热休克蛋白结合肽组合物及其使用方法

本申请要求于2018年4月26日提交的美国临时专利申请第62/663,083号和于2018年6月29日提交的美国临时专利申请第62/692,009号的优先权，所述申请中每一个的全部公开内容特此通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及热休克蛋白(HSP)结合肽组合物，以及此类组合物作为免疫治疗剂(例如，癌症疫苗)的用途。

背景技术

免疫疗法正在成为治疗癌症的重要工具。一种免疫疗法涉及使用包括癌症特异性抗原肽的治疗性癌症疫苗，所述癌症特异性抗原肽主动教育患者的免疫系统靶向并破坏癌细胞。然而，这种治疗性癌症疫苗的产生受到癌症特异性抗原肽的免疫原性的限制。

因此，在本领域中需要产生高免疫原性癌症特异性抗原肽的改进方法并且需要产生包括这些肽的有效抗癌疫苗。

发明内容

本公开提供了包括新颖的HSP结合肽的多肽和组合物。此类多肽和组合物特别适用于免疫治疗剂(例如，癌症疫苗)。还提供了使用此类多肽和组合物诱导细胞免疫应答的方法、使用此类多肽和组合物治疗疾病的方法、包括此类多肽和组合物的试剂盒以及制备此类组合物的方法。

因此，在一方面，本公开提供了一种分离的多肽，所述分离的多肽包括热休克蛋白(HSP)结合肽，所述热休克蛋白结合肽包括氨基酸序列X

在某些实施例中，所述HSP结合肽包括以下氨基酸序列：NX

在某些实施例中，所述HSP结合肽包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO:5-12、98-113、204、205和207-215。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由选自由以下组成的组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:5-12、98-113、204、205和207-215。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的长度为不超过6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个氨基酸残基。

在某些实施例中，所述多肽进一步包括抗原肽，所述抗原肽包括一个或多个主要组织相容性复合物(MHC)结合表位。在某些实施例中，所述MHC结合表位以500nM或更小的IC

在某些实施例中，所述MHC结合表位来自癌细胞。在某些实施例中，所述MHC结合表位包括所述癌细胞的氨基酸突变或基因融合突变。在某些实施例中，所述氨基酸突变是取代、缺失或插入突变。在某些实施例中，所述氨基酸突变或基因融合突变位于或大约位于所述抗原肽的中间。在某些实施例中，所述氨基酸突变或基因融合突变位于所述抗原肽的所述氨基酸序列的1位、2位、3位、4位、5位、6位、7位、8位、9位、10位、11位、12位、13位、14位、15位、16位、17位、18位、19位、20位、21位、22位、23位、24位、25位、26位、27位、28位、29位、30位、31位、32位、33位、34位、35位、36位、37位、38位、39位、40位、41位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48位、49位或50位。

在某些实施例中，所述MHC结合表位来自病原微生物。在一些实施例中，所述病原微生物是病毒。在某些实施例中，所述病毒是人乳头瘤病毒(HPV)。在某些实施例中，所述抗原肽包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:38-53。

在另一方面，本公开提供了一种分离的多肽，所述分离的多肽包括HSP结合肽和抗原肽，所述抗原肽包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:38-53。

在某些实施例中，所述抗原肽的氨基酸序列由选自由以下组成的组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:38-53。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1-12、98-113、204、205、207-215和232。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由选自由以下组成的组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:1-12、98-113、204、205、207-215和232。

在某些实施例中，所述MHC结合表位包括经修饰的氨基酸残基。在某些实施例中，所述经修饰的氨基酸残基是已经在侧链羟基或胺上磷酸化的Tyr、Ser、Thr、Arg、Lys或His。在某些实施例中，所述经修饰的氨基酸残基是已经在侧链羟基或胺上磷酸化的Tyr、Ser、Thr、Arg、Lys或His氨基酸的模拟物。在某些实施例中，所述模拟物是磷酸化残基的不可水解的类似物。在某些实施例中，所述经修饰的氨基酸残基是已经在侧链酰胺上糖基化的Asn、已经在侧链羟基上糖基化的Ser或Thr、已经在侧链氨基上甲基化的Lys或Arg、已经在侧链氨基上乙酰化的Lys、已经在α-氨基上乙酰化的N端残基或已经在α-羧基上酰胺化的C端残基。在某些实施例中，所述经修饰的氨基酸残基位于或大约位于所述抗原肽的中间。在某些实施例中，所述经修饰的氨基酸残基位于所述抗原肽的所述氨基酸序列的1位、2位、3位、4位、5位、6位、7位、8位、9位、10位、11位、12位、13位、14位、15位、16位、17位、18位、19位、20位、21位、22位、23位、24位、25位、26位、27位、28位、29位、30位、31位、32位、33位、34位、35位、36位、37位、38位、39位、40位、41位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48位、49位或50位。

在某些实施例中，所述HSP结合肽通过化学接头连接至所述抗原肽。在某些实施例中，所述HSP结合肽通过肽接头连接至所述抗原肽。在某些实施例中，所述肽接头包括氨基酸序列FFRK(SEQ ID NO:13)或FR。

在某些实施例中，所述HSP结合肽位于所述多肽的C端。在某些实施例中，所述多肽包括以下氨基酸序列：

(a)FFRKX

(b)FFRKNX

(c)FFRKWLX

(e)FFRKNWX

在某些实施例中，所述HSP结合肽位于所述多肽的N端。在某些实施例中，所述多肽包括以下氨基酸序列：

(a)X

(b)NX

(c)WLX

(d)NWLX

(e)FFRKNWX

在某些实施例中，所述多肽的长度为12到50个氨基酸(例如，长度为12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个氨基酸)。在某些实施了中，所述多肽的长度为20到40个氨基酸。

在某些实施例中，所述多肽包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:54-69。在某些实施例中，所述多肽的氨基酸序列由选自由以下组成的组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:54-69。

在某些实施例中，所述多肽是化学合成的。

在另一方面，本公开提供了一种组合物，所述组合物包括本文公开的多肽与纯化的应激蛋白的复合物。在某些实施例中，所述应激蛋白选自由以下组成的组：Hsc70、Hsp70、Hsp90、Hsp110、Grp170、Gp96、钙网蛋白及其突变体或融合蛋白。在某些实施例中，所述应激蛋白是Hsc70。在某些实施例中，所述应激蛋白是人Hsc70。在某些实施例中，所述应激蛋白是重组蛋白。

在另一方面，本公开提供了一种组合物，所述组合物包括多种本文公开的多肽，任选地进一步包括本文公开的纯化的应激蛋白。在某些实施例中，所述组合物包括2-20种本文公开的不同多肽。在某些实施例中，所述不同多肽中的每种多肽均包括相同的HSP结合肽和不同的抗原肽。

在某些实施例中，所述多肽中的每一种多肽的抗原肽均包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:38-53。在某些实施例中，所述组合物包括至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种或16种不同的抗原肽。在某些实施例中，所述多肽中的每一种多肽均包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:54-69。在某些实施例中，所述多肽中的每一种多肽的氨基酸序列由选自由以下组成的组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:54-69。在某些实施例中，所述组合物包括至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种或16种不同的多肽。在某些实施例中，所述组合物中的所述一种或多种多肽的总量为约0.1到20nmol。在某些实施例中，所述组合物中的所述一种或多种多肽的总量为约3、4、5或6nmol。在某些实施例中，所述组合物中的所述应激蛋白的量为约10μg到600μg。在某些实施例中，所述组合物中的所述应激蛋白的量为约250μg到290μg。

在某些实施例中，所述一种或多种多肽与所述应激蛋白的摩尔比为约0.5:1到5:1。在某些实施例中，所述一种或多种多肽与所述应激蛋白的摩尔比为约1:1到2:1。在某些实施例中，所述一种或多种多肽与所述应激蛋白的摩尔比为约1:1、1.25:1或1.5:1。

在某些实施例中，所述组合物中的所述一种或多种多肽和应激蛋白的总量为约10μg到600μg。在某些实施例中，所述组合物中的所述一种或多种多肽和应激蛋白的总量为约300μg。

在某些实施例中，所述组合物进一步包括佐剂。在某些实施例中，所述佐剂包括皂苷或免疫刺激性核酸。在某些实施例中，所述佐剂包括QS-21。在某些实施例中，所述组合物中的所述QS-21的量为约10μg、25μg或50μg。在某些实施例中，所述佐剂包括Toll样受体(TLR)激动剂。在某些实施例中，所述TRL激动剂是TLR4的激动剂。在某些实施例中，所述TRL激动剂是TLR7和/或TLR8的激动剂。在某些实施例中，所述TRL激动剂是TLR9的激动剂。在某些实施例中，所述TRL激动剂是TLR5的激动剂。

在某些实施例中，所述组合物是包括药学上可接受的载剂或赋形剂的药物组合物。在某些实施例中，所述组合物呈单位剂型。

在另一方面，本公开提供了一种在受试者中诱导对抗原肽的细胞免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文公开的组合物或单位剂型。在某些实施例中，所述受试者患有癌症。在某些实施例中，所述受试者患有病原微生物感染。

在另一方面，本公开提供了一种在受试者中治疗疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文公开的组合物或单位剂型。在某些实施例中，所述疾病是癌症。在某些实施例中，所述疾病是病原微生物感染。

在某些实施例中，所述MHC结合表位存在于所述受试者的癌细胞中。在某些实施例中，所述MHC结合表位存在于所述病原微生物中。

在某些实施例中，每周一次向所述受试者施用所述组合物或单位剂型，持续四周。在某些实施例中，在四个每周剂量之后，每两周一次向所述受试者施用至少另外两剂所述组合物或单位剂型。在某些实施例中，在最后一次的每周或每两周剂量后三个月，施用至少一个加强剂量的所述组合物或单位剂型。在某些实施例中，进一步地每三个月施用一次所述组合物或单位剂型，持续至少1年。

在某些实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用来那度胺、地塞米松、白介素-2、重组干扰素α-2b或PEG-干扰素α-2b。在某些实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用吲哚胺双加氧酶-1(IDO-1)抑制剂。在某些实施例中，所述IDO-1抑制剂是4-氨基-N-(3-氯-4-氟苯基)-N'-羟基-1,2,5-噁二唑-3-甲酰亚胺。在某些实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用免疫检查点抗体。在某些实施例中，所述免疫检查点抗体选自由以下组成的组：激动性抗GITR抗体、激动性抗OX40抗体、拮抗性抗PD-1抗体、拮抗性抗CTLA-4抗体、拮抗性抗TIM-3抗体、拮抗性抗LAG-3抗体、拮抗性抗TIGIT抗体、激动性抗CD96抗体、拮抗性抗VISTA抗体、拮抗性抗CD73抗体、激动性抗CD137抗体、拮抗剂抗CEACAM1抗体、激动剂抗ICOS抗体和或其抗原结合片段。

在另一方面，本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括含有本文公开的多肽的第一容器和含有能够与所述多肽结合的纯化的应激蛋白的第二容器。

在某些实施例中，所述第一容器含有2-20种本文公开的不同多肽。在某些实施例中，所述不同多肽中的每种多肽均包括相同的HSP结合肽和不同的抗原肽。在某些实施例中，所述第一容器中的所述一种或多种多肽的总量为约0.1到20nmol。在某些实施例中，所述第一容器中的所述一种或多种多肽的总量为约3、4、5或6nmol。

在某些实施例中，所述第一容器含有单一本文公开的多肽。在某些实施例中，所述第一容器含有至少20种本文公开的不同多肽。在某些实施例中，所述不同多肽中的每种多肽均包括相同的HSP结合肽和不同的抗原肽。在某些实施例中，所述第一容器中的所述一种或多种多肽的总量为约0.1到20nmol。在某些实施例中，所述第一容器中的所述一种或多种多肽的总量为约3、4、5或6nmol。

在某些实施例中，所述应激蛋白选自由以下组成的组：Hsc70、Hsp70、Hsp90、Hsp110、Grp170、Gp96、钙网蛋白及其突变体。在某些实施例中，所述应激蛋白是Hsc70。在某些实施例中，所述应激蛋白是人Hsc70。在某些实施例中，所述应激蛋白是重组蛋白。在某些实施例中，所述第二容器中的所述应激蛋白的量为约10μg到600μg。在某些实施例中，所述第二容器中的所述应激蛋白的量为约250μg到290μg。

在某些实施例中，所述多肽与所述应激蛋白的摩尔比为约0.5:1到5:1。在某些实施例中，所述多肽与所述应激蛋白的摩尔比为约1:1到2:1。在某些实施例中，所述多肽与所述应激蛋白的摩尔比为约1:1、1.25:1或1.5:1。在某些实施例中，所述第一容器中的所述一种或多种多肽和所述第二容器中的所述应激蛋白的总量为约10μg到600μg。在某些实施例中，所述第一容器中的所述一种或多种多肽和所述第二容器中的所述应激蛋白的总量为300μg。

在某些实施例中，所述试剂盒进一步包括含有佐剂的第三容器。在某些实施例中，所述佐剂包括皂苷或免疫刺激性核酸。在某些实施例中，所述佐剂包括QS-21。在某些实施例中，所述第三容器中的所述QS-21的量为约10μg、25μg或50μg。在某些实施例中，所述佐剂包括TLR激动剂。在某些实施例中，所述TRL激动剂是TLR4的激动剂。在某些实施例中，所述TRL激动剂是TLR7和/或TLR8的激动剂。在某些实施例中，所述TRL激动剂是TLR9的激动剂。在某些实施例中，所述TRL激动剂是TLR5的激动剂。

在另一方面，本公开提供了一种制备疫苗的方法，所述方法包括在合适的条件下将一种或多种本文公开的多肽与纯化的应激蛋白混合，以使所述纯化的应激蛋白结合所述多肽中的至少一种多肽。在某些实施例中，所述应激蛋白选自由以下组成的组：Hsc70、Hsp70、Hsp90、Hsp110、Grp170、Gp96、钙网蛋白及其突变体。在某些实施例中，所述应激蛋白是Hsc70。在某些实施例中，所述应激蛋白是人Hsc70。在某些实施例中，所述应激蛋白是重组蛋白。在某些实施例中，所述多肽与所述应激蛋白的摩尔比为约0.5:1到5:1。在某些实施例中，所述多肽与所述应激蛋白的摩尔比为约1:1到2:1。在某些实施例中，所述多肽与所述应激蛋白的摩尔比为约1:1、1.25:1或1.5:1。在某些实施例中，所述合适的条件包括约37℃的温度。

