埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白及其编码基因和制备方法

技术领域

本发明涉及肝素酶融合蛋白制备技术领域，具体涉及埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白及其编码基因和制备方法。

背景技术

肝素酶(heparinase)是一类作用于肝素或者乙酰肝素分子的多糖裂解酶，分别为肝素酶I、II、III。肝素酶主要从一些利用肝素为碳源的细菌中分离得到，最初来源于肝素黄杆菌(Flavobacteriumheparinum)，此外，在许多微生物中也发现了肝素酶的存在，但至今肝素黄杆菌仍然是商品肝素酶的唯一来源。

自上世纪九十年代开始，已有大量的肝素酶I的基因工程表达研究和实践，其中以大肠杆菌为宿主的异源表达研究和应用最多。但是，在大肠杆菌中的表达肝素酶I，容易聚集成不溶性包涵体，形成包涵体肝素酶I很难再复性。此外，许多融合表达策略已被用于改善肝素酶I的生产。但是，针对肝素酶I的融合蛋白的研究，都是以肝素黄杆菌来源的肝素酶I为研究对象，并且表达的肝素酶I的活性和产量都难以达到工业化水平。因此寻找和建立表达效率高、酶活性高的肝素酶重组表达技术、以及寻找新型的可以商业化的肝素酶I，具有重要的理论和现实意义。

发明内容

本发明意在提供埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白，以解决使用生物工程技术获得的肝素酶的酶活性有限的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白，包括肝素酶I和麦芽糖结合蛋白，肝素酶I和麦芽糖结合蛋白之间连接有连接肽，所述连接肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.11或者SEQ ID NO.12所示。

本方案的原理及优点是：肝素酶I大多以肝素黄杆菌来源的肝素酶I为研究对象，本方案以埃氏拟杆菌来源的肝素酶I为研究对象，拓宽了酶的来源。发明人从埃氏拟杆菌中克隆获得肝素酶I基因，并对其性质和表达条件进行了大量研究。与普通的肝素酶I基因不同，在使用埃氏拟杆菌来源的肝素酶I基因进行生物工程菌表达的时候，发明人发现表达的肝素酶I的活性有限，于是尝试了使用融合蛋白的方式来提升目的蛋白的活性。并通过大量研究和筛选发现，在制备肝素酶I和麦芽糖结合蛋白形成的融合蛋白时，需要在两个蛋白之间连接上核苷酸序列如SEQ ID NO.11或者SEQ ID NO.12所示的连接肽。由于上述两种连接肽的加入，保证由工程菌表达的融合蛋白可以正确折叠，并保证理想的酶活性。如果在肝素酶I和麦芽糖结合蛋白之间不加入连接肽，获得的融合蛋白的活性显著低于含有连接肽的融合蛋白的活性。如果将本方案的连接肽更换为其他种类的连接肽，获得的融合蛋白的活性也不及本方案制备获得的融合蛋白。由此可见，连接肽的选择对于本方案至关重要，使用核苷酸序列如SEQ ID NO.11或者SEQ ID NO.12所示的连接肽可以较为显著地增加融合蛋白的目的活性，减少包涵体肝素酶I的产生量，进而拓宽肝素酶I的来源，进而可以克服现有的肝素酶I的活性和产量都难以达到工业化水平的技术问题，具有重要的理论和现实意义。

进一步，埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.13或者SEQ IDNO.14所示。由肝素酶I、连接肽和麦芽糖结合蛋白融合形成的蛋白质序列为SEQ ID NO.13或者SEQ ID NO.14。上述蛋白具有较高的原核表达量和活性，适应于工业化应用和大规模生产。

进一步，埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9或者SEQ ID NO.10所示。由肝素酶I基因、连接肽核苷酸序列和麦芽糖结合蛋白基因融合形成的基因序列为SEQ ID NO.9或者SEQ ID NO.10。上述基因可以在原核表达系统中大量表达，形成活性高并适合于工业化应用的融合蛋白。

进一步，埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白的基因整合在载体pMAL-c2x的多克隆位点上，形成表达载体。载体pMAL-c2x自带麦芽糖结合蛋白标签，为常用的商业化载体，易于获取和操作。

进一步，埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白的制备方法，包括如下依次进行的步骤：

S1表达载体的构建：

S2工程菌的制备：将表达载体转化进入大肠杆菌中，获得工程菌；所述大肠杆菌的菌种为TB1、BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS和BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL中的一种；

S3融合蛋白的表达：发酵并诱导所述工程菌，获得酶菌体；所述酶菌体中表达有埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白。

