是因长期大量吸入游离二氧化硅（sio2）粉尘所引起的肺组织弥漫性纤维化为主要特征的全身性疾病，是我国发病率较高的职业病之一，其主要以肺部持续炎症、肺泡上皮结构破坏、成纤维细胞增生、上皮间质转化和细胞外基质过度沉积为主要的病理改变。许多因素在矽肺的发生和发展中起到重要作用，其中炎症反应、氧化应激及上皮间充质转化（epithelialmesenchymaltransition，EMT）尤为重要。目前仍无有效的针对于矽肺的治疗措施，而炎症反应、氧化应激及EMT可能成为矽肺治疗的新的潜在靶点。寻找在矽肺预防和治疗中起保护性、治疗性作用的新型抗氧化或抗炎制剂尤为重要。

甘氨酰-组氨酸-赖氨酸（Gly-His-Lys，GHK）是具有氨基酸序列甘氨酰-组氨酸-赖氨酸的活性三肽，是人血浆、唾液和尿液的正常成分，是一种与人白蛋白结合的结合肽，最早用于伤口愈合和抗衰老皮肤护理。GHK可能是皮肤修复的早期信号蛋白，存在于I型胶原的α2（I）链中，当损伤激活蛋白水解酶时，GHK被释放到损伤部位，并发挥局部愈合作用。近年来随着研究的不断深入，GHK改善伤口愈合、促进组织再生以及抗炎抗氧化的能力逐渐在骨、肝脏和胃肠壁等组织中得到证实，能够增加胶原蛋白、弹力蛋白生成，促进血管、神经生长，增强干细胞功能和促进间充质干细胞分泌营养因子。GHK是天然存在的，无毒的，并且容易与铜形成络合物，从而提高了GHK的生物利用度，尤其是具有抗氧化和消炎功能。GHK-Cu复合物通过多种机制发挥抗氧化功能。GHK，作为三肽单独使用，可以猝灭与变性神经病和疾病有关的有毒脂肪酸脂质过氧化产物。铜成分作为金属离子激活铜和锌依赖性超氧化物歧化酶，后者可作为内源性抗氧化剂。该复合物还可以通过抑制受损组织中铁蛋白铁的释放来减少氧化损伤，从而防止炎症。在伤口愈合组织和皮肤修复中，GHK-Cu会降低促炎细胞因子的表达，例如肿瘤坏死因子（TNF）-α和转化生长因子（TGF）-β，其由于某些刺激后的异常修复和再生而在肺纤维化肺组织中过表达。因此，GHK-Cu的抗氧化和抗炎特性使其成为治疗肺纤维化的潜在药物。但是，迄今为止，尚无研究报道检查GHK-Cu对矽肺的作用。

发明内容

鉴于现有技术存在的问题，本发明目的在于提供一种短肽及其铜离子螯合物新的医药用途，该三肽化合物在体内具有活性成分，通过抗氧化应激，抑制炎症反应以及抑制上皮细胞间充质化，为治疗矽肺的研发奠定了理论基础。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种短肽及其铜离子螯合物在制备用于预防和/或治疗矽肺的药物中的应用，所述短肽的氨基酸序列为如为Gly-His-Lys。

一种药物组合物，包括所述的短肽及其铜离子螯合物。

进一步地，所述药物组合物在制备用于预防和/或治疗矽肺的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下。

1）本发明中首次将该短肽及其铜离子螯合物应用于矽肺，在应用上具有创新性。

2）本发明中提供的短肽经实验验证，可以通过拮抗氧化应激反应及上皮细胞间充质化抑制硅结节的形成及胶原沉积，抑制肺部炎症反应，进而抑制硅诱导的肺纤维化即矽肺的发生发展。