附图说明

图1是示例性的尺寸排阻色谱法(SEC)色谱图，其示出了未复合的Hsc70(顶部)和肽复合的Hsc70(底部)的UV吸光度。“C”、“D”、“T”和“HMW”分别表示对应于肽-Hsc70复合物、Hsc70二聚体、Hsc70三聚体和高分子量低聚Hsc70物种的色谱图片段。“Msh”是指单体肩峰。

图2是色谱图，其示出了在0.25:1到3:1的摩尔比范围内的与Hsc70混合的PEP006的UV吸光度，其中混合物中的组合物通过尺寸排阻色谱法分离。

图3A是色谱图，其示出了在0.125:1到4:1的摩尔比范围内的包括与Hsc70混合的PEP006的多肽的UV吸光度，其中混合物中的组合物通过尺寸排阻色谱法分离。图3B是示出在根据类似于图3A的尺寸排阻色谱法迹线所计算的范围从0.125:1到4:1的多肽:Hsc70摩尔比范围内，含PEP006的多肽与Hsc70的复合百分比的图。示出了三个独立的实验。

图4A是示出五种不同的肽与Hsc70的复合百分比的图，其中五种不同的肽中的每种肽以三种形式合成：一种具有C端PEP001序列，一种具有C端PEP006序列，并且一种没有C端HSP结合肽(“裸肽”)。图4B是示出六种不同的肽与Hsc70的复合百分比的图，其中六种不同的肽中的每种肽以两种形式合成：一种具有C端PEP001序列，并且一种具有C端PEP006序列。

图5A和5B是示出来自用疫苗免疫的小鼠的产生IFNγ的脾细胞的相对数量的图，所述疫苗包活含PEP001或PEP006的HPV合并肽或未与HSP结合肽连接的HPV合并肽(裸HPV肽)，所述HPV合并肽呈游离肽形式或以2:1或1:1的比率与Hsc70蛋白混合(每个治疗组n＝3只小鼠)。

图6是示出来自用指定的MC38肽库(呈游离肽形式或以2:1或1:1的比率与Hsc70蛋白混合)免疫的小鼠的产生IFNγ的脾细胞的相对数量的图(每个治疗组n＝3只小鼠)。

图7A是示出同基因小鼠肿瘤模型中平均肿瘤体积的图，其中用包括含PEP001的HPV肽(“PEP067-070”)、含PEP006的HPV肽(“PEP063-066”)或裸HPV肽(“PEP059-062”)的疫苗对小鼠进行免疫，所述HPV肽在每种情况下均与本文第6.2.2节中所述的Hsc70蛋白混合，或以PBS作为阴性对照(每个治疗组n＝10只小鼠)。图7B-7E示出了这四个治疗组中每只小鼠的肿瘤体积。图7F示出了一组小鼠存活曲线。

图8A是示出同基因小鼠肿瘤模型中平均肿瘤体积的图，其中用包括新的含PEP006的HPV肽库(“PEP071-086”)或先前测试的含PEP006的HPV肽库(“PEP063-066”)的疫苗对小鼠进行免疫，所述HPV肽在每种情况下均与本文第6.2.3节中所述的Hsc70蛋白混合，或以PBS作为阴性对照(每个治疗组n＝13只小鼠；误差条：标准偏差)。图8B示出了一组小鼠存活曲线。

图9A是一系列图，其示出了与PBS相比，用两种不同的HSC70类疫苗调配物治疗的小鼠的肿瘤生长动力学，所述疫苗载有包括PEP006的16种不同的HPV肽。图9B是示出相同小鼠中小鼠的组平均肿瘤生长动力学的图。图9C是示出同一实验中的总存活率的图。

图10A是一系列色谱图，其示出了裸Ova肽(SEQ ID NO:97)或与PEP001(SEQ IDNO:230)或PEP006(SEQ ID NO:231)连接的Ova肽的化学合成产物的反相色谱信号。箭头指示纯肽的保留时间。

图10B是示出图10A中的信号的量化的图。

图11是示出裸肽(A-Y)相对于具有C端PEP006序列的相同肽(A-Y)的粗物质纯度的图。

具体实施方式

本公开提供了包括新颖的HSP结合肽的多肽和组合物。此类多肽和组合物特别适用于免疫治疗剂(例如，癌症疫苗)。还提供了使用此类多肽和组合物诱导细胞免疫应答的方法、使用此类多肽和组合物治疗疾病的方法、包括此类多肽和组合物的试剂盒以及制备此类组合物的方法。

5.1定义

除非在本文另外定义，否则本文使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。万一存在任何潜在歧义，则本文所提供的定义优先于任何字典或外部定义。除非上下文另外要求，否则单数术语应该包含复数含义，并且复数术语应该包含单数含义。除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。术语“包含(including)”以及如“包含(includes)”和“包含(included)”等其它形式的使用并非限制性的。

如本文所使用的，当用于修饰数值或数值范围时，术语“约”和“大约”指示高出所述值或范围5％到10％(例如，高达5％到10％以上)和低于所述值或范围5％到10％(例如，高达5％到10％以下)的偏差维持在所述值或范围旨在意指的范围内。

如本文所使用的，术语“多肽”是指包括具有六个或更多个氨基酸残基的肽的非天然存在的聚合物。多肽可以进一步包括一个或多个非氨基酸残基结构。在某些实施例中，多肽包括化学接头。在某些实施例中，多肽包括连接多肽的两个部分的化学接头。在某些实施例中，多肽不包括蛋白质(例如，天然存在的蛋白质)的完整氨基酸序列，所述蛋白质包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在某些实施例中，多肽不包括这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包括蛋白质(例如，天然存在的蛋白质)的多于6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个连续氨基酸，所述蛋白质包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

如本文所使用的，术语“分离的多肽”是指与在多肽的表达(例如，重组表达)或合成(例如，化学合成)之后存在的一个或多个分子分离的多肽。

如本文所使用的，术语“主要组织相容性复合体”和“MHC”可互换使用，并且是指MHC I类分子和/或MHC II类分子。

如本文所使用的，术语“人白细胞抗原”和“HLA”可互换使用，并且是指人的主要组织相容性复合物(MHC)。HLA分子可以是I类MHC分子(例如，HLA-A、HLA-B、HLA-C)或II类MHC分子(例如，HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR)。

如本文所使用的，术语“主要组织相容性复合物(MHC)结合表位”是指与MHC分子结合或被预测将与MHC分子结合的肽。

如本文所使用的，术语“热休克蛋白结合肽”和“HSP结合肽”可互换使用，并且是指与HSP非共价结合的肽。在某些实施例中，HSP结合肽不包括这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列含有蛋白质(例如，天然存在的蛋白质)的多于6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个连续氨基酸，所述蛋白质包括SEQID NO:1的氨基酸序列。

如本文所使用的，术语“肽接头”是指将第一个肽的C端氨基酸残基连接至第二个肽的N端氨基酸残基的肽键或肽序列。

如本文所使用的，术语“化学接头”是指能够连接两个分子的任何化学键或部分，其中所述键或部分不是肽接头。

如本文所使用的，术语“治疗(treat、treating和treatment)”是指本文中所描述的治疗性或预防性措施。“治疗”方法采用向患有疾病或病症或易患这种疾病或病症的受试者施用抗体，其目的是为了预防所述疾病或病症或复发性疾病或病症的一种或多种症状、治愈所述一种或多种症状、延缓所述一种或多种症状、降低所述一种或多种症状的严重性或改善所述一种或多种症状，或者是为了延长受试者的存活期使其超过在不使用这种治疗的情况下所预期的时间。

如本文所使用的，在向受试者施用疗法的背景下，术语“有效量”是指达到所期望的预防或治疗效果的疗法的量。

如本文所使用的，术语“受试者”包含任何人或非人动物。

5.2热休克蛋白(HSP)结合肽

在一方面，本公开提供了一种多肽，所述多肽包括HSP结合肽，所述HSP结合肽包括表1中提供的氨基酸序列中的任何一种。

表1.HSP结合肽的氨基酸序列

在一方面，本公开提供了一种多肽，所述多肽包括HSP结合肽，所述HSP结合肽包括氨基酸序列X

在某些实施例中，所述HSP结合肽包括氨基酸序列NX

在某些实施例中，所述HSP结合肽包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO:5-12、98-113、204-205和207-215。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQID NO:12的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:98的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:99的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:100的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQID NO:101的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:102的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:103的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:104的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:105的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:106的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:107的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:108的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:109的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:110的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:111的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:112的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:113的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:204的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:205的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:207的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:208的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:209的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:210的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:211的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:212的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:213的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:214的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:215的氨基酸序列。

在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:232的氨基酸序列组成。

在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由选自由以下组成的组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:5-12、98-113、204、205和207-215。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:7的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQID NO:8的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:98的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:99的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:100的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:101的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:102的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:103的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:104的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:105的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:106的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:107的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQID NO:108的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ IDNO:109的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:110的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:111的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:112的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:113的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:204的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:205的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:207的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:208的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:209的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:210的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:211的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:212的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:213的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:214的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述HSP结合肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:215的氨基酸序列组成。

在某些实施例中，所述HSP结合肽的长度为不超过100个(例如，不超过6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个或95个)氨基酸残基。在某些实施例中，所述HSP结合肽的长度为6到50个(例如，6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个)氨基酸残基。

在某些实施例中，多肽的氨基酸序列由HSP结合肽的氨基酸序列组成。

在某些实施例中，所述HSP结合肽进一步包括接头。接头可以是本领域已知的任何化学接头或肽接头。

在某些实施例中，接头包括用于化学交联或紫外线(UV)交联的部分。可以使用本领域已知的任何化学交联或UV交联部分(参见例如，Wong,1991，《蛋白质结合和交联化学(Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking)》,CRC出版社，所述文献通过引用整体并入本文)。在某些实施例中，接头包括点击化学柄。如本文所使用的，术语“点击化学柄”是指可以参与点击化学反应的反应物或反应性基团。示例性点击化学柄在美国专利公开20130266512中进行了演示，所述专利通过引用整体并入本文。

在某些实施例中，接头包括肽接头。在某些实施例中，肽接头包括可以被蛋白酶识别和/或切割的氨基酸序列。在某些实施例中，蛋白酶在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中表达。在某些实施例中，蛋白酶在抗原呈递细胞(例如，B细胞、巨噬细胞、树突状细胞)中表达。在某些实施例中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。在某些实施例中，蛋白酶是胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶或弹性蛋白酶。在某些实施例中，所述肽接头包括氨基酸序列FFRK(SEQ ID NO:13)或由所述氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述肽接头包括氨基酸序列FR或由所述氨基酸序列组成。

表2.接头和具有接头的HSP结合肽的氨基酸序列

在某些实施例中，多肽包括表2中提供的氨基酸序列中的任何一种。

在某些实施例中，接头位于HSP结合肽的N端。在某些实施例中，所述多肽包括SEQID NO:14、15、16、17或233的氨基酸序列。在某些实施例中，所述多肽包括SEQ ID NO:18、19、20、21、22、23、24、25、71、72、74、75、166、167、173或174的氨基酸序列。在某些实施例中，所述多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:14、15、16、17或233的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:18、19、20、21、22、23、24、25、71、72、74、75、166、167、173或174的氨基酸序列组成。

在某些实施例中，接头位于HSP结合肽的C端。在某些实施例中，所述多肽包括SEQID NO:26、27、28、29或234的氨基酸序列。在某些实施例中，所述多肽包括SEQ ID NO:30、31、32、33、34、35、36、37、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228或229的氨基酸序列。在某些实施例中，所述多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:26、27、28、29或234的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:30、31、32、33、34、35、36、37、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228或229的氨基酸序列组成。

5.3包括HSP结合肽的多肽

在一方面，本公开提供了一种多肽，所述多肽包括本文公开的HSP结合肽和包括一个或多个MHC结合表位的抗原肽。

可以通过本领域已知的方法，例如通过测量肽与MHC分子(例如，HLA分子)结合的测定法来鉴定MHC结合表位。此类测定法的非限制性实例包含抑制抗原呈递(Sette等人,《免疫学杂志(J.Immunol.)》141:3893,1991)、体外组装测定法(Townsend等人,《细胞学(Cell))》62:285,1990)和使用如RMA.S等突变细胞的基于FACS的测定法(Melief等人,《欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)》21:2963,1991)。在一些情况下，可以通过软件程序(例如SYFPEITHI，Rammensee等人,《免疫遗传学(Immunogenetics)》50,213-219,1999，所述文献通过引用整体并入本文)预测MHC结合表位将与MHC分子(例如，HLA分子)结合。可以用于鉴定MHC结合表位的其它方法包含但不限于在以下文献中公开的方法：Guan,P.等人,(2003)《应用生物信息学(Applied Bioinformatics)》,2:63-66；Blythe,M.J.等人,(2002)《生物信息学(Bioinformatics)》,18:434-439；Flower,D.R.和Doytchinova,I.A.(2002).《应用生物信息学》,1:167-176；Yu,K.等人,(2002)《分子医学(Molecular Medicine)》,8:137-48；Brusic,V.等人,(2002)《免疫与细胞生物学(Immunology and Cell Biology)》,80:280-285；Jung,G.等人,(2001)《生物制剂(Biologicals)》,29:179-181(其描述了T细胞表位预测程序EPIPREDICT)；Kwok,W.W.等人,(2001)《免疫学趋势(Trends in Immunology)》,22:583-588；Mallios,R.R.(2001)《生物信息学》,17:942-948；Romisch,K.(2001).《生物化学科学趋势(Trends in Biochemical Sciences)》,26:531；Schirle,M.等人,(2001)《免疫学方法杂志(Journal of Immunological Methods)》,257:1-16；Singh,H.和Raghava,G.P.S.(2001)《生物信息学》,17:1236-1237；Andersen,M.H.等人,(2000)《组织抗原(Tissue Antigens)》,55:519-531；Buus,S.(1999).《免疫学当代评论(Current Opinionin Immunology)》,11:209-213；Mallios,R.R.(1999)《生物信息学》,15:432-439；Maffei,A.和Harris,P.E.(1998).《肽(Peptides)》,19:179-198；以及Vita R.等人.,(2015)《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》,43:D405-D412(其描述了免疫表位数据库(IEDB)3.0.，可从

