Ang1-7作为生物标志物在预测、诊断儿童脓毒症中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及Ang1-7作为生物标志物在预测、诊断儿童脓毒症中的应用。

背景技术

脓毒症是一种高发病率及病死率的感染性疾病，是导致儿童死亡的主要原因之一。脓毒症的病理特征是过度炎症及免疫抑制，宿主对感染的反应失调引起的多脏器衰竭是脓毒症致死的主要原因。全球范围内每年大约有120万儿童被诊断为脓毒症。儿童脓毒症病情进展快，短期病死率高，大多数死亡发生于入院3～7天内。据统计，2010年在760万低于5岁的死亡儿童中，有64％死于重症感染导致的脓毒症或脓毒性休克。脓毒症常累积全身多脏器，其中肺损伤是最为常见的一类并发症，并且极容易进展为呼吸窘迫综合征(AcuteRespiratory Distress Syndrome，ARDS)，病死率高，预后极差。

免疫失调在脓毒症的发生发展过程中起着关键性的作用。免疫抑制及免疫麻痹导致脓毒症抗感染无效，并使脓毒症患者更容易合并继发感染及潜伏感染再激活。儿童人群具有特殊性，其机体各项脏器及功能指标均处于不断发育完善中，包括在脓毒症中发挥决定性作用的免疫系统。有研究报道，从胎儿发育、新生儿期再到儿童期、青春期，免疫系统不断成熟，不同年龄段的儿童其先天性免疫及适应性免疫的细胞亚群分布及比例均与成人存在较大差异。因此，成人脓毒症的研究结果及生物标志物可能不一定适用于儿童脓毒症患者中。

肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)是机体重要的稳态系统，在维持体液平衡，调节血压及心血管功能方面发挥着关键作用。近年来关于RAS在感染性疾病中的作用逐渐被人们揭示。作为机体重要的稳态轴，RAS可通过下游的多条反应途径发挥其作用。血管紧张素1-7(Ang1-7)是一种促分解介质的七肽，可作用于其下游Mas受体(MasR)以发挥抑炎作用。然而，目前关于Ang1-7与感染性疾病的临床研究大多聚焦在成人领域，关于Ang1-7在儿童脓毒症感染中的变化特点及规律目前尚不清楚，且目前关于Ang1-7与儿童脓毒症的相关临床研究报道较少。因为缺乏针对儿童脓毒症早期预警特异性标志物，脓毒症至今无法制定统一的诊断治疗指南，也影响了标准化科学研究，因而发现儿童脓毒症早期预警特异性标志物，是未来准确追踪及显示病情的发展变化，评估预后，制定个体化的治疗方案关键。

发明内容

本发明的目的是提供Ang1-7作为生物标志物在预测、诊断儿童脓毒症中的应用，以解决上述现有技术存在的问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供Ang1-7作为生物标志物在制备用于对儿童脓毒症的进展进行诊断、预测或监测或分阶段的产品中的应用，所述儿童的年龄为28天至18岁。

优选的是，所述产品用于对脓毒症的进展进行分阶段具体为普通感染、脓毒症、菌血症或脓毒性休克。

优选的是，所述对脓毒症的进展进行诊断、预测或监测或分阶段的方法为从所述儿童获得的生物样品中定性、定量检测肾素。

优选的是，所述生物样品包括血浆、血清或血液。

优选的是，采用酶联免疫吸附法分析所述生物样品。

优选的是，与对照样品或参照样品相比，所述生物样品中Ang1-7的水平降低表明随着脓毒症的进展至各个阶段，脓毒症的严重性增加。

本发明还提供一种用于儿童脓毒症的检测试剂，以Ang1-7为检测目的物。

本发明还提供一种用于儿童脓毒症的检测试剂盒，包括所述检测试剂。

本发明还提供Ang1-7作为生物标志物在制备用于确定儿童脓毒症严重性的评分的产品的应用，所述确定脓毒症严重性的评分的方法为从所述儿童获得的生物样品中定性、定量检测Ang1-7，并将Ang1-7的水平与对照样品或参照样品进行比较以得出分数。

