一种金线兰同属植物种子非共生萌发培养基及繁育方法

技术领域

本发明属于植物种苗培养技术领域，具体涉及一种金线兰同属植物种子非共生萌发培养基及繁育方法。

背景技术

金线兰同属植物Anoectochilus spp. (又名金线莲)为兰科 Orchidaceae 开唇兰属Anoectochilus多年生草本植物，主要分布于中国、日本、斯里兰卡、印度和尼泊尔等国，在中国主要分布于云南、福建、浙江、广东、广西、江西等亚热带及热带区域，全球有40余种, 我国有20个种及2个变种。金线兰是我国民间珍稀名贵中草药，有“药王”、“金草”之称，全草皆可入药，其味甘，性平微寒，有清热解毒、凉血平胆等功效，在我国具有非常长的传统用药历史。金线兰富含有多糖、微量元素、强心苷类、氨基酸、有机酸、甾体化合物、黄酮类化合物、生物碱等多种活性成分，广泛用于治疗肝炎、肾炎、肺炎、小儿惊风高热、糖尿病、抗肿瘤、风湿病等。开唇兰属下的多种金线兰都已被用作基原植物用于金线兰的产品中，以金线兰为主要原料的中成药，如复方金线莲胶囊、金线莲喷雾剂等，已在临床上用于相关疾病的治疗。

金线兰同属植物株型小巧，叶型优美，叶脉金黄色或银色，呈网状排列，是观赏价值极高的室内观叶珍品。金线兰具有较高的药用和观赏价值，人为长期无序过度采挖，导致金线兰野生资源濒临枯竭，加之金线兰自然繁殖率低，对生态环境要求严格，适应性较差，使得这一物种近乎灭绝。野生资源需要保护，市场对金线兰的需求居高不下，只有人工繁育大量的金线兰种苗才能满足利用从而减少对野生资源的需求。

兰科植物人工种苗繁育常采用的方法为分株繁殖、组织培养、种子非共生繁殖，分株繁殖技术对不产生侧芽的金线兰不适用，组织培养为金线兰最常用且报道最多的繁殖方法但受限于植物组织的采集数量，且不同品种不同组织所用培养基不同，在工厂大规模培养过程中，不利于工厂规模化多品种培养，在多品种同时培养的情况下，增加了采购成本以及多个培养基配制的复杂程序和人工成本。目前已有文献和专利报道了金线兰（Anoectochilus roxburghii）、台湾银线兰（Anoectochilus formosanus）、滇越金线兰（Anoectochilus chapaensis）、灰岩金线兰（Anoectochilus caLcareus Aver）、峨眉金线兰（Anoectochilus emeiensis）、兴仁金线兰（Anoectochilus xingrenensis）等的繁殖方法，都分别尝试不同的培养基（MS、1/2MS、1/4MS、H1、H2、H3、N6、KC等）进行繁殖，萌发效果和萌发率参差不齐，且换一种金线兰或者不同组织部位就得用不同的培养基和繁育方法进行繁殖。通过探索种子非共生萌发技术，针对主要栽培的金线兰同属植物，筛选适合不同种金线兰种子非共生萌发的通用培养基配方及繁育方法，降低成本，节约时间，有望在短期内获得大量能满足市场需求的各种金线兰种苗，真正达到以利用促保护，为金线兰的开发利用和保育提供一种高效的方式。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种适宜工厂规模化多品种金线兰种子萌发培养基及繁育方法，采用种子非共生萌发技术，筛选适合不同金线兰种子非共生萌发的通用培养基配方及繁育方法，降低成本，节约时间，有望在短期内获得大量能满足市场需求的各种金线兰种苗，真正达到以利用促保护，为金线兰的开发利用和保育提供一种高效的方式。

为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：

一种金线兰同属植物种子非共生萌发培养基，所述培养基为改良B5培养基包括：113.24 mg L

所述金线兰同属植物包括: 高金线兰（AnoectochiLus elatus）、灰岩金线兰（AnoectochiLus calcareus Aver）、麻栗坡金线兰（Anoectochilus malipoensis）、金线兰（AnoectochiLus roxburghii）、滇越金线兰（Anoectochilus chapaensis）、锡金金线兰（Anoectochilus brevilabris）、兴仁金线兰（Anoectochilus xingrenensis）、滇南金线兰（Anoectochilus burmannicus）。