附图说明

图1为苏木素-伊红（HE）染色检测本发明GHK-Cu复合物对硅诱导的肺部炎症反应及硅结节的作用。

图2为苏木素-伊红（HE）染色检测本发明GHK短肽对硅诱导的肺部炎症反应及硅结节的作用。

图3为ELISA检测本发明GHK-Cu复合物对BALF中炎症因子IL-6及TNFα表达水平的影响。

图4为氧化应激指标的分析检测本发明GHK-Cu复合物对硅诱导的氧化应激反应的影响。

图5为马松染色及HYP实验检测本发明GHK-Cu复合物对硅诱导的胶原沉积及肺纤维化严重性影响（4X）。

图6为马松染色及HYP实验检测本发明GHK短肽对硅诱导的胶原沉积及肺纤维化严重性影响（100X）。

图7为马松染色及HYP实验检测本发明GHK短肽对硅诱导的胶原沉积及肺纤维化严重性影响（200X）。

图8为GHK对硅诱导的胶原沉积及肺纤维化严重性影响。

图9为马松染色及HYP实验检测本发明GHK短肽对硅诱导的胶原沉积及肺纤维化严重性影响（4X）。

图10为免疫组化染色检测本发明短肽对硅诱导的小鼠肺EMT现象的影响：对α-SMA表达的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。在实施例中的操作方法均为本技术领域常规操作方法。

实施例1 硅诱导小鼠矽肺模型的建立、实验分组与给药方法。

将C57BL/6小鼠随机分成5组：对照组，硅诱导小鼠肺纤维化模型组（Si组），Si+0.2μg/g GHK-Cu组、Si+ 2μg/g GHK-Cu组、Si+20μg/g GHK-Cu。除对照组外，其余各组采用经口灌注二氧化硅悬浊液建立小鼠矽肺模型，将5mg二氧化硅溶于50ul的PBS制备成二氧化硅悬浊液，小鼠吸入异氟醚麻醉后，经口咽吸入二氧化硅悬浊液。GHK-Cu干预组于每日腹腔注射相应剂量的GHK-Cu，对照组给予相应剂量的生理盐水。小鼠于第28天安乐死处死，左肺应用4%的多聚甲醛灌流固定48小时，石蜡包埋。另一些小鼠应用0.5ml的PBS进行肺泡灌洗3次，收集肺泡灌洗积液（Bronchoalveolar lavage fluid，BALF）-80℃保存。右肺于-80℃保存。

实施例2 HE染色检测肺部炎症反应及硅结节的形成情况。

一、HE染色。

苏木素（hematoxylin）和伊红（eosin）染色（简称HE染色）是细胞核组织学最广泛的染色方法。其基本原理为：细胞核内的染色质主要是DNA，DNA的双螺旋结构中，两边链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木素碱性染料以离子键或氢键结合而被染色。苏木素在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。细胞浆内主要成分是蛋白质，为两性化合物、细胞浆的染色与PH值密切相关。伊红是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷（阳离子）结合而使细胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织，嗜伊红颗粒等被感染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明的对比。

1、4μm的石蜡切片被应用，将切片置于60℃烘烤箱内，烤片2小时。

2、二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ脱蜡各15分钟，然后放入无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、95%、90%、80%、70%、50%各级乙醇溶液中各5分钟，再放入蒸馏水中5分钟。

3、苏木素染色：约3分钟。冲洗切片1-10s。

4、盐酸酒精分化：约10s。流水冲洗洗5-10分钟。

5、伊红染色：0.5%伊红染色3分钟，冲洗5-10分钟。

6、脱水：将切片依次置于50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、Ⅱ各30s。

7、透明：切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各5分钟。

8、封片：中性树胶封存，通风橱中晾干。

二、硅结节分布的情况。

镜下每个肺叶选取4-16个视野对硅结节的分布情况进行分析，按照如下方法进行分级：0：不存在；1：稀有/偶发（占肺部面积的10％）；2：稀疏/有限（占肺部面积的10-25％）；3：中度（占肺部面积的25-50％），4：广泛分布（占肺部面积的50-75％），以及5：非常广泛/显著（超过肺部面积的75％）。

苏木素-伊红（HE）染色及硅结节分布情况的检测结果如图1-2所示。

实施例3 ELISA检测BALF中炎性因子IL-6及TNFα的表达情况。

取出各试剂平衡至室温，试剂及样品配置时需充分混匀，并尽量避免出现气泡。

1、加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液10μl，余孔分别加不同比例稀释后的标准品或待测样品100μl，覆膜，37℃孵育2h。

2、弃去液体，甩干，每孔加入生物素抗体（1X）100μl，覆膜，37℃孵育1h。

3、弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2min，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。