MHC分子被分类为I类分子或II类分子。II类MHC分子主要在参与启动和维持免疫应答的细胞上表达，如树突状细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞等。II类MHC分子被辅助性T淋巴细胞识别，并诱导辅助性T淋巴细胞增殖，并增强对显示的特定免疫原性肽的免疫应答。I类MHC分子几乎在所有有核细胞上表达，并被细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别，然后所述细胞毒性T淋巴细胞破坏携带抗原的细胞。细胞毒性T淋巴细胞在肿瘤排斥和抵抗病毒感染中特别重要。CTL识别呈结合MHC I类分子的肽片段形式的抗原，而不是完整的外来抗原本身。肽结合MHC分子的能力可以以多种不同的方式来测量，如通过抑制抗原呈递(Sette等人,《免疫学杂志》141:3893,1991，所述文献通过引用整体并入本文)、体外组装测定法(Townsend等人,《细胞学》62:285,1990)和使用如RMA.S等突变细胞的基于FACS的测定法(Melief等人,《欧洲免疫学杂志》21:2963,1991，所述文献通过引用整体并入本文)。预计结合MHC I类分子的MHC结合表位通常介于8到11个残基之间，而预计结合MHC II类分子的MHC结合表位通常在10到20个残基的范围内。

在某些实施例中，MHC结合表位是HLA结合表位。在某些实施例中，MHC结合表位以小于或等于500nM(例如，小于或等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400或450nM)的IC50结合至MHC I分子。在某些实施例中，MHC结合表位以小于或等于1000nM(例如，小于或等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800或900nM)的IC50结合至MHC II分子。

在某些实施例中，从受试者的一种或多种癌细胞(例如，子宫颈癌、腺癌、成胶质细胞瘤或多发性骨髓瘤的细胞)中鉴定出MHC结合表位的序列。在某些实施例中，MHC结合表位的氨基酸序列与从一种或多种癌细胞中鉴定出的序列100％相同。在某些实施例中，MHC结合表位的氨基酸序列与从癌细胞中鉴定出的序列至少70％、80％、90％或95％相同，任选地其中所述差异主要包括或仅包括氨基酸的保守取代。相对于物种种群中最常见的序列，从癌细胞中鉴定出的氨基酸序列可以是野生型或突变型。在从癌细胞中鉴定出的氨基酸序列是突变型的情况下，其可以包括氨基酸突变(例如，置换、缺失或插入突变)或基因融合突变(例如，由于基因组易位或转座而引起)。

在某些实施例中，从病原微生物中鉴定出MHC结合表位的序列。病原微生物可以是病毒、细菌、真菌、原生动物或寄生虫。示例性病毒包含A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、流行性感冒(例如，A型或B型流行性感冒)、水痘、腺病毒、I型单纯疱疹(HSV-I)、II型单纯疱疹(HSV-II)、牛瘟、鼻病毒、埃可病毒、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、乳头瘤病毒(例如，人类乳头瘤病毒(HPV))、乳多空病毒、巨细胞病毒、棘皮病毒、虫媒病毒、汉坦病毒、柯萨奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、I型人类免疫缺陷病毒(HIV-I)、II型人类免疫缺陷病毒(HIV-II)、登革热病毒、天花病毒和寨卡病毒。示例性细菌包含大肠杆菌(Escherichia coli)、克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、草绿色葡萄球菌(Staphylococcus viridans)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。示例性真菌包含念珠菌(Candida)(例如，光滑念珠菌(Candida glabrata))、卡氏肺孢菌(Pneumocystis carinii)、镰胞菌角膜炎(Fusariumkeratitis)、球孢子菌(coccidioidal)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)和膝曲弯孢霉菌(Curvularia geniculata)。示例性原生动物包含利什曼原虫、球虫、锥虫血吸虫和疟疾。示例性寄生虫包含衣原体和立克次氏体。

在某些实施例中，所述MHC结合表位包括经修饰的氨基酸残基。在某些实施例中，所述MHC结合表位包括磷酸化的残基(例如，已经在侧链羟基或胺上磷酸化的Tyr、Ser、Thr、Arg、Lys或His)。在某些实施例中，所述MHC结合表位包括拟磷酸酯残基(例如，已经在侧链羟基或胺上磷酸化的Tyr、Ser、Thr、Arg、Lys或His氨基酸的模拟物)。拟磷酸酯基团的非限制性实例包含O-硼磷、硼酸，O-二硫代磷酸、磷酰胺、H-膦酸酯、烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和氟代磷酸酯，所述实例中的任何一个均可在Tyr、Thr、Ser、Arg、Lys或His残基上衍生。在某些实施例中，Asp或Glu残基用作拟磷酸酯代替肽中的磷酸-Tyr、磷酸-Thr、磷酸-Ser、磷酸-Arg、磷酸-Lys和/或磷酸-His残基。在某些实施方案中，拟磷酸酯残基是磷酸化残基的不可水解的类似物。

抗原肽可以包括一个或多个MHC结合表位。在某些实施例中，抗原肽包括一个MHC结合表位。在某些实施例中，抗原肽包括两个或更多个(例如，3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个)MHC结合表位。可以通过化学接头或肽接头连接两个或更多个MHC结合表位，其中所述肽接头任选地包括可以被蛋白酶识别和/或切割的氨基酸序列。

在某些实施例中，抗原肽的长度为8到50个氨基酸(例如，8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个氨基酸)。在某些实施例中，抗原肽的长度为12到50个、20到40个、20到35个、25到40个、20到30个、25的35个或30到40个氨基酸。

HSP结合肽可以通过化学接头或肽接头连接至抗原肽。在某些实施例中，HSP结合肽可以通过化学接头连接至抗原肽。可以采用任何化学接头来连接HSP结合肽和抗原肽。示例性化学接头包含由化学交联(参见例如，Wong,1991，《蛋白质结合和交联化学》,CRC出版社，所述文献通过引用整体并入本文)、UV交联和点击化学反应(参见例如，美国专利公开20130266512，所述美国专利通过引用整体并入本文)产生的部分。在某些实施例中，HSP结合肽可以通过肽接头(例如，第5.2节中公开的肽接头)连接至抗原肽。

HSP结合序列可以在任何氨基酸位置处连接至抗原肽。在某些实施例中，HSP结合序列的C端通过化学接头连接至抗原肽的N端。在某些实施例中，HSP结合序列的N端通过化学接头连接至抗原肽的C端。在某些实施例中，HSP结合序列的C端通过肽接头连接至抗原肽的N端。在某些实施例中，HSP结合序列的N端通过肽接头连接至抗原肽的C端。在某些实施例中，所述HSP结合肽位于所述多肽的C端。当通过固相合成制备时，在C端具有HSP结合肽的多肽具有在提高纯度方面的优点。在某些实施例中，所述HSP结合肽位于所述多肽的N端。在某些实施例中，热休克蛋白结合肽不位于多肽的N端或C端。在某些实施例中，热休克蛋白结合肽位于多肽的中心。

在某些实施例中，所述多肽从N端至C端包括抗原肽，所述抗原肽包括一个或多个本文公开的MHC结合表位、肽接头和HSP结合肽。在某些实施例中，所述多肽包括SEQ ID NO:14、15、16、17或233的氨基酸序列。在某些实施例中，所述多肽包括SEQ ID NO:18、19、20、21、22、23、24、25、71、72、74、75、166、167、173或174的氨基酸序列。在某些实施例中，所述多肽的氨基酸序列从N端至C端由本文公开的抗原肽的氨基酸序列和SEQ ID NO:14、15、16、17或233的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述多肽的氨基酸序列从N端至C端由本文公开的抗原肽的氨基酸序列和SEQ ID NO:18、19、20、21、22、23、24、25、71、72、74、75、166、167、173或174的氨基酸序列组成。

在某些实施例中，所述多肽从N端至C端包括本文公开的HSP结合肽、肽接头和包括一个或多个MHC结合表位的抗原肽。在某些实施例中，所述多肽包括SEQ ID NO:26、27、28、29或234的氨基酸序列。在某些实施例中，所述多肽包括SEQ ID NO:30、31、32、33、34、35、36、37或216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228或229的氨基酸序列。在某些实施例中，所述多肽的氨基酸序列从N端至C端由SEQ ID NO:26、27、28、29或234的氨基酸序列和本文公开的抗原肽的氨基酸序列组成。在某些实施例中，所述多肽的氨基酸序列从N端至C端由SEQ ID NO:30、31、32、33、34、35、36、37、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228或229的氨基酸序列和本文公开的抗原肽的氨基酸序列组成。

在某些实施例中，本文公开的多肽的长度不超过500个氨基酸(例如，不超过400个、300个、200个、100个、90个、80个、70个、60个、50个或40个氨基酸)。在某些实施例中，多肽的氨基酸序列并非天然存在的。

在某些实施例中，所述多肽以低于10

5.3.1通过化学合成生产多肽

本文公开的多肽可以通过标准化学方法合成，包含使用肽合成仪。可以使用常规的肽合成或本领域熟知的其它合成方案。

在某些实施例中，本文公开的多肽由通过肽键连接的氨基酸残基组成。此类多肽可以例如通过固相肽合成使用类似于以下文献中描述的程序的程序来合成：Merrifield,1963,《美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)》,85:2149，所述文献通过引用整体并入本文。在合成期间，将具有受保护侧链的N-α-保护的氨基酸逐步添加到通过其C端连接的正在生长的多肽链和不溶性聚合物载体(即，聚苯乙烯珠)上。通过将N-α-脱保护的氨基酸的氨基连接至已经通过与试剂(如二环己基碳二亚胺或2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸铵)反应而被活化的N-α-保护的氨基酸的α-羧基来合成多肽。游离氨基与活化的羧基的附接导致肽键形成。最常用的N-α-保护基团包含对酸不稳定的Boc和对碱不稳定的Fmoc。适当的化学成份、树脂、保护基团、受保护的氨基酸和试剂的细节是本领域熟知的(参见，Atherton等人1989,《固相肽合成：实用方法(Solid Phase PeptideSynthesis:A Practical Approach》,IRL出版社以及Bodanszky,1993,《肽化学,实用教科书(Peptide Chemistry,A Practical Textbook)》,第2版,Springer-Verlag出版社，所述文献中的每一个文献均通过引用整体并入本文)。

另外，可以如上所述化学合成多肽的类似物和衍生物。如果需要的话，可以将非经典氨基酸或化学氨基酸类似物作为取代或添加引入肽序列中。非经典氨基酸包含但不限于常见氨基酸的D-异构体、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、半胱氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、设计者氨基酸(如β-甲基氨基酸、C-α-甲基氨基酸和N-α-甲基氨基酸)。

可以使用适当的侧链保护的Fmoc-磷酸氨基酸在Fmoc固相合成中合成在Tyr、Ser、Thr、Arg、Lys和His的侧链上磷酸化的多肽。以此方式，可以合成具有磷酸化和非磷酸化的Tyr、Ser、Thr、Arg、Lys和His残基的组合的多肽。例如，可以应用Staerkaer等人的方法(1991,《四面体快报(Tetrahedron Letters)》32:5389-5392)。其它程序(某些程序针对特定氨基酸)在以下文献中详细介绍：De Bont等人(1987,《荷兰化学工程学报(Trav.ChimPays Bas)》106:641,642)、Bannwarth和Trezeciak(1987,《瑞士化学学报(Helv.Chim.Acta)》70:175-186)、Perich和Johns(1988,《四面体快报》29:2369-2372)、Kitas等人(1990,《有机化学杂志(J.Org.Chem.)》55:4181-4187)、Valerio等人(1989,《国际肽和蛋白质研究杂志(Int.J.Peptide Protein Res.)》33:428-438)、Perich等人(1991,《四面体快报》32:4033-4034)、Pennington(1994,《分子生物学方法(Meth.Molec.Biol.)》35:195-2)和Perich(1997,《酶学方法(Methods Enzymol.)》289:245-266，所述文献中的每一个文献均通过引用整体并入本文)。

还可以通过首先培养用核酸转化的细胞来产生磷酸化的多肽，所述核酸对多肽的氨基酸序列进行编码。通过细胞培养产生这种多肽后，使用有机合成或通过磷酸化酶的酶促方法，将适当氨基酸的羟基取代为磷酸基。例如，在丝氨酸特异性磷酸化的情况下，可以使用丝氨酸激酶。

还可以合成磷酸肽模拟物，其中多肽中的磷酸化的氨基酸残基被拟磷酸酯基团代替。拟磷酸酯基团的非限制性实例包含O-硼磷、硼酸，O-二硫代磷酸、磷酰胺、H-膦酸酯、烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和氟代磷酸酯，所述实例中的任何一个均可在Tyr、Thr、Ser、Arg、Lys或His残基上衍生。在某些实施例中，Asp或Glu残基用作拟磷酸酯。Asp或Glu残基也可以用作拟磷酸酯基团，并用于代替肽中的磷酸-Tyr、磷酸-Thr、磷酸-Ser、磷酸-Arg、磷酸-Lys和/或磷酸-His残基。

使用常规程序(如使用反相、凝胶渗透、分配和/或离子交换色谱法的制备型HPLC)来完成所得肽的纯化。适当的基质和缓冲液的选择在本领域中是熟知的，因此这里不再详细描述。

5.3.2使用重组DNA技术生产多肽

本文公开的多肽还可以通过本领域中已知的重组DNA方法制备。可以通过氨基酸序列的反翻译获得对多肽进行编码的核酸序列，并通过标准化学方法(如使用寡核苷酸合成仪)合成所述核酸序列。可替代地，可以使用专门设计的寡核苷酸引物和PCR方法从DNA模板中获得多肽的编码信息。可以通过提供功能上等同的分子的取代、插入或缺失来制备多肽的变形和片段。由于核苷酸编码序列的简并性，对相同多肽或多肽的变体进行编码的DNA序列可用于本发明的实践中。这些DNA序列包含但不限于核苷酸序列，其通过对序列内功能上等同的氨基酸残基进行编码的不同密码子的取代而改变，从而产生沉默或保守的变化。可以将对多肽进行编码的核酸插入表达载体中，以在宿主细胞中繁殖和表达。

由于具有本文所设想的长度的肽的编码序列可以通过化学技术合成，例如，磷酸三酯法(Matteucci等人,《美国化学学会杂志》103:3185(1981)，所述文献通过引用整体并入本文)，可以通过用一个或多个适当的碱基取代对天然肽序列代进行编码的碱基来简单地进行修饰。然后可以为编码序列提供适当的接头，并将编码序列连接到本领域通常可获得的表达载体中，并且所述载体用于转化合适的宿主以产生期望的肽或融合蛋白。现在有许多这样的载体和合适的宿主系统。为了表达肽或融合蛋白，将为编码序列提供可操作地连接的起始和终止密码子、启动子和终止子区域，并且通常提供复制系统以提供用于在期望的细胞宿主中进行表达的表达载体。