进一步的，本发明提供一种金线兰同属植物种子非共生萌发培养方法，包括以下步骤：

（1）果荚获取：采摘人工异花授粉后90-110 d成熟未裂开的果荚；

（2）果荚无菌处理、横切获取种子；

（3）原球茎获得：采用改良B5培养基，并于改良B5培养基中播撒金线兰同属植物种子，获得种子萌发后的原球茎；

（4）原球茎继代培养：继代培养基为改良B5培养基中添加0.2-0.5 g L

（5）增殖培养：将将继代培养长到6-7 cm高，具有2-3个节的苗体取出在无菌条件下保留茎节切成2-3段，平放到增殖培养基中进行增殖培养；增殖培养基为改良B5培养基中添加0.2-0.5 g L

（6）壮苗和生根培养：将经过增殖和继代培养长到7-8 cm高的金线兰幼苗转接到壮苗和生根培养基中进行生根和壮苗培养，壮苗培养基为改良B5培养基中添加1.0-2.0 gL

（7）炼苗移栽：壮苗和生根培养30-60天后，当有2-3条根，根长7-8 cm，苗高10-12cm时即可炼苗进行移栽。

优选的，步骤（3）培养条件为：25 ±2 ℃光照培养8 h/d，光照度为800-1000 Lx或者暗培养。

优选的，步骤（4）培养条件为：光照12 h/d，光照度为1200-1500 Lx，培养温度为25±2℃。

优选的，步骤（5）培养条件为：光照8 h/d，光照度为1000-1200 Lx，培养温度为25±2℃。

优选的，步骤（6）培养条件为：光照14 h/d，光照度为1500-2000 Lx，培养温度为25±2℃。

本发明达到的技术效果:

与现有文献对照培养基相比，采用研究中的培养基配方及繁育方法能让各种金线兰种子萌发成苗，并且萌发时间提前10多天，萌发率远远高于现有培养基，研究中还加入了茎节增殖诱导培养，能大量获得金线兰种苗，缓解对金线兰野生资源的需求，确实做到以利用促进该物种的保护。

附图说明

图1 金线兰同属植物果荚显示图（A：高金线兰；B：麻栗坡金线兰；C：灰岩金线兰；D：金线兰）；

图2 麻栗坡金线兰果荚无菌处理显示图；

图3 麻栗坡金线兰种子非共生萌发效果图（从左到右分别为麻栗坡金线兰种子在改良B5培养基、1/4 MS和H1培养基中萌发情况）；

图4 麻栗坡金线兰原球茎在改良B5培养基中分化出叶显示图；

图5 高金线兰继代培养效果显示图；

图6 高金线兰增殖培养效果显示图；

图7 灰岩金线兰壮苗和生根培养效果显示图；

图8 灰岩金线兰出瓶种植显示图。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道，所用化学试剂均为分析纯。

实施例一 麻栗坡金线兰种子非共生萌发培养

麻栗坡金线兰Anoectochilus malipoensis，陆生草本，高约15厘米，生于石灰岩山地常绿阔叶林下，海拔1600-1700米，国内产于云南省麻栗坡县，花期7-8月。

（1）麻栗坡金线兰果荚的获得

在7月盛花期采用人工异花授粉技术对麻栗坡金线兰进行授粉，记录授粉时间，观察果荚变化，当果荚成熟变红未裂开时进行采摘（97 d），用牛皮纸袋装着放入4℃冰箱尽快播种。

（2）麻栗坡金线兰果荚无菌处理

将麻栗坡金线兰果荚清洗干净，用75%的酒精消毒30 s，后放入10%次氯酸钠溶液浸泡消毒8分钟，后用无菌水冲洗干净，吸干表面水分，在培养皿中将果荚横切为两半备用。