通过转基因感受态细胞，获得工程菌，并诱导工程菌表达目的蛋白，可实现埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白的大量表达。

进一步，还包括S4融合蛋白的纯化：将所述酶菌体破碎后，离心取上清，获得粗酶；通过亲和柱层析获得纯化后的融合蛋白。通过细胞破碎和后续的纯化步骤，可以获得纯度较高的目的蛋白，高纯度的蛋白将用于后续的制药以及制备检测试剂的应用。

进一步，在S1表达载体的构建步骤中，包括以下步骤：

使用序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物P1和序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物P2，并以SEQ ID NO.2所示的麦芽糖结合蛋白基因为模板，克隆获得MBP-F；

使用序列如SEQ ID NO.6所示的上游引物P4和序列如SEQ ID NO.7所示的下游引物P5，并以SEQ ID NO.1所示的氏拟杆菌肝素酶I基因为模板，克隆获得F-HEP；

将MBP-F、F-HEP和酶切处理后的载体pMAL-c2x三片段连接，获得表达载体。

进一步，在S1表达载体的构建步骤中，包括以下步骤：

使用序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物P1和序列如SEQ ID NO.5所示的下游引物P3，并以SEQ ID NO.2所示的麦芽糖结合蛋白基因为模板，克隆获得MBP-R；

使用序列如SEQ ID NO.8所示的上游引物P6和序列如SEQ ID NO.7所示的下游引物P5，并以SEQ ID NO.1所示的氏拟杆菌肝素酶I基因为模板，克隆获得R-HEP；

将MBP-R、R-HEP和酶切处理后的载体pMAL-c2x三片段连接，获得表达载体。

使用上述引物，通过多步PCR反映以及后续的片段连接过程，可以获得目的基因，并将目的基因连接到空载体中，获得表达载体。

进一步，在S2工程菌的制备中，将表达载体转化进入大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL中，获得工程菌。两种融合蛋白MBP-F-HEP与MBP-R-HEP分别在E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL都具有最高酶活，因此最优宿主菌为E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL。经过第二次筛选实验也验证了E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL是最佳宿主，可以应用于后续的工业化生产。

进一步，在S3融合蛋白的表达中，使用LB培养基30-37℃培养所述工程菌12-16h；然后使用M9YE培养基30-37℃培养工程菌至OD

附图说明

图1为本发明实施例1的带柔性连接肽的MBP的PCR扩增结果。

图2为本发明实施例1的带刚性连接肽的MBP的PCR扩增结果。

图3为本发明实施例1的带柔性连接肽的HEP的PCR扩增结果。

图4为本发明实施例1的带刚性连接肽的HEP的PCR扩增结果。

图5为本发明实施例1的MBP-F-HEP的PCR验证结果。

图6为本发明实施例1的MBP-R-HEP的PCR验证结果。

图7为本发明实施例2的融合蛋白酶活测定结果。

图8为本发明实施例2的MBP-F-HEP融合蛋白的蛋白电泳检测结果。

图9为本发明实施例2的MBP-R-HEP融合蛋白的蛋白电泳检测结果。

图10为本发明实施例3的最优工程菌第二次筛选结果。

图11为本发明实施例4的IPTG添加量的筛选结果。

图12为本发明对比例的连接肽作用研究结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法，并可按照已描述的重组技术(参见分子克隆实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)完成；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

实施例1：表达载体的构建

采用

1.引物设计

(1)MBP引物对

根据MBP标签序列设计引物对，并在引物序列中添加柔性(Flexibility)或者刚性(Rigidity)连接肽的一部分。其上游引物与pMal-c2x相邻的地方要有重叠的同源序列，下游引物与相邻的埃氏拟杆菌肝素酶I序列要有重叠的同源序列，MBP引物对序列如下：

MBP-F(含有柔性连接肽的MBP引物对)：

上游引物P1：

(带边框碱基为Nde I的酶切位点，SEQ ID NO.3)

下游引物P2：

5’-

MBP-R(含有刚性连接肽的MBP引物对)：

上游引物P1：

下游引物P3：

5’-

(2)埃氏拟杆菌肝素酶I引物对

根据埃氏拟杆菌肝素酶I序列设计引物对，并在引物序列中添加柔性(Flexibility)或者刚性(Rigidity)连接肽的一部分。其下游引物与pMal-c2x相邻的地方要有重叠的同源序列，埃氏拟杆菌肝素酶I引物对序列如下：