表达构建体是指对与一个或多个调节区域可操作连接的多肽进行编码的核苷酸序列，其使得能够在适当的宿主细胞中表达肽。“可操作地连接”是指这样的结合，其中调节区域和要表达的肽序列以允许转录并最终翻译的方式连接和定位。

表达载体可以提供肽转录所必需的调节区域。如果要表达缺少其同源起始密码子的肽基因序列，也可以提供翻译起始密码子(ATG)。在相容的宿主-构建体系统中，细胞转录因子(如RNA聚合酶)将与表达构建体上的调节区域结合，以影响宿主生物体中肽序列的转录。基因表达所需的调节区域的精确性质可能因宿主细胞而异。通常，需要能够结合RNA聚合酶并促进可操作地缔合的核酸序列的转录的启动子。此类调节区域可以包含与转录和翻译的起始有关的那些5'非编码序列，如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。编码序列的非编码区3'可以含有转录终止调节序列，如终止子和聚腺苷酸化位点。

为了将具有调节功能的DNA序列(如启动子)附接至肽基因序列或将肽基因序列插入载体的克隆位点，可以将提供适当的相容性限制性位点的接头或衔接子通过本领域熟知的技术(Wu等人,1987,《酶学方法》152:343-349，所述文献通过引用整体并入本文)连接至cDNA的末端。用限制酶切割后可以进行修饰，通过在连接前回切或填充单链DNA端来产生平末端。可替代地，可以通过使用含有期望的限制酶位点的引物通过PCR扩增DNA来将期望的限制酶位点引入DNA片段。

可以将包括与调节区域可操作地连接的多肽编码序列的表达构建体直接引入适当的宿主细胞中，以表达和产生肽，而无需进一步克隆。表达构建体还可以含有例如通过同源重组促进DNA序列整合入宿主细胞基因组中的DNA序列。在这种情况下，不必使用表达载体，所述表达载体包括合适用于适当宿主细胞的复制起点，以便在宿主细胞中繁殖和表达肽。

可以使用多种表达载体，包含质粒、粘粒、噬菌体、噬菌粒或经修饰的病毒。通常，此类表达载体包括用于在适当的宿主细胞中繁殖载体的功能性复制起点、用于插入肽基因序列的一个或多个限制性核酸内切酶位点以及一个或多个选择标志物。表达载体可以被构建成携带一种或多种本文公开的多肽的核苷酸序列。表达载体必须与相容的宿主细胞一起使用，所述宿主细胞可以源自原核或真核生物，包含但不限于细菌、酵母、昆虫、哺乳动物和人类。可以转化此类宿主细胞以表达一种或多种本文公开的多肽，如通过用含有多个编码本文公开的任何多肽的核苷酸序列的单一表达载体转化宿主细胞，或通过用编码本文公开的不同多肽的多种表达载体转化宿主细胞。

在细菌系统中，可以有利地选择许多表达载体以产生多肽。例如，当要生产大量这种蛋白质时，如为了产生药物组合物，可能需要指导表达易于纯化的高水平融合蛋白产物的表达的载体。此类载体包含：大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人,1983,《欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)》2,1791，所述文献通过引用整体并入本文)，其中可以将肽编码序列与lac Z编码区按框架分别连接到载体中，从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye和Inouye,1985,《核酸研究》13,3101-3109；Van Heeke和Schuster,1989,《生物化学杂志(J.Biol.Chem)》264,5503-5509，所述文献中的每一个文献均通过引用整体并入本文)等。pGEX载体也可以用于表达这些肽作为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，这种融合蛋白是可溶的，并且可以通过以下步骤从溶解的细胞中容易地纯化：吸附于谷胱甘肽-琼脂糖珠，然后在存在游离谷胱甘肽存在的情况下进行洗脱。pGEX载体被设计成包含凝血酶或Xa因子蛋白酶切割位点，以便可以从GST部分释放多肽。

可替代地，为了长期、高产量地生产适当加工的肽复合物，优选在哺乳动物细胞中稳定表达。可以通过使用含有可选标志物的载体来对稳定表达肽复合物的细胞系进行工程化。举例来说，在引入表达构建体后，可以使工程化的细胞在富集的培养基中生长1-2天，然后切换至选择性培养基。表达构建体中的可选标志物赋予对选择的抗性，并且最佳地允许细胞将表达构建体稳定地整合到其染色体中，并在培养物中生长，进而扩增到细胞系中。当连续表达肽时，此类细胞可以被培养很长一段时间。

可以在温度、孵育时间、光密度和培养基组成的标准条件下培养重组细胞。然而，重组细胞生长的条件可能与多肽表达的条件不同。经修饰的培养条件和培养基也可以用于增强肽的产生。例如，含有具有其同源启动子的肽的重组细胞可以暴露于热或其它环境胁迫或化学胁迫。可以应用本领域已知的任何技术来建立用于生产肽复合物的最佳条件。

在本发明的一个实施例中，在编码多肽的核苷酸序列的5'端添加了编码蛋氨酸的密码子，以提供用于启动肽翻译的信号。蛋氨酸可以保持与多肽的附接，或者可以通过添加一种或多种可以催化蛋氨酸从肽上切割的酶来除去蛋氨酸。例如，在原核生物和真核生物中，均通过蛋氨酸氨肽酶(MAP)来除去N端蛋氨酸(Tsunasawa等人,1985,《生物化学杂志》260,5382-5391，所述文献通过引用整体并入本文)。蛋氨酸氨基酶已从包含大肠杆菌、酵母和大鼠在内的几种生物体中分离并克隆。

可以通过已知方法从细菌、哺乳动物或其它宿主细胞类型或从培养基中回收肽(参见例如，《当代免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology)》,第2卷,第8章,Coligan等人(编者),约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons,Inc.)；《致病和临床微生物学：实验室手册(Pathogenic and Clinical Microbiology:A Laboratory Manual)》,Rowland等人,利特尔&布朗出版社(Little Brown&Co.),1994年六月，所述文献通过引用整体并入本文)。

前述两种方法都可以用于合成本文公开的多肽。例如，可以化学合成包括HSP结合肽的氨基酸序列的肽，并通过肽键将其连接至任选地通过重组DNA技术产生的抗原肽。

在本发明的范围内包含本文公开的多肽的衍生物或类似物，其在翻译期间或在翻译后例如通过糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化(例如，C端羧基)或通过已知的保护/封闭基团衍生化或通过蛋白水解切割进行修饰。可以通过已知技术进行多种化学修饰中的任何一种，所述已知技术包含但不限于可用于保护或修饰游离NH

5.4药物组合物

在另一方面，本公开提供了一种组合物(例如，药物组合物)，所述组合物包括一种或多种本文公开的多肽。在某些实施例中，本公开提供了一种组合物(例如，药物组合物)，所述组合物包括一种或多种(例如，两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、十种或更多种或20种或更多种)本文公开的不同多肽。在某些实施例中，本公开提供了一种组合物(例如，药物组合物)，所述组合物包括不超过30种本文公开的不同多肽。在某些实施例中，本公开提供了一种组合物(例如，药物组合物)，所述组合物包括1到30种(例如，2到20种、3到20种、4到20种、5到20种、5到15种或5到10种)本文公开的不同多肽。在某些实施例中，所述不同多肽各自包括相同的HSP结合肽和不同的抗原肽。

在某些实施例中，所述组合物进一步包括纯化的应激蛋白。这种组合物可用作疫苗调配物。还提供了一种用于制备疫苗的方法，所述方法包括将一种或多种本文公开的组合物与纯化的应激蛋白混合，以使纯化的应激蛋白与结合HSP的抗原缀合物或肽中的至少一种结合。

5.4.1与应激蛋白复合的多肽

在一个特定的方面，本公开提供了一种组合物(例如，药物组合物)，所述组合物包括一种或多种本文公开的多肽和纯化的应激蛋白。在某些实施例中，纯化的应激蛋白的至少一部分与组合物中的多肽结合。此类组合物可用作疫苗调配物，用于治疗癌症或病原微生物感染。

在某些实施例中，在与纯化的应激蛋白复合之前，可以在100％DMSO中由粉末重构多肽。然后可以将等摩尔量的肽合并在用无菌水稀释的75％DMSO溶液中。

在某些实施例中，在与纯化的应激蛋白复合之前，可以在中性水中重构多肽。

在某些实施例中，在与纯化的应激蛋白复合之前，可以在含有HCl的酸性水中重构多肽。

在某些实施例中，在与纯化的应激蛋白复合之前，可以在含有NaOH的碱性水中重构多肽。

在某些实施例中，在与纯化的应激蛋白复合之前，可以测试每种多肽在水中的溶解度。如果多肽可溶于中性水，则可以将中性水用作多肽的溶剂。如果多肽不溶于中性水，则可以测试多肽在含有HCl或其它酸(例如，乙酸、磷酸或硫酸)的酸性水中的溶解度。如果多肽可溶于含有HCl(或另一种酸)的酸性水中，则可以将含有HCl(或另一种酸)的酸性水用作多肽的溶剂。如果多肽不溶于含有HCl(或另一种酸)的酸性水中，则可以测试多肽在含有NaOH的碱性水中的溶解度。如果多肽可溶于含有NaOH的碱性水中，则可以将含有NaOH的碱性水用作多肽的溶剂。如果多肽不溶于含有NaOH的碱性水中，则可以将多肽溶解在DMSO中。如果多肽不溶于DMSO，则可以将多肽从疫苗中排除。然后可以将溶解的多肽混合以形成多肽库。溶解的多肽可以等体积混合。溶解的多肽可以等摩尔量混合。

在本发明的实践中有用的应激蛋白(在本文中也可互换称为热休克蛋白(HSP))可以选自能够结合其它蛋白或肽并能够在三磷酸腺苷(ATP)存在的情况下或在酸性条件下释放结合的蛋白质或肽的任何细胞蛋白质。当细胞暴露于应激刺激时，这种蛋白质的细胞内浓度可能会增加。除了受应激诱导的热休克蛋白外，HSP60、HSP70、HSP90、HSP100、sHSP和PDI家族还包含与应激诱导的HSP序列相似的蛋白，例如，大于35％的氨基酸同一性，但其表达水平不会因应激而改变。因此，应激蛋白或热休克蛋白包括与这些家族的成员具有至少35％(例如，至少40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99％)氨基酸同一性的蛋白质、突变体、类似物及其变体，这些家族的成员在压力刺激下的表达水平会增强。因此，在某些实施例中，应激蛋白是应激蛋白hsp60、hsp70或hsp90家族的成员(例如，Hsc70、人Hsc70)或其突变体、类似物或变体。在某些实施例中，应激蛋白选自由以下组成的组：hsc70、hsp70、hsp90、hsp110、grp170、gp96、钙网蛋白、其突变体以及其中两种或更多种的组合。在某些实施例中，应激蛋白是Hsc70(例如，人Hsc70)。在某些实施例中，应激蛋白是Hsp70(例如，人Hsp70)。在某些实施例中，应激蛋白(例如，人hsc70)是重组蛋白。

天然存在的HSP的氨基酸序列和核苷酸序列通常可在序列数据库(如GenBank)中获得。例如，智人热休克蛋白HSP70(热休克70kDa蛋白1A)具有以下标识符HGNC：5232；Entrez基因：3303；Ensembl：ENSG00000204389；OMIM：140550；UniProtKB：P08107和NCBI参考序列：NM_005345.5。可以使用计算机程序(如Entrez)浏览数据库，并按登录号检索所关注的任何氨基酸序列和基因序列数据。也可以使用如FASTA和BLAST等程序搜索这些数据库以识别与查询序列具有各种相似程度的序列，这些程序通过比对得分和统计数据对相似序列进行排名。可用于制备本发明的HSP肽结合片段的HSP的非限制性实例的核苷酸序列如下：人Hsp70，Genbank登录号NM_005345，Sargent等人,1989,《美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》,86:1968-1972；人Hsc70：Genbank登录号P11142，Y00371；人Hsp90，Genbank登录号X15183，Yamazaki等人,《核酸研究》17:7108；人gp96：Genbank登录号X15187，Maki等人,1990,《国家科学院院报(Proc.Natl.Acad Sci.)》,87:5658-5562；人BiP：Genbank登录号M19645；Ting等人,1988,《DNA》7:275-286；人Hsp27，Genbank登录号M24743；Hickey等人,1986,《核酸研究》14:4127-45；小鼠Hsp70：Genbank登录号M35021，Hunt等人,1990,《基因(Gene)》,87:199-204；小鼠gp96：Genbank登录号M16370，Srivastava等人,1987,《国家科学院院报》,85:3807-3811；以及小鼠BiP：Genbank登录号U16277，Haas等人,1988,《美国国家科学院院报》,85:2250-2254(所述文献中的每一个文献均通过引用整体并入本文)。

除了上述主要的应激蛋白家族外，内质网驻留蛋白钙网蛋白还被鉴定为另一种热休克蛋白，当与抗原分子复合时可用于引发免疫应答(Basu和Srivastava,1999,《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》189:797-202；所述文献通过引用整体并入本文)。可用于本发明的其它应激蛋白包含grp78(或BiP)、蛋白二硫键异构酶(PDI)、hsp110和grp170(Lin等人,1993,《分子细胞生物学(Mol.Biol.Cell)》,4:1109-1119；Wang等人,2001,《免疫学杂志》,165:490-497，所述文献中的每一个文献均通过引用整体并入本文)。随后发现这些家族中的许多成员响应其它压力刺激而被诱导，所述压力刺激包含营养缺乏、代谢破坏、氧自由基、缺氧和细胞内病原体感染(参见Welch,1993年五月,《科学美国人(Scientific American)》56-64；Young,1990,《免疫学年度评论(Annu.Rev.Immunol.)》8:401-420；Craig,1993,《科学(Science)》260:1902-1903；Gething等人,1992,《自然Nature)》355:33-45；以及Lindquist等人,1988,《遗传学年度评论(Annu.Rev.Genetics)》22:631-677，所述文献中的每一个文献均通过引用整体并入本文)。可以设想，属于所有这些家族的HSP/应激蛋白可以用于本发明的实践中。在某些实施例中，应激蛋白涵盖促进肽-MHC呈递的任何伴侣蛋白。合适的伴侣蛋白包含但不限于ER伴侣和胰蛋白酶(例如，人胰蛋白酶)。