4、每孔加入HRP-亲和素（1X）100μl，覆膜，37℃孵育1h。

5、弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。

6、每孔加入90μl底物溶液，覆膜，37℃避光孵育15-30min。

7、每孔加入50μl终止液，终止反应。

8、立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度值。

检测结果如图3所示。

实施例4 通过对氧化应激指标的分析检测GHK-Cu对硅诱导的氧化应激的影响。

新鲜获取的肺组织匀浆行生化分析。用4℃的冰盐水制备肺组织匀浆，2500rpm离心10分钟收集上清液。上清液用于检测氧化应激指标，如谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）及一氧化氮（NO）水平，衡量肺组织氧化损伤的程度。

一、检查GSH的表达水平。

1、组织匀浆的制备：准确称取组织重量，按重量（g）：体积（ml）=1:9的比例，加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下，制备成10%的匀浆液，2500转/分离心10分钟，取上清液待测。取10%组织匀浆5-10ml，以1000-2000转/分钟离心10分钟，取上清液以8000-10000转/分钟离心15分钟，沉淀物为线粒体。

2、在非酶管和酶管中分别加入0.2ml1mmol/LGSH，并在酶管内加入0.2ml待测匀浆，37℃水浴预温5分钟。

3、在非酶管和酶管内加入0.1ml试剂一应用液，37℃水浴准确反应5分钟。

4、在非酶管和酶管内加入试剂二应用液2ml，并在非酶管内加入0.2ml待测匀浆，混匀，3500-4000转/分，离心10分钟，取上清1ml做显色反应。

5、在空白管内加入GSH标准品溶剂应用液1ml，标准管加入20umol/LGSH标准液1ml，非酶管和酶管分别加入上清液1ml。

6、在空白管、标准管、非酶管和酶管内分别加入试剂三、四、五应用液各1ml、0.25ml、0.05ml。混匀，室温静置15分钟，在412nm处，测定各管OD值。

二、检测MDA的表达水平。

1、组织匀浆的制备：准确称取组织重量，按重量（g）：体积（ml）=1:9的比例，加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下，制备成10%的匀浆液，2500转/分离心10分钟，取上清液待测。同时，用BCA法测定匀浆蛋白浓度。

2、试剂一每次测试前可37℃加热加速溶解直至透明。

3、试剂二用时每瓶加340ml蒸馏水混匀，4℃冷藏。

4、试剂三用时将粉剂加蒸馏水60ml，加热到90℃-100℃充分溶解后，用蒸馏水补足至60ml，再加冰醋酸60ml，混匀，配好的试剂避光冷藏。

5、混合试剂的配制：工作液Ⅰ的配制：试剂一：试剂二：试剂三=0.1：3：1，现用现配。工作液Ⅱ的配制：试剂一：试剂二：50%冰醋酸=0.1：3：1，现用现配。

6、空白管内加入0.1ml无水乙醇，标准管内加入0.1ml10nmol/ml标准品，测定管内加入0.1ml测试样品。

7、空白管、标准管、测定管分别加入4ml工作液Ⅰ。离心管盖上盖，在盖上扎一小孔，旋涡混匀器混匀，95℃水浴40分钟，取出后流水冷却，然后3500-4000转/分，离心10分钟。取上清，532nm处测各管吸光度值。

三、检测NO的表达水平。

1、组织匀浆的制备：准确称取组织重量，按重量（g）：体积（ml）=1：9的比例，加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下，制备成10%的匀浆液，2500转/分离心10分钟，取上清液待测。同时，用BCA法测定匀浆蛋白浓度。

2、分别于空白管、标注管及测定管中加入0.1ml的双蒸水、100μmol/L的标准应用液及样本，再向各管中加入0.2ml的试剂一及0.2ml的试剂二，充分混匀后，37℃水浴60min。

3、水浴结束后，先后向各管中加入0.2ml的试剂三及0.1ml的试剂四，充分旋涡混匀30s，室温静置10min，3500-4000rpm离心10min，取上清进行显色。