F-HEP(含有柔性连接肽的HEP引物对)：

上游引物P4：

5’-

下游引物P5：

(带下划线的部分为与pMal载体同源的部分，带边框碱基为添加的终止密码子，SEQ ID NO.7)

R-HEP(含有刚性连接肽的HEP引物对)：

上游引物P6：

5’-

下游引物P5：

(带下划线的部分为与pMal载体同源的部分，带边框碱基为添加的终止密码子，SEQ ID NO.7)

2.MBP和HEP的PCR扩增

PCR反应体系：采用NEB的Q5TM High-Fidelity DNA Polymerase，按照说明书要求配制反应体系，使用“1.引物设计”中的引物分别对MBP和HEP进行体外扩增。扩增程序：98℃预变性30s，98℃变性10s，55-70℃引物退火30s，72℃延伸90s，34个循环后，72℃终延伸5min结束反应。

PCR结果如图1-4所示(图1-4的底部数字表示采用的退火温度，单位℃)，表明扩增得到了带刚柔性连接肽的MBP序列与肝素酶序列，测序比对表明分子克隆正确。图1为带柔性连接肽的MBP序列(MBP-F)，最优退火温度是55℃；图2为带刚性连接肽的MBP序列(MBP-R)，最优退火温度是67℃；图3为带柔性连接肽的肝素酶序列(F-HEP)，最优退火温度是68.9-60.7℃；图4为带刚性连接肽的肝素酶序列(R-HEP)，最优退火温度是55℃。

3.构建含有目的片段的克隆载体

pMal-c2x空载体(含有Factor Xa和MBP，Factor Xa和MBP之间存在连接序列)用EcoR I与Hind III进行双酶切，后用

MBP-F-HEP片段和MBP-R-HEP片段均连接在pMal-c2x上，获得两种表达载体，分别为表达MBP-F-HEP融合蛋白的表达载体和表达MBP-R-HEP融合蛋白的表达载体。

4.基因转化以及阳性克隆筛选

将“3.构建含有目的片段的克隆载体”中获得的两种连接产物以现有技术的常规方法分别转化进大肠杆菌DH5α感受态细胞中。涂布至含100μg/mL氨苄青霉素的LB抗性平板上进行筛选，37℃培养16h(可选范围：12-20h)。MBP-F-HEP挑选菌落并以此为模板，用引物P1和P5进行菌落PCR鉴定，使用2×Easy Taq SuperMix进行菌落PCR，PCR反应体系及反应条件根据说明书设置。MBP-R-HEP挑菌落提取质粒进行用EcoR I与Hind III酶切验证。反应结束后，对产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。MBP-F-HEP结果如图5，1-5泳道分别为菌落PCR扩增结果，1、2、4、5泳道阳性，3泳道为阴性，M泳道为Marker；MBP-R-HEP结果如图6，用到1-4泳道分别为酶切验证结果，2、4泳道阳性，1、3泳道为阴性，M泳道为Marker。将筛选得到的阳性克隆菌交由生工生物进行测序。其中MBP-F-HEP的2号菌，MBP-R-HEP的4号菌测序比对结果正确。重组载体命名为MBP-F-HEP表达载体与MBP-R-HEP表达载体。MBP-F-HEP片段和MBP-R-HEP片段均连接在pMal-c2x上，获得两种表达载体，分别为表达MBP-F-HEP融合蛋白的表达载体(MBP-F-HEP表达载体)和表达MBP-R-HEP融合蛋白的表达载体(MBP-R-HEP表达载体)。

实施例2：埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白的表达和纯化

1.融合蛋白的表达

提取大肠杆菌DH5α中的MBP-F-HEP表达载体和MBP-R-HEP表达载体，按照常规化转方法分别转化大肠杆菌TB1、BL21、BL21(DE3)(简称DE3)、BL21(DE3)pLysS(简称pLysS)、BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL(简称RIPL)(厂家均为：唯地生物，货号分别是：EC1030/EC1001/EC1002/EC1003/EC1007)，通过氨苄青霉素筛选，得到TB1/MBP-F-HEP、BL21/MBP-F-HEP、DE3/MBP-F-HEP、pLysS/MBP-F-HEP、RIPL/MBP-F-HEP与TB1/MBP-R-HEP、BL21/MBP-R-HEP、DE3/MBP-R-HEP、pLysS/MBP-R-HEP、RIPL/MBP-R-HEP作为表达MBP-F-HEP与MBP-R-HEP的工程菌。