主要的应激蛋白可以在受应激的细胞中积累到非常高的水平，但是它们在没有受到应激的细胞中以低到中等的水平出现。例如，高度诱导的哺乳动物hsp70在常温下几乎无法检测到，但在热休克时变成细胞中最活跃的合成蛋白之一(Welch等人,1985,《细胞生物学杂志(J.Cell.Biol.)》101:1198-1211，所述文献通过引用整体并入本文)。相比之下，hsp90和hsp60蛋白在大多数(但并非全部)哺乳动物细胞中在正常温度下含量很高，并且会进一步受热诱导(Lai等人,1984,《分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》4:2802-10；vanBergen en Henegouwen等人,1987,《基因与发育(Genes Dev.)》1:525-31，所述文献中的每一个文献均通过引用整体并入本文)。

在各个实施例中，可以在低至中等严格性条件下，通过与包括对HSP进行编码的核苷酸序列的探针杂交来鉴定并获得对热休克蛋白家族或热休克蛋白变体内的热休克蛋白进行编码的核苷酸序列。举例来说，使用这种低严格性条件的程序如下(还参见Shilo和Weinberg,1981,《美国国家科学院院报》78:6789-6792)。将含有DNA的滤膜在含有35％甲酰胺、5X SSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、5mM EDTA、0.1％PVP、0.1％Ficoll、1％BSA和500μg/ml变性鲑鱼精子DNA的溶液中于40℃下预处理6小时。在具有以下修饰的相同溶液中进行杂交：0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.2％BSA、100μg/ml鲑鱼精子DNA、10％(wt/vol)硫酸葡聚糖。将滤膜在杂交混合物中于40℃下孵育18-20小时，然后于55℃下在含有2x SSC、25mMTris-HCl(pH 7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS的溶液中洗涤1.5小时。用新鲜溶液代替洗涤溶液，并在60℃下再孵育1.5小时。将滤膜吸干并暴露以进行信号检测。如有必要，在检测信号之前，先在65-68℃下第三次清洗滤膜。可以使用的其它低严格性条件在本领域中是众所周知的(例如，用于物种间杂交)。

当使用应激蛋白时，也可以使用应激蛋白的肽结合片段及其功能活性衍生物、类似物和变体。因此，在某些实施例中，应激蛋白是全长HSP。在某些实施例中，应激蛋白是包括HSP(例如，Hsp60、Hsp70或Hsp90家族的成员，如Hsc70，具体地说，人Hsc70)的结构域的多肽，其中所述结构域能够与肽(例如，本文所述的HSP结合肽)非共价缔合以形成复合物并任选地引发免疫应答，并且其中应激蛋白不是全长HSP。

在某些实施例中，应激蛋白是能够与肽(例如，如本文所述的HSP结合肽)非共价缔合以形成复合物并任选地引发免疫应答的多肽，其中应激蛋白与野生型HSP(例如，Hsp60、Hsp70或Hsp90家族的成员，如Hsc70，具体地说，人Hsc70)具有高度的序列相似性。为了确定两个氨基酸序列或核酸序列之间的同一性区域，出于最佳比较目的将序列进行比对(例如，可以在第一氨基酸或核酸序列的序列中引入缺口以与第二氨基酸或核酸序列进行最佳比对)。然后将对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一序列中的位置被与在第二序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在所述位置处是相同的。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数量的函数(即，同一性％＝相同重叠位置数/位置总数×100％)。在一个实施例中，两个序列的长度相同。

两个序列之间的百分比同一性的确定也可以使用数学算法完成。用于比较两个序列的一种数学算法的非限制性实例是以下文献中算法：Karlin和Altschul,1990,《美国国家科学院院报》87:2264-2268，修改为Karlin和Altschul,1993,《美国国家科学院院报》90:5873-5877(所述文献中的每一个文献均通过引用整体并入本文)。这种算法被并入以下文献中的NBLAST和XBLAST程序中：Altschul等人,1990,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》215:403-410(所述文献通过引用整体并入本文)。可以用NBLAST程序(例如，得分＝100，字长＝12)执行BLAST核苷酸检索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序(例如，得分＝50，字长＝3)执行BLAST蛋白质检索，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有缺口的比对，可以如以下文献中所述利用有缺口的BLAST：Altschul等人,1997,《核酸研究》25:3389-3402。可替代地，可以使用PSI-Blast执行检测分子之间的距离关系的迭代检索(Altschul等人,1997,同上)。当利用BLAST、有缺口的BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用对应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。用于序列比较的一种数学算法的另一个非限制性实例是以下文献中算法：Myers和Miller,1988,《计算机在生物科学中的应用(CABIOS)》4:11-17。这种算法被并入ALIGN程序(第2.0版)中，所述程序是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表、缺口长度罚分12以及缺口罚分4。在容许或不容许缺口的情况下，可以使用类似于以上所描述的那些技术的技术，测定两个序列之间的同一性百分比。在计算同一性百分比时，通常仅对确切的匹配进行计数。

在某些实施例中，采用了应激蛋白(例如，Hsp70和Hsc70)的分离的肽结合结构域。可以通过计算机模拟应激蛋白(例如，Hsp70和Hsc70)的肽结合位点的三维结构来识别这些肽结合结构域。参见例如，在美国专利公开US2001/0034042中公开的HSP的肽结合片段(所述美国专利公开通过引用整体并入本文)。

在某些实施例中，应激蛋白是突变的应激蛋白，其对靶多肽的亲和力大于天然应激蛋白。当靶多肽被磷酸化或为磷酸肽模拟物(如不可水解的类似物)或具有一些其它翻译后修饰时，此类突变的应激蛋白可能是有用的。

可以通过从组织中纯化或通过重组DNA技术来制备应激蛋白。可以在ATP存在的情况下或在酸性条件下(pH 1到pH 6.9)从组织中纯化HSP，以随后在体外与一种或多种多肽复合。参见Peng等人,1997,《免疫学方法杂志》,204:13-21；Li和Srivastava,1993,《欧洲分子生物学学会杂志》12:3143-3151(所述文献中的每一个文献均通过引用整体并入本文)。“纯化的”应激蛋白基本上不含与细胞、细胞提取物、细胞培养基或个体中的蛋白质相关的物质。在某些实施例中，从组织纯化的应激蛋白是不同HSP的混合物，例如，hsp70和hsc70。

通过使用给定的HSP或其肽结合结构域的限定的氨基酸或cDNA序列，可以制备被转染到宿主细胞中并在宿主细胞中表达的遗传构建体。重组宿主细胞可以含有核酸序列的一个或多个拷贝，所述核酸序列包括对HSP或肽结合片段进行编码的序列，所述序列与驱动宿主细胞中HSP核酸序列表达的一个或多个调节区域可操作地连接。可以容易地使用重组DNA技术来产生重组HSP基因或HSP基因的片段，并且可以使用标准技术表达此类HSP基因片段。对HSP肽结合域进行编码的任何核酸序列(包含cDNA和基因组DNA)均可用于制备本发明的HSP或肽结合片段。核酸序列可以是野生型，或者可以是对相同氨基酸序列进行编码的密码子优化的变体。可以将含有肽结合结构域的HSP基因片段插入适当的克隆载体中，并引入宿主细胞中，从而产生基因序列的许多拷贝。可以使用本领域已知的大量载体-宿主系统，如但不限于噬菌体(如λ衍生物)或质粒(如pBR322、pUC质粒衍生物)、Bluescript载体(Stratagene)或pET系列载体(Novagen)。本领域已知的任何诱变技术均可用于修饰DNA序列中的个别核苷酸，目的是在经表达的肽序列中进行一个或多个氨基酸取代，或创建/删除限制性位点以促进另外的操作。

应激蛋白可以表达为融合蛋白，以促进从表达它们的细胞中回收和纯化。例如，应激蛋白可以含有信号序列前导肽，以指导其易位穿过内质网膜，从而分泌到培养基中。此外，应激蛋白可以含有与不参与结合靶多肽的蛋白质的任何部分(例如，羧基端)融合的亲和标记。通过与亲和伴侣分子结合，亲和标记可用于促进蛋白质的纯化。可以使用本领域中已知的多种亲和标记，其非限制性实例包含免疫球蛋白恒定区、多组氨酸序列(Petty,1996,“金属螯合物亲和色谱法(Metal-chelate affinity chromatography)”,《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》,第2卷,编者：Ausubel等人,格林出版协会和威利国际出版公司(Greene Publish.Assoc.&Wiley Interscience)，所述文献通过引用整体并入本文)、谷胱甘肽S-转移酶(GST；Smith,1993,《分子和细胞生物学方法(Methods Mol.Cell Bio.)》4:220-229，所述文献通过引用整体并入本文)、大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(Guan等人,1987,《基因》67:21-30，所述文献通过引用整体并入本文)和各种纤维素结合结构域(美国专利第5,496,934号；第5,202,247号；第5,137,819号；Tomme等人,1994,《蛋白质工程(Protein Eng.)》7:117-123，所述文献中的每一个文献均通过引用整体并入本文)。

可以测定此类重组应激蛋白的肽结合活性(参见例如，Klappa等人,1998,《欧洲分子生物学学会杂志》,17:927-935，所述文献通过引用整体并入本文)，以测定其免疫应答的能力。在某些实施例中，在宿主细胞中产生的重组应激蛋白与免疫原性组合物的预期受体(例如，人)具有相同的物种。

应激蛋白可以非共价或共价地与一种或多种多肽结合。在某些实施例中，应激蛋白非共价地结合至多肽。下文阐述了制备此类复合物的方法。

一种或多种多肽的总量与一种或多种应激蛋白的总量的摩尔比可以为约0.01:1到约100:1的任何比率，包含但不限于约0.01:1、0.02:1、0.05:1、0.1:1、0.2:1、0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、49:1至多100:1。在某些实施例中，组合物包括多种复合物，每种复合物均包括本文公开的多肽和应激蛋白，其中每种复合物中的多肽与应激蛋白的摩尔比为至少约1:1(例如，约1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、49:1至多100:1)。

在某些实施例中，一种或多种多肽的总量与一种或多种应激蛋白的总量的摩尔比为约0.5:1到5:1。在某些实施例中，一种或多种多肽的总量与一种或多种应激蛋白的总量的摩尔比为约1:1到2:1。在某些实施例中，一种或多种多肽的总量与一种或多种应激蛋白的总量的摩尔比为约1:1、1.25:1或1.5:1。这种比率(特别是接近1:1的比率)是有利的，因为该组合物不包括太多过量的未与应激蛋白结合的一种或多种游离肽。由于许多包括MHC结合表位的抗原肽往往包括疏水区，因此在组合物的制备和储存期间过量的一种或多种游离肽可能倾向于聚集。多肽与应激蛋白的高结合亲和力使得以接近1:1(例如，1:1、1.25:1、1.5:1或2:1)的一种或多种多肽的总量与一种或多种应激蛋白的总量的摩尔比与应激蛋白大量复合成为可能。因此，在某些实施例中，所述多肽以低于10

在某些实施例中，至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的应激蛋白与组合物中的多肽结合。在某些实施例中，基本上所有的应激蛋白都与组合物中的多肽结合。

如本文所公开的，单一组合物中可以包含任何数量的不同多肽。在某些实施例中，组合物包括不超过100种不同的多肽，例如2-50种、2-30种、2-20种、5-20种、5-15种、5-10种或10-15种不同的多肽。在某些实施例中，所述多肽中的每种多肽均包括相同的HSP结合肽和不同的抗原肽。在某些实施例中，组合物包括单一应激蛋白，其中所述应激蛋白能够结合至HSP结合肽。可以将本发明的药物组合物调配成含有一种或多种药学上可接受的载剂或赋形剂，所述赋形剂包含填充剂、稳定剂、缓冲剂、氯化钠、钙盐、表面活性剂、抗氧化剂、螯合剂、其它赋形剂及其组合。

在疫苗组合物的冻干调配物的制备中优选填充剂。此类填充剂形成冻干产物的结晶部分，并且可以选自由甘露醇、甘氨酸、丙氨酸和羟乙基淀粉(HES)组成的组。

稳定剂可以选自由蔗糖、海藻糖、棉子糖和精氨酸组成的组。这些试剂优选地以1-4％的量存在。氯化钠可以优选地以100-300mM的量被包含在本发明的调配物中，或者如果在不使用上述填充剂的情况下使用氯化钠，则氯化钠可以以介于300-500mM NaCl之间的量被包含在调配物中。钙盐包含氯化钙、葡萄糖酸钙、葡乳醛酸钙或葡庚糖酸钙。

缓冲剂可以是任何生理上可接受的化学实体或化学实体的组合，其具有充当缓冲液的能力，包含但不限于组氨酸、磷酸钾、TRIS[三-(羟甲基)-氨基甲烷]、BIS-Tris丙烷(1,3-双-[三-(羟甲基)甲基氨基]-丙烷)、PIPES[哌嗪-N,N'-双-(2-乙磺酸)]、MOPS[3-(N-吗啉代)乙磺酸]、HEPES(N-2-羟乙基-哌嗪-N'-2-乙磺酸)、MES[2-(N-吗啉代)乙磺酸]和ACES(N-2-乙酰氨基-2-氨基乙烷磺酸)。通常，以10-50mM的浓度包含缓冲剂。碱性缓冲液的具体实例包含：(i)PBS；(ii)10mM KPO

如果存在的话，表面活性剂的浓度优选为0.1％或更低，并且可以选自包含但不限于聚山梨酯20、聚山梨酯80、普朗尼克多元醇和BRIJ 35(聚氧乙烯23月桂醚)的组。如果使用抗氧化剂，则抗氧化剂必须与药物制剂相容，并且优选是水溶性的。合适的抗氧化剂包含高半胱氨酸、谷胱甘肽、硫辛酸、6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并-2-甲酸(Trolox)、蛋氨酸、硫代硫酸钠、铂、甘氨酸-甘氨酸-组氨酸(三肽)和丁基化羟基甲苯(BHT)。如果在组合物中使用钙盐，则螯合剂应优选地以比钙更大的亲和力结合金属(如铜和铁)。示例性螯合剂是去铁胺。

可以使用本领域已知的许多调配物。例如，美国专利第5,763,401号描述了一种治疗调配物，其包括15-60mM蔗糖、至多50mM NaCl、至多5mM氯化钙、65-400mM甘氨酸和至多50mM组氨酸。在一些实施例中，治疗调配物是9％蔗糖于磷酸钾缓冲液中的溶液。