本发明还提供Ang1-7作为生物标志物在制备用于确定儿童器官功能障碍或儿童序贯器官衰竭的产品的应用，所述确定儿童器官功能障碍或儿童序贯器官衰竭的方法为从所述儿童获得的生物样品中定性、定量检测Ang1-7，并将Ang1-7的水平与对照样品或参照样品进行比较。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过对108例临床确诊的儿童脓毒症患者的研究发现：Ang1-7在儿童脓毒症患者中存在明显表达降低。另外，通过对患者临床及预后资料的研究并结合现在用于脓毒症诊断的金标准发现Ang1-7对于儿童脓毒症的诊断有着重要价值。另外，其表达情况对预测患者预后好坏有着较高价值。目前，关于Ang1-7在儿童脓毒症发生中的作用的相关文献报道甚少，本发明的优点在于：1、本发明发现了Ang1-7可作为儿童脓毒症的诊断标志物，具有较好的前景，可在存在感染患者中特异性检测血清Ang1-7水平，用于提示儿科患者是否出现脓毒症并为患者预后好坏提供依据；2、本发明特异性强，通过ELISA手段检测患者外周血Ang1-7的表达情况预测脓毒症的出现，能够直接应用于临床，具有切实的临床使用价值。3、本发明具有高效、高度特异性、灵敏度高及高可信度、直观、准确度高的优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实验操作流程；

图2为Ang1-7在不同组别中的表达水平差异及特点，其中，A为先锋队列(脓毒症n＝58，普通感染组n＝14，健康组n＝37)中，Ang1-7在不同组别中的表达水平差异比较；B为验证队列中(脓毒症组n＝50，普通感染组n＝37，健康组n＝46)，Ang1-7在不同组别中的表达水平差异比较；C为总队列中(脓毒症n＝108，普通感染组n＝51，健康组n＝83)，Ang1-7在不同组别中的表达水平差异比较；D为在Ang1-7在脓毒症不同时间点及其在健康组的表达差异水平比较(脓毒症组n＝32，健康组n＝83)；

图3为Ang1-7在脓毒症不同亚组中的表达水平差异及特点，其中，Ang1-7在单纯脓毒症组(n＝76)及脓毒症休克(n＝32)两个亚组中的表达水平差异比较；B为Ang1-7在28天生存组(n＝95)和28天死亡组(n＝13)中的表达水平差异比较；C为108例脓毒症中，Ang1-7在菌血症组(n＝96)及非菌血症组(n＝12)两个亚组中的表达水平差异比较；

图4为Ang1-7与脓毒症患儿病情严重程度各项指标的相关性分析，其中，A为脓毒症患儿入院24小时内的肾素表达与儿童器官功能障碍评分2(PELOD-2)的相关性分析；B为脓毒症患儿入院24小时内的肾素表达与儿童序贯脏器衰竭评分(pSOFA)的相关性分析；

图5为Ang1-7在儿童脓毒症模型中的ROC曲线及其与C反应蛋白(CRP)的预测效能-曲线下面积(AUC)比较；

图6为Ang1-7与108例脓毒症患儿的相关生存曲线及截断值(cutoff value)。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道或是已公开。

实施例1

纳入研究的所有患者均来自于重庆医科大学附属儿童医院重症医学科，患者入院后立即收集患者一般情况，包括患者姓名、性别、年龄、危重症评分，脏器功能指标，呼吸机参数等。入院后常规收集完善包括血常规、肝肾功能、血凝常规、血乳酸等临床检验指标。在确诊脓毒症的当天(D1)，第三天(D3)，及第七天(D7)再次分别不同时间点收集患者外周血2mL，分离冻存血清置于-80℃冻存并于1周内完成检验。

为保证设计的严谨性及数据可靠性，本发明设计了先锋队列及验证队列，不同时间收集的标本，采用同样的检测方法检测，以测试Ang1-7水平在儿童脓毒症中的表达稳定及一致性。

在收集入组患者之前，按照儿童脓毒症国际指南制定了严格的入组标准(详见下方纳入、排除标准)。普通感染组为同期入住PICU，存在感染但未达到脓毒症诊断标准的患儿。健康研究人群均是前来重庆医科大学附属儿童医院体检中心进行健康体检的儿童人群，在征得其本人和(或)家属同意后，我们会询问其既往病史情况同时立即收集外周血。对于既往确实没有疾病且体检各项检查指标均正常者纳入健康对照组，收集外周血2mL，同样分离冻存血清于-80℃，并在1周内进行下一步实验。实验操作流程见图1，具体实验细节如下：

①纳排标准

实验组：

纳入标准：a、满足2005年《儿童脓毒症国际共识》：(1)达两条或两条以上的全身炎症反应综合征标准；(2)确认或怀疑的侵入性感染；(3)存在心血管功能障碍、急性呼吸窘迫综合征或两个及两个以上的器官功能障碍；b、年龄范围为29天至18岁；c、有知情同意及完整研究数据。