（3）非共生萌发培养基配方

非共生萌发培养基（改良B5培养基）：113.24 mg L

对照萌发培养基：1/4MS（含10000 mg L

（4）麻栗坡金线兰种子非共生萌发培养方法

将消毒好的麻栗坡金线兰种子播种于非共生萌发培养基（改良B5培养基）及对照萌发培养基中，每瓶约50粒种子，每种培养基播撒5瓶，置于25 ±2 ℃下光照（培养8 h/d，光照度为800-1000 Lx）培养，记录种子萌发时间及萌发率。种子膨胀胚突破种皮确认为种子萌发，萌发率以萌发种子数除以种子总数并乘以100。麻栗坡金线兰在改良B5培养基中培养30天开始萌发，萌发率为95%，在对照1/4 MS和H1培养基中均没有萌发（表1、表2）。

（5）麻栗坡金线兰继代培养

在改良B5培养基中添加0.5 g L

（6）麻栗坡金线兰增殖培养

将继代培养长到6-7 cm高，具有2-3个节的麻栗坡金线兰取出在无菌条件下保留茎节切成2-3段，平放到增殖培养基中进行增殖培养。增殖培养基为改良B5培养基中添加0.5 g L

（7）麻栗坡金线兰壮苗和生根培养

将经过增殖和继代培养长到7-8 cm高的麻栗坡金线兰幼苗转接到壮苗和生根培养基中进行生根和壮苗培养，壮苗培养基为改良B5培养基中添加2.0 g L

实施例二 灰岩金线兰种子非共生萌发培养

灰岩金线兰AnoectochiLus caLcareus Aver，生于常绿阔叶林下，国内产于云南省麻栗坡县、广西大新县、那坡县，花期7-8月。

（1）灰岩金线兰果荚的获得

在7月盛花期采用人工异花授粉技术对灰岩金线兰进行授粉，记录授粉时间，观察果荚变化，当果荚成熟变紫红未裂开时进行采摘（105 d），用牛皮纸袋装着放入4℃冰箱尽快播种。

（2）灰岩金线兰果荚无菌处理

将灰岩金线兰果荚清洗干净，用75%的酒精消毒30 s，后放入10%次氯酸钠溶液浸泡消毒8分钟，后用无菌水冲洗干净，吸干表面水分，在培养皿中将果荚横切为两半备用。

（3）非共生萌发培养基配方

非共生萌发培养基（改良B5培养基）：113.24 mg L

对照萌发培养基：1/4MS（含10000 mg L

（4）灰岩金线兰种子非共生萌发培养方法

将消毒好的灰岩金线兰种子播种于非共生萌发培养基（改良B5培养基）及对照萌发培养基中，每瓶约50粒种子，每种培养基播撒5瓶，置于全黑暗下培养，记录种子萌发时间及萌发率。种子膨胀胚突破种皮确认为种子萌发，萌发率以萌发种子数除以种子总数并乘以100。灰岩金线兰在改良B5培养基、1/4 MS和H1培养基中均能萌发，萌发时间分别为31 d、47 d、56 d，萌发率分别为93%、69%、59%，从萌发时间和萌发率来看，灰岩金线兰在改良B5培养基中的萌发效果均优于对照萌发培养基（表1、表2）。

（5）灰岩金线兰继代培养

以改良B5培养基中添加0.5 g L

（6）灰岩金线兰增殖培养

将继代培养长到6-7 cm高，具有2-3个节的灰岩金线兰取出在无菌条件下保留茎节切成2-3段，放到增殖培养基中进行增殖培养。增殖培养基为改良B5培养基中添加0.5 gL

（7）灰岩金线兰壮苗和生根培养

将经过增殖和继代培养长到7-8 cm高的灰岩金线兰幼苗转接到壮苗和生根培养基中进行生根和壮苗培养，壮苗培养基为改良B5培养基中添加1.0 g L

实施例三 高金线兰种子非共生萌发培养

高金线兰AnoectochiLus eLatus，生于常绿阔叶林中，国内产于云南省西双版纳傣族自治州景洪市大渡岗乡大干坝村，花期11月至翌年1月。

（1）高金线兰果荚的获得

在11月盛花期采用人工异花授粉技术对高金线兰进行授粉，记录授粉时间，观察果荚变化，当果荚成熟变红未裂开时进行采摘（100 d），用牛皮纸袋装着放入4℃冰箱尽快播种。