美国专利第5,733,873号(通过引用整体并入本文)公开了包含0.01-1mg/ml表面活性剂的调配物。该专利公开了具有以下范围的赋形剂的调配物：聚山梨酯20或80的量至少为0.01mg/ml，优选为0.02-1.0mg/ml；至少0.1M NaCl；至少0.5mM钙盐；和至少1mM组氨酸。更特别地，还公开了以下具体调配物：(1)14.7-50-65mM组氨酸、0.31-0.6M NaCl、4mM氯化钙、0.001-0.02-0.025％聚山梨酯80(有或没有0.1％PEG 4000)或19.9mM蔗糖；以及(2)20mg/ml甘露醇、2.67mg/ml组氨酸、18mg/ml NaCl、3.7mM氯化钙和0.23mg/ml聚山梨酯80。

已经描述了低或高浓度氯化钠的用途，例如美国专利第4,877,608号(通过引用整体并入本文)教导了具有相对较低浓度的氯化钠的调配物，如包括0.5mM-15mM NaCl、5mM氯化钙、0.2mM-5mM组氨酸、0.01-10mM赖氨酸盐酸盐和至多10％麦芽糖、10％蔗糖或5％甘露醇的调配物。

美国专利第5,605,884号(通过引用整体并入本文)教导了具有相对较高浓度的氯化钠的调配物的用途。这些调配物包含0.35M-1.2M NaCl、1.5-40mM氯化钙、1mM-50mM组氨酸和至多10％的糖(如甘露醇、蔗糖或麦芽糖)。举例说明了包括0.45M NaCl、2.3mM氯化钙和1.4mM组氨酸的调配物。

国际专利申请WO 96/22107(通过引用整体并入本文)描述了包含海藻糖的调配物，例如包括以下物质的调配物：(1)0.1M NaCl、15mM氯化钙、15mM组氨酸和1.27M(48％)海藻糖；或(2)0.011％的氯化钙、0.12％的组氨酸、0.002％的TRIS、0.002％的Tween 80、0.004％的PEG 3350、7.5％的海藻糖；以及0.13％或1.03％的NaCl。

美国专利第5,328,694号(通过引用整体并入本文)描述了包含100-650mM二糖和100mM-1.0M氨基酸(例如(1)0.9M蔗糖、0.25M甘氨酸、0.25M赖氨酸和3mM氯化钙；以及(2)0.7M蔗糖、0.5M甘氨酸和5mM氯化钙)的调配物。药物组合物可以任选地制备为冻干产物，然后可以配制用于口服施用或重构为液体形式用于肠胃外施用。

在某些实施例中，在施用组合物的受试者中，所述组合物刺激针对表达或展示包括一个或多个MHC结合表位的多肽的细胞的T细胞应答。表达多肽的细胞可以是包括编码所述多肽的多核苷酸的细胞，其中所述多核苷酸位于所述细胞的基因组中、在附加型载体中或在已经感染所述细胞的病毒的基因组中。展示多肽的细胞可以不包括编码所述多肽的多核苷酸，并且可以通过使细胞与多肽或其衍生物接触而产生。

在某些实施例中，所述组合物诱导从受试者分离的外周血单核细胞(PBMC)中的T细胞的体外活化。T细胞的体外活化包含但不限于：T细胞的体外增殖、从T细胞产生细胞因子(例如，IFNγ)以及T细胞上活化标志物(例如，CD25、CD45RO)的表面表达增加。

5.4.2多肽和应激蛋白复合物的制备

在另一方面，本公开提供了一种制备疫苗的方法，所述方法包括在合适的条件下在体外将一种或多种本文公开的多肽与纯化的应激蛋白混合，以使所述纯化的应激蛋白结合所述多肽中的至少一种多肽。所述方法在本文中也被称为复合反应。在某些实施例中，使用两种或更多种纯化的应激蛋白，其中每种纯化的应激蛋白结合所述多肽中的至少一种多肽。

应激蛋白可以非共价或共价地与多肽结合。在某些实施例中，应激蛋白非共价地结合至多肽。在各个实施例中，任选地纯化体外形成的复合物。纯化的应激蛋白和多肽复合物基本上不含与细胞或细胞提取物中的此类复合物相关的物质。在体外复合反应中使用纯化的应激蛋白和纯化的多肽的情况下，术语“一种或多种纯化的复合物”不排除还包括不在复合物中的游离应激蛋白和缀合物或肽的组合物。

上文描述的任何应激蛋白都可以用于本发明的方法。在某些实施例中，应激蛋白选自由以下组成的组：Hsc70、Hsp70、Hsp90、Hsp110、Grp170、Gp96、钙网蛋白、其突变体以及其中两种或更多种的组合。在一个实施例中，应激蛋白是Hsc70，例如，人Hsc70。在另一个实施例中，应激蛋白是Hsp70，例如，人Hsp70。在某些实施例中，应激蛋白(例如，Hsc70或人Hsp70)是重组蛋白。

在复合之前，可以用ATP对HSP进行预处理或使其暴露于酸性条件下，以除去可能与所关注的HSP非共价缔合的任何肽。酸性条件是低于pH 7的任何pH水平，包含以下范围：pH 1-pH 2、pH 2-pH 3、pH 3-pH 4、pH 4-pH 5、pH 5-pH 6和pH 6-pH 6.9。当使用ATP程序时，通过添加木聚糖酶从制剂中除去过量的ATP，如以下文献所述：Levy等人,1991,《细胞学》67:265-274(通过引用整体并入本文)。当使用酸性条件时，可以通过添加pH调节剂将缓冲液重新调节至中性pH。

一种或多种多肽的总量与一种或多种应激蛋白的总量的摩尔比可以为0.01:1到100:1的任何比率，包含但不限于0.01:1、0.02:1、0.05:1、0.1:1、0.2:1、0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、49:1至多100:1。在某些实施例中，待制备的组合物包括多种复合物，每种复合物均包括本文公开的多肽和应激蛋白，并且所述复合反应包括将所述多肽与所述应激蛋白混合，其中每种复合物中的多肽与应激蛋白的摩尔比为至少1:1(例如，约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、49:1至多100:1)。

在某些实施例中，一种或多种多肽的总量与一种或多种应激蛋白的总量的摩尔比为约0.5:1到5:1。在某些实施例中，一种或多种多肽的总量与一种或多种应激蛋白的总量的摩尔比为约1:1到2:1。在某些实施例中，一种或多种多肽的总量与一种或多种应激蛋白的总量的摩尔比为约1:1、1.25:1或1.5:1。这种比率(特别是接近1:1的比率)是有利的，因为该组合物不包括太多过量的未与应激蛋白结合的一种或多种游离肽。由于许多包括MHC结合表位的抗原肽往往包括疏水区，因此在组合物的制备和储存期间过量的一种或多种游离肽可能倾向于聚集。多肽与应激蛋白的高结合亲和力使得以接近1:1(例如，1:1、1.25:1、1.5:1或2:1)的一种或多种多肽的总量与一种或多种应激蛋白的总量的摩尔比与应激蛋白大量复合成为可能。在某些实施例中，复合反应中所使用的多肽以低于10

本文公开的方法可以用于制备大量(例如，大于或等于30mg、50mg、100mg、200mg、300mg、500mg或1g总肽和蛋白质)的组合物(例如，药物组合物或疫苗)。然后可以将制备的组合物转移到单性或多次使用的容器中，或分配给单位剂型。可替代地，本文公开的方法可以用于制备少量(例如，小于或等于300μg、1mg、3mg、10mg、30mg或100m总肽和蛋白质)的组合物(例如，药物组合物或疫苗)。在某些实施例中，将组合物制备用于单次使用，任选地为单位剂型。

在某些实施例中，药物组合物中的一种或多种多肽和应激蛋白的总量为约10μg到600μg(例如，约50μg、100μg、200μg、300μg、400μg或500μg)。在某些实施例中，药物组合物中的一种或多种多肽和应激蛋白的总量为约300μg。下文公开了单位剂型中的一种或多种应激蛋白和一种或多种多肽的量。

本文提供了用于在体外将多肽群体与应激蛋白非共价复合的示例性方案。多肽群体可以包括本发明的不同多肽物种的混合物。然后，将混合物与纯化和/或预处理的应激蛋白一起在合适的结合缓冲液中于4℃至50℃(例如，37℃)下孵育15分钟到3小时(例如，1小时)，所述合适的结合缓冲液为：如pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水，其任选地补充有0.01％的聚山梨酯20；在磷酸钾缓冲液中包括9％蔗糖的缓冲液；包括2.7mM磷酸氢二钠、1.5mM磷酸氢二钾、150mM NaCl的缓冲液，pH 7.2；含有20mM磷酸钠(pH 7.2-7.5)、350-500mM NaCl、3mMMgCl

可以在施用于受试者之前制备来自分开的共价和/或非共价复合反应的应激蛋白和多肽的复合物，以形成组合物。在某些实施例中，在施用于受试者之前1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天内制备组合物。在某些实施例中，在施用于受试者之前1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8天内制备组合物。在某些实施例中，在施用于受试者之前1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月内制备组合物。在制备后和使用前，可以任选地在约4℃、-20℃或-80℃下保存组合物。

在某些实施例中，在即将施用于患者之前，将通过本文公开的方法制备的复合物在病床旁与佐剂混合。在某些实施例中，所述佐剂包括皂苷或免疫刺激性核酸。在某些实施例中，所述佐剂包括QS-21。在某些实施例中，QS-21的剂量为10μg、25μg或50μg。在某些实施例中，QS-21的剂量为50μg。在某些实施例中，所述佐剂包括TLR激动剂。在某些实施例中，所述TRL激动剂是TLR4的激动剂。在某些实施例中，所述TRL激动剂是TLR7和/或TLR8的激动剂。在某些实施例中，所述TRL激动剂是TLR9的激动剂。在某些实施例中，所述TRL激动剂是TLR5的激动剂。

作为制备应激蛋白和多肽的非共价复合物的替代方案，可以例如通过化学交联或UV交联将多肽共价附接至应激蛋白。可以使用本领域已知的任何化学交联或UV交联方法(参见例如，Wong,1991，《蛋白质结合和交联化学》,CRC出版社，所述文献通过引用整体并入本文)。例如，可以使用戊二醛交联(参见例如，Barrios等人,1992,《欧洲免疫学杂志》22:1365-1372，所述文献通过引用整体并入本文)。在示例性方案中，在存在0.002％戊二醛的情况下，将1-2mg的HSP-肽复合物交联2小时。通过对磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析过夜，除去戊二醛(Lussow等人,1991,《欧洲免疫学杂志》21:2297-2302，所述文献通过引用整体并入本文)。

5.4.3疫苗

本文公开的组合物可用作疫苗。因此，在另一方面，本公开提供了一种疫苗调配物。可以通过产生稳定、无菌、优选地可注射调配物的任何方法制备疫苗调配物。

在某些实施例中，疫苗包括一种或多种本文公开的组合物和一种或多种佐剂。可以使用多种佐剂，包含例如全身性佐剂和粘膜佐剂。全身性佐剂是可以肠胃外递送的佐剂。全身性佐剂包含产生长效作用的佐剂、刺激免疫系统的佐剂和同时实现这两种的佐剂。

产生长效作用的佐剂是使抗原在体内缓慢释放从而延长免疫细胞对抗原的暴露的佐剂。这类佐剂包含明矾(例如，氢氧化铝、磷酸铝)；或乳剂类调配物，包含矿物油、非矿物油、油包水或油包水油乳剂、水包油乳剂，如Sepan ISA系列的Montanide佐剂(例如，Montanide ISA 720，AirLiquide，法国巴黎)；MF-59(一种用Span 85和Tween 80稳定的水包角鲨烯乳剂；Chiron公司，埃默里维尔，加利福尼亚州)；和PROVAX(一种含有稳定洗涤剂和胶束形成剂的水包油乳剂；IDEC制药公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)。

其它佐剂刺激免疫系统，例如，引起免疫细胞产生并分泌细胞因子或IgG。这类佐剂包含免疫刺激性核酸，如CpG寡核苷酸；从皂角树的树皮中纯化的皂苷，如QS-21；聚[二(羧甲基苯氧基)磷腈(PCPP聚合物；美国病毒研究所)；RNA模拟物，如聚肌苷酸:聚胞苷酸(poly I:C)或用聚赖氨酸稳定的poly I:C(poly-ICLC[

其它全身性佐剂是产生长效作用并刺激免疫系统的佐剂。这些化合物具有全身性佐剂的上述两种功能。这类佐剂包含但不限于ISCOM(免疫刺激性复合物，其含有混合的皂苷、脂质，并形成具有可容纳抗原的孔的病毒大小的颗粒；CSL，墨尔本，澳大利亚)；AS01，其是含有MPL和QS-21的基于脂质体的调配物(GlaxoSmithKline，比利时)；AS02(GlaxoSmithKline，其是含有MPL和QS-21的水包油乳剂：GlaxoSmithKline，里克森萨特，比利时)；AS04(GlaxoSmithKline，包含有明矾和MPL；GSK，比利时)；AS15，其是含有CpG寡核苷酸、MPL和QS-21的基于脂质体的调配物(GlaxoSmithKline，比利时)；形成胶束的非离子嵌段共聚物，如CRL 1005(其含有侧接聚氧乙烯链的疏水性聚氧丙烯线性链；Vaxcel,Inc.，诺克罗斯，乔治亚州)；以及Syntex佐剂调配物(SAF，一种含有Tween 80和非离子嵌段共聚物的水包油乳剂；Syntex Chemicals,Inc.，博尔德，科罗拉多州)。

根据本发明可用的粘膜佐剂是当与本发明的复合物一起施用于粘膜表面时能够在受试者中诱导粘膜免疫应答的佐剂。粘膜佐剂包含CpG核酸(例如，PCT公开专利申请WO99/61056，其通过引用整体并入本文)、细菌毒素：例如，霍乱毒素(CT)、CT衍生物，包含但不限于CT B亚基(CTB)；CTD53(Val到Asp)；CTK97(Val到Lys)；CTK104(Tyr到Lys)；CTD53/K63(Val到Asp、Ser到Lys)；CTH54(Arg到His)；CTN107(His到Asn)；CTE114(Ser到Glu)；CTE112K(Glu到Lys)；CTS61F(Ser到Phe)；CTS 106(Pro到Lys)；CTK63(Ser到Lys)、闭合带状带毒素(zot)、大肠杆菌热不稳定肠毒素、不稳定毒素(LT)、LT衍生物，包含但不限于LT B亚基(LTB)；LT7K(Arg到Lys)；LT61F(Ser到Phe)；LT112K(Glu到Lys)；LT118E(Gly到Glu)；LT146E(Arg到Glu)；LT192G(Arg到Gly)；LTK63(Ser到Lys)；和LTR72(Ala到Arg)、百日咳毒素，PT，包含PT-9K/129G；毒素衍生物(见下文)；脂质A衍生物(例如，单磷酰基脂质A，MPL)；胞壁酰二肽(MDP)衍生物；细菌外膜蛋白(例如，伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)的外表面蛋白A(OspA)脂蛋白、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的外膜蛋白)；水包油乳剂(例如，MF59；铝盐(Isaka等人,1998,1999)；和皂苷(例，例如QS-21，例如QS-21