4、显色：取0.5ml上清液，并向其中加入0.6ml的显色剂，室温静置10min，蒸馏水调零后，检测550nm条件下各管的吸光度值。

氧化应激指标检测结果如图4。

实施例5 马松染色及羟脯氨酸（HYP）实验检测肺组织胶原沉积及肺纤维化的严重性。

一、马松染色。

马松染色是胶原纤维染色的主要方法之一，可染细胞核和选择性的显示胶原纤维和肌纤维。马松染色原理与阴离子染料分子的大小和组织的渗透有关：分子的大小由分子量体现，小分子量易穿透结构致密、渗透性低的组织，而大分子量则只能进入结构疏松的、渗透性高的组织。然而，苯胺蓝的分子量很大，因此马松染色后肌纤维呈红色，胶原纤维呈蓝色，主要用于区分胶原纤维和肌纤维。

1、4μm切片脱蜡处理至水。

2、滴加1滴（100μl）Masson复合染色液（试剂A）染色5分钟，蒸馏水冲掉染液。

3、滴加1滴（100μl）磷钼酸（试剂C）染色5分钟，甩干。

4、直接滴加1滴（100μl）苯胺蓝（试剂D）染色5分钟蒸馏水稍冲。

5、滴加1滴（100μl）分化液（试剂B）分化30-60秒（2次）。

6、95%酒精、无水酒精脱水，透明，封固。

二、HYP实验。

羟脯氨酸在氧化剂的作用下所产生的氧化产物与二甲氨基苯甲醛作用呈现紫红色，根据其呈色的深浅可推算出其含量。

1、按照说明书要求配置好所需试剂，精确称取组织30-100mg放入试管中，加水裂解液1ml，混匀。加盖后95℃或者沸水浴水解20min（水解10min时混匀一次，以使水解充分）。

2、调PH值至6.0-6.8左右：将各试管液水冷却后各管加指示剂10μl，摇匀；各试管加入调PH甲夜1ml，混匀；用200μl的加样枪吸取调PH的乙液向各管内逐滴小心加入调PH的乙液，每滴加入后均需混匀，直至液体中指示剂的颜色变成黄绿色。此时PH在6.0-6.8左右。

3、然后加双蒸水至10ml，混匀。

4、取3-4ml稀释的水解液加适量活性炭（约20-30mg左右，以上清液离心后澄清无色为准），混匀，3500rpm离心10min，小心取上清1ml做检测。

5、分别于空白管、标准管及测定管中分别加入1ml的双蒸水、5μg/ml标准应用液及检测液，后加入0.5ml试剂一，充分混匀后，静置10min。

6、向各管中加入0.5ml试剂二，充分混匀，静置5min。

7、向各管中加入0.5ml试剂三，充分混匀，60℃水浴15min，冷却后，3500rpm离心10min，取上清于550nm，1cm光径条件下，双蒸水调零，测定各管的吸光度值。

三、肺纤维化的严重性评估。

由3个病理学专家独立盲法对肺组织的肺纤维化严重性进行评估，每个肺叶选取4-16个视野。纤维化指数=纤维化严重性分数（0-4）×受影响的面积%（0-100%）/100。

检测结果如图5-9所示。

实施例6 免疫组化的方法检测GHK-Cu对硅诱导的EMT现象的影响。

免疫组化染色是用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究。免疫组化的原理为：根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）等的抗生素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在化学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。

1、石蜡切片（4μm）脱蜡、水化，自来水冲洗。

2、根据一抗的要求对组织进行相应的抗原修复，PBS冲洗3次，每次3min。

3、除去PBS，切片上滴加过氧化物酶阻断试剂，室温下孵育10min，PBS冲洗3次，每次3min。

4、除去PBS，切片上滴加正常非免疫动物血清，室温上孵育10分钟。

5、除去血清，切片上滴加第一抗体，室温下孵育60min或4℃过夜，PBS冲洗3次，每次3min。

6、除去PBS，切片上滴加生物素标记的第二抗体，室温下孵育10min，PBS冲洗3次，每次3min。

7、除去PBS，切片上滴加链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶试剂，室温下孵育10min，PBS冲洗3次，每次3min。

8、除去PBS，切片上滴加新鲜配制的DAB显色试剂显色。

9、自来水冲洗终止显色，苏木素复染，1%盐酸酒精分化，流水返蓝，切片梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

检测结果如图10所示。