（2）高金线兰果荚无菌处理

将高金线兰果荚清洗干净，用75%的酒精消毒30 s，后放入10%次氯酸钠溶液浸泡消毒8分钟，后用无菌水冲洗干净，吸干表面水分，在培养皿中将果荚横切为两半备用。

（3）非共生萌发培养基配方

非共生萌发培养基（改良B5培养基）：113.24 mg L

对照萌发培养基：1/4MS（含10000 mg L

（4）高金线兰种子非共生萌发培养方法

将消毒好的高金线兰种子播种于非共生萌发培养基（改良B5培养基）及对照萌发培养基中，每瓶约50粒种子，每种培养基播撒5瓶，置于全黑暗下培养，记录种子萌发时间及萌发率。种子膨胀胚突破种皮确认为种子萌发，萌发率以萌发种子数除以种子总数并乘以100。高金线兰在改良B5培养基中培养33天开始萌发，萌发率为86%，在对照1/4 MS和H1培养基中均没有萌发（表1、表2）。

（5）高金线兰继代培养

以改良B5培养基中添加0.3 g L

（6）高金线兰增殖培养

将继代培养长到6-7 cm高，具有2-3个节的高金线兰取出在无菌条件下保留茎节切成2-3段，平放到增殖培养基中进行增殖培养。增殖培养基为改良B5培养基中添加0.3 gL

（7）高金线兰壮苗和生根培养

将经过增殖和继代培养长到7-8 cm高的高金线兰幼苗转接到壮苗和生根培养基中进行生根和壮苗培养，壮苗培养基为改良B5培养基中添加2.0 g L

实施例四金线兰种子非共生萌发培养

金线兰AnoectochiLus roxburghii，生于常绿阔叶林下或沟谷阴湿处，国内产于浙江、江西、福建、湖南、广东、海南、广西、四川、云南、西藏东南部（墨脱），海拔50-1600米，花期8-11月。

（1）金线兰果荚的获得

在8月盛花期采用人工异花授粉技术对金线兰进行授粉，记录授粉时间，观察果荚变化，当果荚成熟变黄或者红未裂开时进行采摘（92 d），用牛皮纸袋装着放入4 ℃冰箱尽快播种。

（2）金线兰果荚无菌处理

将金线兰果荚清洗干净，用75%的酒精消毒30 s，后放入10%次氯酸钠溶液浸泡消毒8分钟，后用无菌水冲洗干净，吸干表面水分，在培养皿中将果荚横切为两半备用。

（3）非共生萌发培养基配方

非共生萌发培养基（改良B5培养基）：113.24 mg L

对照萌发培养基：1/4MS（含10000 mg L

（4）金线兰种子非共生萌发培养方法

将消毒好的金线兰种子播种于非共生萌发培养基（改良B5培养基）及对照萌发培养基中，每瓶约50粒种子，每种培养基播撒5瓶，置于25 ±2 °C下光照（培养8 h/d，光照度为800-1000 Lx）培养，记录种子萌发时间及萌发率。种子膨胀胚突破种皮确认为种子萌发，萌发率以萌发种子数除以种子总数并乘以100。金线兰在改良B5培养基、1/4 MS和H1中均能萌发，萌发时间分别为29d、43d、53d，萌发率分别为96%、76%、68%，从萌发时间和萌发率来看，金线兰在改良B5培养基中的萌发效果均优于对照萌发培养基（表1、表2）。

（5）金线兰继代培养

继代培养基为改良B5培养基中添加0.2 g L

（6）金线兰增殖培养将继代培养长到6-7cm高，具有2-3个节的金线兰取出在无菌条件下保留茎节切成2-3段，平放到增殖培养基中进行增殖培养。增殖培养基为改良B5培养基中添加0.2 g L

（7）金线兰壮苗和生根培养

将经过增殖和继代培养长到7-8 cm高的金线兰幼苗转接到壮苗和生根培养基中进行生根和壮苗培养，壮苗培养基为改良B5培养基中添加1.5 g L

在该萌发培养基和繁育方法下，金线兰同属植物种子均能萌发成苗出瓶种植，该培养基可作为金线兰种苗繁育研究的通用培养基适用于工厂化大规模金线兰同属植物快速繁殖。

表1 金线兰同属植物种子在不同培养基中萌发时间

表2 金线兰同属植物种子在不同培养基中萌发率

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。