在某些实施例中，添加至本文公开的组合物中的佐剂包括皂苷和/或免疫刺激性核酸。在某些实施例中，添加至组合物中的佐剂包括或进一步包括QS-21。

在某些实施例中，添加至本文公开的组合物中的佐剂包括Toll样受体(TLR)激动剂。在某些实施例中，所述TRL激动剂是TLR4的激动剂。在某些实施例中，所述TRL激动剂是TLR7和/或TLR8的激动剂。在某些实施例中，所述TRL激动剂是TLR9的激动剂。在某些实施例中，所述TRL激动剂是TLR5的激动剂。

本文所述的本发明的组合物可以几种方式与佐剂组合。例如，可以将不同的多肽首先混合在一起以形成混合物，然后与一种或多种应激蛋白和/或一种或多种佐剂复合以形成组合物。作为另一个实例，不同的多肽可以分别与应激蛋白和/或一种或多种佐剂复合，然后可以将所得的复合物按批次混合以形成组合物。

可以在施用包括应激蛋白和多肽的复合物的组合物之前、期间或之后施用佐剂。可以在相同或不同的施用部位施用佐剂和组合物。

5.4.4单位剂型

在另一方面，本公开提供了一种本文公开的药物组合物或疫苗的单位剂型。

根据多肽、应激蛋白和/或佐剂的化学性质和效力，可以改变发挥本发明疫苗调配物功效的多肽、应激蛋白和/或佐剂的量和浓度。通常，疫苗调配物中的起始量和浓度是使用常规施用途径(例如，肌内注射)通常用于引发期望的免疫应答的起始量和浓度。然后可以例如通过使用稀释剂进行稀释来调节肽、缀合物、应激蛋白和/或佐剂的量和浓度，以便如本领域已知的标准方法所评估的那样获得有效的保护性免疫应答(例如，通过相对于对照调配物的对疫苗调配物的抗体或T细胞应答来确定)。

在某些实施例中，药物组合物中的多肽和应激蛋白的总量为约10μg到600μg(例如，约50μg、100μg、200μg、300μg、400μg或500μg)。在某些实施例中，药物组合物中的多肽和应激蛋白的总量为约300μg。在某些实施例中，组合物中的应激蛋白的量为约250μg到290μg。

在某些实施例中，药物组合物中的应激蛋白的量为约10μg到600μg(例如，约50μg、100μg、200μg、300μg、400μg或500μg)。在某些实施例中，药物组合物中的应激蛋白的量为约300μg。基于指定的摩尔比和多肽的分子量来计算多肽的量。

在某些实施例中，药物组合物的单位剂型中的多肽的总摩尔量为约0.1到10nmol(例如，约0.1nmol、0.5nmol、1nmol、2nmol、3nmol、4nmol、5nmol、6nmol、7nmol、8nmol、9nmol或10nmol)。在某些实施例中，药物组合物的单位剂型中的多肽的总摩尔量为约4nmol。在某些实施例中，药物组合物的单位剂型中的多肽的总摩尔量为约5nmol。

总多肽与总应激蛋白的摩尔比可以为约0.01:1到约100:1的任何比率，包含但不限于约0.01:1、0.02:1、0.05:1、0.1:1、0.2:1、0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、49:1至多100:1。在某些实施例中，组合物包括多种复合物，每种复合物均包括多肽和应激蛋白，其中每种复合物中的多肽与应激蛋白的摩尔比为至少约1:1(例如，约1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、49:1至多100:1)。在某些实施例中，一种或多种多肽的总量与一种或多种应激蛋白的总量的摩尔比为约0.5:1到5:1。

在某些实施例中，一种或多种多肽的总量与一种或多种应激蛋白的总量的摩尔比为约1:1到2:1。在某些实施例中，一种或多种多肽的总量与一种或多种应激蛋白的总量的摩尔比为约1:1、1.25:1或1.5:1。这种比率(特别是接近1:1的比率)是有利的，因为该组合物不包括太多过量的未与应激蛋白结合的一种或多种游离肽。由于许多包括MHC结合表位的抗原肽往往包括疏水区，因此在组合物的制备和储存期间过量的一种或多种游离肽可能倾向于聚集。多肽与应激蛋白的高结合亲和力使得以接近1:1(例如，1:1、1.25:1、1.5:1或2:1)的一种或多种多肽的总量与一种或多种应激蛋白的总量的摩尔比与应激蛋白大量复合成为可能。因此，在某些实施例中，所述多肽以低于10

提供了计算单位剂型中组分的量的方法。例如，在某些实施例中，多肽具有约3kD的平均分子量，并且Hsc70的分子量为约71kD。假设在一个实施例中，药物组合物中的多肽和应激蛋白的总量为300μg，并且多肽与hsc70的摩尔比为1.5:1。Hsc70的摩尔量可以计算为300μg除以71kD+1.5×3kD，得到约4.0nmol，并且Hsc70的质量可以通过将摩尔量乘以71kD来计算，得到约280kD。多肽的总摩尔量可以计算为1.5×4.0nmol，得到6.0nmol。如果使用10种不同的多肽，则每种多肽的摩尔量为0.60nmol。假设在另一个实施例中，打算将300μg剂量的Hsc70包含在单位剂型中，并且多肽与Hsc70的摩尔比为1.5:1。多肽的总摩尔量可以计算为300μg除以71kD，然后乘以1.5，得到6.3nmol。如果使用10种不同的多肽，则每种多肽的摩尔量为0.63nmol。在一个或多个变量与实例中的变量不同的情况下，应激蛋白和多肽的量相应地按比例缩放。

进一步应理解的是，单位剂型可以任选地包括一种或多种如上所公开的佐剂。在某些实施例中，所述佐剂包括皂苷和/或免疫刺激性核酸。在某些实施例中，所述佐剂包括或进一步包括QS-21。在某些实施例中，药物组合物的单位剂型中的QS-21的量为10μg、25μg或50μg。在某些实施例中，药物组合物的单位剂型中的QS-21的量为50μg。在某些实施例中，所述佐剂包括Toll样受体(TLR)激动剂。在某些实施例中，所述TRL激动剂是TLR4的激动剂。在某些实施例中，所述TRL激动剂是TLR7和/或TLR8的激动剂。在某些实施例中，所述TRL激动剂是TLR9的激动剂。在某些实施例中，所述TRL激动剂是TLR5的激动剂。

5.5使用方法

本文公开的组合物(例如，药物组合物)、疫苗调配物和单位剂型可用于诱导细胞免疫应答。应激蛋白可以通过膜蛋白受体(主要是CD91)或通过与Toll样受体结合，通过抗原呈递细胞(APC)(例如巨噬细胞和树突状细胞(DC))中的交叉呈递途径递送免疫原性肽，从而导致CD8

因此，在一方面，本公开提供了一种在受试者中诱导对抗原肽的细胞免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文公开的组合物、疫苗调配物或单位剂型。在另一方面，本公开提供了一种在受试者中治疗疾病(例如，癌症或感染)的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文公开的组合物、疫苗调配物或单位剂型。本文公开的组合物(例如，药物组合物)、疫苗调配物和单位剂型也可以用于制备用于治疗受试者的药物或疫苗。

在各个实施例中，此类受试者可以是动物，例如，哺乳动物、非人灵长类动物和人。术语“动物”包含陪伴动物，如猫和狗；动物园里的动物；野生动物，包含鹿、狐狸和浣熊；农场动物、牲畜和家禽，包含马、牛、绵羊、猪、火鸡、鸭和鸡；以及实验动物，如啮齿动物、兔子和豚鼠。在某些实施例中，所述受试者患有癌症。在某些实施例中，所述受试者患有病原微生物感染。

5.5.1癌症的治疗

本发明的组合物、疫苗调配物或单位剂型可以单独使用或与其它用于治疗癌症的疗法组合使用。一种或多种结合HSP的抗原缀合物或一种或多种肽中的一个或多个MHC结合表位可以存在于受试者的癌细胞中。在某些实施例中，一个或多个MHC结合表位对于癌症的类型和/或阶段是常见的或经常发现的。如本文所使用的，术语“在癌症中经常发现”是指一个或多个在大于5％的癌症中发现的突变的MHC结合表位。在某些实施例中，一个或多个MHC结合表位对受试者的癌症是特异性的。

可以使用本发明的组合物、疫苗调配物或单位剂型治疗的癌症包含但不限于实体瘤、血液癌(例如，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤，例如，多发性骨髓瘤)和转移性病变。在一实施例中，癌症是实体瘤。实体瘤的实例包含恶性肿瘤，例如，肉瘤和癌变，例如，各种器官系统的腺癌，如影响肺、乳腺、卵巢、淋巴、胃肠道(例如，结肠)、肛门、生殖器和泌尿生殖道(例如，肾、尿路上皮、膀胱细胞、前列腺)、咽、CNS(例如，大脑、神经或神经胶质细胞)、头颈部、皮肤(例如，黑色素瘤)和胰腺的腺癌，以及包含恶性肿瘤的腺癌，如结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌或小细胞肺癌)、小肠癌和食道癌。癌症可以是早期癌症、中期癌症、晚期癌症或转移性癌症。在某些实施例中，癌症与PD-1活性升高(例如，PD-1表达升高)有关。

在一个实施例中，所述癌症选自肺癌(例如，肺腺癌或非小细胞肺癌(NSCLC)(例如，具有鳞状和/或非鳞状组织学的NSCLC或NSCLC腺癌))、黑色素瘤(例如，晚期黑色素瘤)、肾癌(例如，肾细胞癌)、肝癌(例如，肝细胞癌或肝内胆管细胞癌)、骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤)、前列腺癌、乳腺癌(例如，一种不表达雌激素受体、孕激素受体或Her2/neu中的一种、两种或全部的乳腺癌，例如，三阴性乳腺癌)、卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌、头颈癌(例如，头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、肛门癌、胃食管癌(例如，食道鳞状细胞癌)、间皮瘤、鼻咽癌、甲状腺癌、宫颈癌、上皮癌、腹膜癌或淋巴增生性疾病(例如(例如，移植后的淋巴增生性疾病)。在一个实施例中，所述癌症是NSCLC。在一个实施例中，所述癌症是肾细胞癌。在一个实施例中，所述癌症是卵巢癌，任选地其中所述卵巢癌与人乳头瘤病毒(HPV)感染有关。在一个具体的实施例中，所述卵巢癌是铂难治性卵巢癌。

在一个实施例中，所述癌症是血液学癌症，例如，白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一个实施例中，所述癌症是白血病，例如，急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性髓样白血病(CML)、慢性粒细胞性白血病(CMML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)或毛细胞白血病。在一个实施例中，所述癌症是淋巴瘤，例如，B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、活化的B细胞样(ABC)弥漫性大B细胞淋巴瘤、生发中心B细胞(GCB)弥散性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、复发性非霍奇金淋巴瘤、难治性非霍奇金淋巴瘤、复发性滤泡性非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤或结外边缘区淋巴瘤。在一实施例中，所述癌症是骨髓瘤，例如，多发性骨髓瘤。

在另一个实施例中，所述癌症选自癌(例如，晚期或转移性癌)、黑色素瘤或肺癌，例如，非小细胞肺癌。

在一个实施例中，所述癌症是肺癌，例如，肺腺癌、非小细胞肺癌或小细胞肺癌。

在一个实施例中，所述癌症是黑色素瘤，例如，晚期黑色素瘤。在一个实施例中，所述癌症是一种对其它疗法无反应的晚期或不可切除的黑色素瘤。在其它实施例中，所述癌症是具有BRAF突变(例如，BRAF V600突变)的黑色素瘤。在其它实施例中，在用抗CTLA-4抗体(例如，易普利姆玛)与(任选的)BRAF抑制剂(例如，维拉非尼或达布拉非尼)治疗后施用本文公开的组合物、疫苗调配物或单位剂型。

在另一个实施例中，所述癌症是具有或没有病毒感染(例如，慢性病毒性肝炎)的肝癌，例如，晚期肝癌。

在另一个实施例中，所述癌症是前列腺癌，例如，晚期前列腺癌。

在又另一个实施例中，所述癌症是骨髓瘤，例如，多发性骨髓瘤。

在另一个实施例中，所述癌症是肾癌，例如，肾细胞癌(RCC)(例如，转移性RCC、透明细胞肾细胞癌(CCRCC)或肾乳头状细胞癌)。

在又另一个实施例中，所述癌症选自肺癌、黑色素瘤、肾癌、乳腺癌、结肠直肠癌、白血病或癌症的转移性病变。

可以在检测到癌症时、或在复发发作之前或期间施用本发明的组合物、疫苗调配物或单位剂型。

可以在癌症或复发的第一个迹象时开始施用，然后增加剂量，直到至少症状基本减轻，并持续此后一段时间。

在一些实施例中，可以将组合物施用于经历肿瘤切除手术的癌症受试者，所述手术导致经切除的肿瘤组织的量不足(例如，小于7g、小于6g、小于5g、小于4g、小于3g、小于2g或小于1g的经切除的肿瘤组织)，从而无法产生治疗有效量的自体癌症疫苗，所述疫苗包括从经切除的肿瘤组织中收集的代表性抗原集。参见例如，以下文献中描述的癌症疫苗：《生物治疗专家意见(Expert Opin.Biol.Ther.)》2009年二月；9(2):179-86；所述文献通过引用并入本文。

本发明的组合物、疫苗调配物和单位剂型也可以用于针对癌症复发进行免疫。预防性地向个体施用组合物可以赋予针对未来癌症复发的保护。

5.5.2感染的治疗

本发明的组合物、疫苗调配物或单位剂型可以单独使用或与其它用于治疗微生物感染(例如，病原性微生物感染)的疗法组合使用。可以从微生物中鉴定出一种或多种结合HSP的抗原缀合物或一种或多种肽中的一个或多个MHC结合表位。在某些实施例中，一个或多个MHC结合表位存在于微生物或被所述微生物感染的细胞的表面处。