按照以下操作对上面的工程菌进行平行表达：将工程菌分别在含100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB培养基37℃(可选范围：30-37℃)培养16h(可选范围：12-16h)。然后按照1％接种量接入M9YE培养基(Yeast Extract 12.5g/L，Na

工程菌都表达除了有活性的可溶性埃氏拟杆菌肝素酶I蛋白，酶活检测结果如图7所示。可以发现MBP-F-HEP与MBP-R-HEP分别在E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL都具有最高酶活，因此最优宿主菌为E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL。

2.融合蛋白纯化

对最优宿主菌E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL表达的MBP-F-HEP与MBP-R-HEP蛋白分别进行纯化。因MBP-F-HEP与MBP-R-HEP均带MBP标签，能够与麦芽糖Dextrin Beads进行吸附实现纯化效果。按照以下步骤分别操作。

将Dextrin Beads装入空层析柱，Tris缓冲液(Tris-HCL 20mM，NaCl 500mM，pH7.4)为柱平衡液，用5倍填料体积的柱平衡液平衡填料，将粗酶倒入填料里，4℃旋转混匀1h，用柱平衡液重力流穿清洗填料2倍填料体积，后用清洗Tris缓冲液(Tris-HCL 20mM，NaCl150mM，pH7.4)清洗至无杂蛋白流出。用洗脱Tris缓冲液(Tris-HCL 20mM，NaCl 150mM，麦芽糖10mM，pH7.4)洗脱目标蛋白，即得纯酶。将粗酶与纯酶分别进行蛋白电泳，MBP-F-HEP融合蛋白如图8所示，M泳道为Marker(由上至下分子量依次均为130kDa、100kDa、70kDa、50kDa、35kDa、25kDa)，1-3泳道分别为菌体破碎液、菌体破碎上清(粗酶)、纯酶，箭头所指处为融合蛋白MBP-F-HEP(88kDa，SEQ ID NO.13)；MBP-R-HEP融合蛋白(SEQ ID NO.14)如图9所示，M泳道为Marker(由上至下分子量依次均为130kDa、100kDa、70kDa、50kDa、35kDa、25kDa)，1-3泳道分别为菌体破碎上清(粗酶)、菌体破碎液、纯酶，箭头所指处为融合蛋白MBP-R-HEP(89kDa)。

实施例3：最优工程菌第二次筛选

经过第一轮筛选后MBP-F-HEP与MBP-R-HEP分别筛选出表现较为优秀的TB1/MBP-F-HEP、RIPL/MBP-F-HEP、TB1/MBP-R-HEP、RIPL/MBP-R-HEP，按照第一轮相同的条件进行发酵表达。结果如图10所示，经过第二轮筛选后MBP-F-HEP与MBP-R-HEP的宿主菌种发酵酶活最高的仍然是RIPL/MBP-F-HEP和RIPL/MBP-R-HEP，进一步验证了我们的结论。

实施例4：IPTG添加量的筛选

按照相同的发酵表达方法，以RIPL/MBP-F-HEP菌株为例，选择添加不同终浓度的IPTG，分别为0.04mM、0.08mM、0.12mM、0.16mM、0.20mM。实验结果如图11所示，可以看出IPTG终浓度为0.2mM发酵酶活与酶液酶活最高。

对比例

为了研究连接肽的加入对于目的蛋白表达的作用，本对比例构建了不含有连接肽的融合基因即将MBP-R-HEP(SEQ ID NO.10)或者MBP-F-HEP(SEQ ID NO.9)中的连接肽序列(SEQ ID NO.12或者SEQ ID NO.11)去掉，获得MBP-HEP基因。按照实施例1和实施例2的方法，构建表达载体和进行蛋白表达，以上过程均为分子克隆的常规技术手段，在此不做赘述。按照常规化转方法转化进大肠杆菌TB1、BL21、BL21(DE3)(简称DE3)、BL21(DE3)pLysS(简称pLysS)、BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL(简称RIPL)中，通过氨苄青霉素筛选，得到TB1/MBP-HEP、BL21/MBP-HEP、DE3/MBP-HEP、pLysS/MBP-HEP、RIPL/MBP-HEP作为表达MBP-HEP的工程菌。发酵表达条件得到粗酶，并进行酶活检测，测试结果参见图12(表达MBP-HEP融合蛋白的工程菌为图12右侧5种工程菌，图12左侧10种同图6)。由图12可知MBP-HEP转入各工程菌后，酶活产量均比不上替换连接肽后的MBP-F-HEP与MBP-R-HEP。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。