排除标准：a、不符合2005年《儿童脓毒症国际共识》；b、不满足28天至18岁的年龄范围；c、无知情同意及完整研究数据。

对照组：

纳入标准：a1、样本收集阶段同期收入重庆医科大学附属儿童医院PICU普通感染(有病原学证据)但非脓毒症的患儿；a2、重庆医科大学附属儿童医院健康体检中心体检患儿(a1及a2满足其一即可)；b、年龄范围为28天至18岁；c、有知情同意及完整研究数据。

排除标准：a、不满足28天至18岁的年龄范围；b、无知情同意及完整研究数据。

②样本采集和处理：符合纳入标准实验组患儿的在入院后第1天，第3天及第7天的血液样本各2mL，对照组儿童收集入PICU或体检当天血液样本2mL，1小时内离心处理(3500转/分钟，8分钟)分离血清，200μL/管分装后于-80℃超低温保存。

③样本检测：采用酶联免疫吸附法(ELISA)对所收集的实验组及对照组样本进行Ang1-7等RAS相关因子水平的检测，同时收集两组的相关临床数据。

④数据质控：实验组及对照组资料进行双人复核，采用SPSS17.0软件进行统计学分析。用于比较的数据采用正态性检验进行评估，符合正态分布的计量数据采用均数±标准差表示。采用Spearman等级检验进行相关分析。所有统计检验均为双侧检验，均在P＝0.05的显著水平上进行。构建受试者工作特征(ROC)曲线，根据ROC曲线确定最佳截点。所有的图表都是由GraphPad Prism 8.0创建。

实验数据分析：

Ang1-7在不同队列的不同组别中的表达水平差异及特点见图2。数据表示为平均值±标准差，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P＜0.0001。图2中A显示先锋队列中Ang1-7在儿童脓毒症组中的表达水平明显低于健康组，健康组n＝37，普通感染组n＝14，脓毒症组n＝58；图2中B显示队列中Ang1-7在儿童脓毒症组中的表达水平明显低于健康组，健康组n＝46，普通感染组n＝37，脓毒症组n＝50；图2中C显示总队列中Ang1-7在儿童脓毒症组中的表达水平明显低于健康组，健康组n＝83，普通感染组n＝51，脓毒症组n＝108；图2中D显示总队列中Ang1-7在儿童脓毒症组第1天的表达水平明显低于健康组，脓毒症组内：第一天表达水平明显低于脓毒症第七天，D1/3/7的脓毒症样本数n＝32，健康组＝83；

Ang1-7在脓毒症不同亚组中的表达水平差异及特点见图3。数据表示为平均值±标准差，*P<0.05；**P<0.01。图3中A显示Ang1-7在脓毒性休克组的表达水平明显低于普通脓毒症组；图3中B显示Ang1-7在脓毒症28天死亡组的表达水平明显低于28天生存组；图3中C显示Ang1-7在菌血症组的表达水平明显低于非菌血症组；

Ang1-7与脓毒症患儿病情严重程度各项指标的相关性分析见图4。图4中A显示脓毒症患儿的Ang1-7水平与儿童器官功能障碍评分2(PELOD-2)呈负相关(r＝-0.2559；P＜0.05)；图4中B显示脓毒症患儿的Ang1-7水平与儿童序贯器官衰竭评分(pSOFA)呈负相关(r＝-0.5239；P＜0.0001)。

Ang1-7在儿童脓毒症模型中的ROC曲线及其与C反应蛋白(CRP)的预测效能-曲线下面积(AUC)比较见图5。如图5所示：Ang1-7的预测效能(AUC＝0.6834)优于C-反应蛋白(AUC＝0.5276)。

Ang1-7与108例脓毒症患儿的相关生存曲线(Kaplan-Meier survival curve)见图6。根据约登指数计算出肾素的截断值(Cutoff value)为83.25pg/mL，以此截断值分为两组，根据28天生存率进行生存曲线相关性分析，P＝0.13，仍具有一定提示意义，提示血清Ang1-7水平低于83.25pg/mL对于儿童脓毒症具有一定预测参考价值。

本发明通过收集的108例儿童脓毒症血清样本的检测及分析，发现Ang1-7在脓毒症患儿中的表达水平明显下降，且与儿童脓毒症的疾病严重程度及脏器损害程度密切相关。血清Ang1-7水平在儿童脓毒症中明显降低，在菌血症感染中下降较非菌血症明显，且与脓毒症的脏器损害及病情预后密切相关，本发明提示Ang1-7在儿童脓毒症诊疗方面的潜力，为开发更有效，更快捷的Ang1-7检测试剂及儿童脓毒症潜在治疗靶点提供新的可能。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。