可以使用本发明的组合物、疫苗调配物或单位剂型治疗的感染包含但不限于病毒感染、细菌感染、真菌感染、原生动物感染或寄生虫感染。

可以通过本文公开的组合物、疫苗调配物或单位剂型治疗的病毒感染包含但不限于由以下引起的病毒感染：A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、流行性感冒(例如，A型或B型流行性感冒)、水痘、腺病毒、I型单纯疱疹(HSV-I)、II型单纯疱疹(HSV-II)、牛瘟、鼻病毒、埃可病毒、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、乳头瘤病毒(例如，人类乳头瘤病毒(HPV))、乳多空病毒、巨细胞病毒、棘皮病毒、虫媒病毒、汉坦病毒、柯萨奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、I型人类免疫缺陷病毒(HIV-I)、II型人类免疫缺陷病毒(HIV-II)、登革热病毒、天花病毒、狂犬病病毒、狂犬病病毒和寨卡病毒。可以根据本文所述方法治疗的由这些病毒中的任何病毒引起的病毒性疾病包含但不限于发烧、免疫缺陷、病毒性脑膜炎和脑炎。

可以通过本文公开的组合物、疫苗调配物或单位剂型治疗的细菌感染包含但不限于由以下引起的感染：大肠杆菌、克雷伯氏肺炎菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、普通变形杆菌、草绿色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。可以根据本文所述方法治疗的由这些细菌中的任何细菌引起的细菌性疾病包含但不限于立克次氏体分支杆菌(Mycobacteria rickettsia)、支原体、奈瑟氏球菌、肺炎链球菌、伯氏疏螺旋体(莱姆病)、厌食芽孢杆菌(炭疽)、破伤风、链球菌、葡萄球菌、分枝杆菌、百日咳、霍乱、鼠疫、白喉、衣原体、金黄色葡萄球菌和军团菌。

可以通过本文公开的组合物、疫苗调配物或单位剂型治疗的真菌感染包含但不限于由以下引起的感染：念珠菌(例如，光滑念珠菌)、卡氏肺孢菌、镰胞菌角膜炎、球孢子菌、黑曲霉菌、新型隐球菌和膝曲弯孢霉菌。可以根据本文所述方法治疗的由这些细菌中的任何细菌引起的真菌性疾病包含但不限于接合菌病、念珠菌乳腺炎(Candida mastitis)、具有潜伏性trichosporonemia的进行性播散性毛孢子菌病、播散性念珠菌病、肺副球孢子菌病、肺曲霉病、卡氏肺囊虫肺炎(Pneumocystis carinii pneumonia)、隐球菌性脑膜炎、球孢子菌脑膜脑炎(coccidioidal meningoencephalitis)和脑脊髓血管炎、鼻旁窦霉菌病、烟曲霉性心内膜炎(Aspergillus fumigatus endocarditis)、胫骨软骨发育不良、光滑念珠菌阴道炎(Candida glabrata vaginitis)、口咽念珠菌病、X连锁慢性肉芽肿病、足癣、皮肤念珠菌病、霉菌性胎盘炎、播散性毛孢子菌病、过敏性支气管肺曲霉病、霉菌性角膜炎、菌性腹膜炎、葡萄球菌眼内炎、孢子丝菌病和皮肤真菌病。

可以通过本文公开的组合物、疫苗调配物或单位剂型治疗的原生动物感染包含但不限于由以下引起的感染：利什曼原虫、球虫、锥虫血吸虫和疟疾。

可以通过本文公开的组合物、疫苗调配物或单位剂型治疗的寄生虫感染包含但不限于由衣原体和立克次氏体引起的感染。

本发明的组合物、疫苗调配物或单位剂型可用于针对通过本领域已知的任何医学方法诊断出患有感染的受试者进行免疫。所述组合物、疫苗调配物或单位剂型可用于针对已暴露于病原微生物、将暴露于病原微生物或以其它方式具有感染传染病高风险的受试者进行免疫，以进行预防。

5.5.3组合疗法

组合疗法是指本发明的组合物、疫苗调配物或单位剂型作为第一药征(modality)与第二药征一起用于治疗癌症或感染的用途。因此，在某些实施例中，本公开提供了一种如本文所公开的在受试者中诱导对抗原肽的细胞免疫应答的方法，或一种如本文所公开的在受试者中治疗疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的(a)本文公开的组合物、疫苗调配物或单位剂型以及(b)第二药征。

在一个实施例中，第二药征是非HSP药征，例如，不包括HSP作为组分的药征。这种方法通常被称为组合疗法、辅助疗法或联合疗法(这些术语可以互换使用)。通过组合疗法，可以观察到加成效力或加成治疗效果。在治疗效力大于加成性的情况下寻求协同结果。与单独施用第一药征或第二药征相比，组合疗法的使用还可以提供更好的治疗概况。

加成或协同作用可以允许减少任意一种或两种药征的剂量和/或给药频率，以减轻副作用。在某些实施例中，单独施用的第二药征在临床上不足以治疗受试者(例如，受试者对单一药征无反应或难治)，使得所述受试者需要另外的药征。在某些实施例中，受试者已经对第二药征作出反应，但是遭受副作用、复发、发展出抵抗力等，使得所述受试者需要另外的药征。本发明的方法包括向这些受试者施用本发明的组合物、疫苗调配物或单位剂型以提高第二药征的治疗有效性。可以使用本领域已知的方法在体内或体外测定治疗药征的有效性。

在一个实施例中，需要较少量的第二药征以在受试者中产生治疗益处。在具体实施例中，可以实现第二药征的量减少约10％、20％、30％、40％和50％。可以通过本领域众所周知的方法通过在动物模型中进行的剂量反应实验来确定第二药征的量，包含在不产生任何可观察到的治疗益处的范围内的量。

在某些实施例中，第二药征包括TCR，例如，可溶性TCR或表达TCR的细胞。在某些实施例中，第二药征包括表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞。在某些实施例中，表达TCR或CAR的细胞是T细胞。在一个特定的实施例中，TCR或CAR结合(例如，特异性结合)本发明的组合物、疫苗调配物或单位剂型中的至少一个MHC结合表位。

在某些实施例中，第二药征包括TCR模拟抗体。在某些实施例中，TCR模拟抗体是特异性结合肽-MHC复合物的抗体。TCR模拟抗体的非限制性实例公开于美国专利第9,074,000号、美国公开号US 2009/0304679 A1和US 2014/0134191 A1中，所有这些文献均通过引用整体并入本文。在一个特定的实施例中，TCR模拟抗体结合(例如，特异性结合)本发明的组合物、疫苗调配物或单位剂型中的至少一个MHC结合表位。

在某些实施例中，第二药征包括检查点靶向剂。在某些实施例中，检查点靶向剂选自由以下组成的组：拮抗剂抗CTLA-4抗体、拮抗剂抗PD-L1抗体、拮抗剂抗PD-L2抗体、拮抗剂抗PD-1抗体、拮抗剂抗TIM-3抗体、拮抗剂抗LAG-3抗体、拮抗剂抗CEACAM1抗体、激动剂抗CD137抗体、拮抗剂抗TIGIT抗体、拮抗剂抗VISTA抗体、激动剂抗GITR抗体和激动剂抗OX40抗体。

在某些实施例中，抗PD-1抗体在本文公开的方法中用作第二药征。在某些实施例中，抗PD-1抗体是纳武单抗，又被称为BMS-936558或MDX1106，由百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb)开发。在某些实施例中，抗PD-1抗体是派姆单抗，又被称为拉立珠单抗(lambrolizumab)或MK-3475，由默克公司(Merck&Co.)开发。在某些实施例中，抗PD-1抗体是皮地利珠单抗(pidilizumab)，又被称为CT-011，由CureTech公司开发。在某些实施例中，抗PD-1抗体是MEDI0680，又被称为AMP-514，由医学免疫公司(Medimmune)开发。在某些实施例中，抗PD-1抗体是由诺华制药公司(Novartis Pharmaceuticals)开发的PDR001。在某些实施例中，抗PD-1抗体是由再生元制药公司(Regeneron Pharmaceuticals)开发的REGN2810。在某些实施例中，抗PD-1抗体是由辉瑞公司(Pfizer)开发的PF-06801591。在某些实施例中，抗PD-1抗体是由百济神州公司(BeiGene)开发的BGB-A317。在某些实施例中，抗PD-1抗体是由AnaptysBio公司和Tesaro公司开发的TSR-042。在某些实施例中，抗PD-1抗体是由恒瑞公司(Hengrui)开发的SHR-1210。

可以用于本文所公开的治疗方法的抗PD-1抗体的另外的非限制性实例公开于以下专利和专利申请中，所述专利和专利申请中的全部均出于所有目的通过引用整体并入本文：美国专利第6,808,710号；美国专利第7,332,582号；美国专利第7,488,802号；美国专利第8,008,449号；美国专利第8,114,845号；美国专利第8,168,757号；美国专利第8,354,509号；美国专利第8,686,119号美国专利第8,735,553号；美国专利第8,747,847号；美国专利第8,779,105号；美国专利第8,927,697号；美国专利第8,993,731号；美国专利第9,102,727号；美国专利第9,205,148号；美国公开号US 2013/0202623 A1；美国公开号US 2013/0291136 A1；美国公开号US 2014/0044738 A1；美国公开号US 2014/0356363 A1；美国公开号US 2016/0075783 A1；以及PCT公开号WO 2013/033091 A1；PCT公开号WO 2015/036394A1；PCT公开号WO 2014/179664 A2；PCT公开号WO 2014/209804 A1；PCT公开号WO 2014/206107 A1；PCT 公开号WO 2015/058573 A1；PCT公开号WO 2015/085847 A1；PCT公开号WO2015/200119 A1；PCT公开号WO 2016/015685 A1；和PCT公开号WO 2016/020856 A1。

在某些实施例中，抗PD-L1抗体在本文公开的方法中用作第二药征。在某些实施例中，抗PD-L1抗体是由基因泰克公司(Genentech)开发的阿特珠单抗(atezolizumab)。在某些实施例中，抗PD-L1抗体是由阿斯利康制药有限公司(AstraZeneca)、塞尔基因公司(Celgene)和医学免疫公司开发的度伐单抗(durvalumab)。在某些实施例中，抗PD-L1抗体是阿维鲁单抗(avelumab)，又被称为MSB0010718C，由默克雪兰诺公司(Merck Serono)和辉瑞公司开发。在某些实施例中，抗PD-L1抗体是由百时美施贵宝公司开发的MDX-1105。在某些实施例中，抗PD-L1抗体是由Amplimmune公司和GSK公司开发的AMP-224。

可以用于本文所公开的治疗方法的抗PD-L1抗体的非限制性实例公开于以下专利和专利申请中，所述专利和专利申请中的全部均出于所有目的通过引用整体并入本文：美国专利第7,943,743号；美国专利第8,168,179号；美国专利第8,217,149号；美国专利第8,552,154号；美国专利第8,779,108号；美国专利第8,981,063号；美国专利第9,175,082号；美国公开号US 2010/0203056 A1；美国公开号US 2003/0232323 A1；美国公开号US 2013/0323249 A1；美国公开号US 2014/0341917 A1；美国公开号US 2014/0044738 A1；美国公开号US 2015/0203580 A1；美国公开号US 2015/0225483 A1；美国公开号US 2015/0346208A1；美国公开号US 2015/0355184 A1；以及PCT公开号WO 2014/100079 A1；PCT公开号WO2014/022758 A1；PCT公开号WO 2014/055897 A2；PCT公开号WO 2015/061668 A1；PCT公开号WO 2015/109124 A1；PCT 公开号WO 2015/195163 A1；PCT公开号WO 2016/000619 A1；和PCT公开号WO 2016/030350 A1。

在某些实施例中，靶向一种或多种免疫调节酶(如IDO(吲哚胺-(2,3)-双加氧酶)和/或TDO(色氨酸2,3-双加氧酶))的化合物在本文公开的方法中用作第二药征。因此，在一个实施例中，所述化合物靶向一种或多种免疫调节酶，如吲哚胺-(2,3)-双加氧酶(IDO)的抑制剂。在某些实施例中，这种化合物选自由以下组成的组：依帕卡哚司他(因塞特公司(Incyte Corp)；参见例如WO 2010/005958，其通过引用整体并入本文)、F001287(福克斯生物科学公司(Flexus Biosciences)/百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb))、吲哚莫德(纽琳基因公司(NewLink Genetics))和NLG919(纽琳基因公司)。在一个实施例中，化合物是依帕卡哚司他。在另一个实施例中，化合物是F001287。在另一个实施例中，化合物是吲哚莫德。在另一个实施例中，化合物是NLG919。在一个具体的实施例中，将本文所公开的抗TIM-3(例如，人TIM-3)抗体与用于治疗癌症的IDO抑制剂组合施用于受试者。如本文所描述的用于治疗癌症的IDO抑制剂以药物组合物的如片剂、丸剂或胶囊剂等固体剂型存在，其中所述药物组合物包含IDO抑制剂和药学上可接受的赋形剂。因此，本文所述的抗体和本文所述的IDO抑制剂可以作为单独的剂型单独地施用、按顺序地施用或同时施用。在一个实施例中，胃肠外施用所述抗体，并且口服施用IDO抑制剂。在特定实施例中，抑制剂选自由以下组成的组：依帕卡哚司他(因塞特公司)、F001287(福克斯生物科学公司/百时美施贵宝公司)、吲哚莫德(纽琳基因公司)和NLG919(纽琳基因公司)。依帕卡哚司他已经在PCT公开号WO2010/005958中进行了描述，所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文。在一个实施例中，抑制剂是依帕卡哚司他。在另一个实施例中，抑制剂是F001287。在另一个实施例中，抑制剂是吲哚莫德。在另一个实施例中，抑制剂是NLG919。

在某些实施例中，第二药征包括用于治疗癌症或感染的不同疫苗(例如，肽疫苗、DNA疫苗或RNA疫苗)。在某些实施例中，疫苗是基于热休克蛋白的肿瘤疫苗或基于热休克蛋白的病原体疫苗(例如，WO 2016/183486中描述的疫苗，其通过引用整体并入本文)。在一个具体的实施例中，第二药征包括基于应激蛋白的疫苗。例如，在某些实施例中，第二药征包括与第一药征不同的本文公开的组合物、疫苗调配物或单位剂型。在某些实施例中，第二药征包括与本文公开的组合物、疫苗调配物或单位剂型类似的组合物、疫苗调配物或单位剂型，不同之处在于具有不同的HSP结合肽序列。在某些实施例中，基于应激蛋白的疫苗衍生自肿瘤制剂，使得疫苗引发的免疫特异性针对每个受试者的癌症表达的独特抗原肽库。

在某些实施例中，第二药征包括一种或多种佐剂，如上文公开的可以包含在本文公开的疫苗调配物中的佐剂。在某些实施例中，第二药征包括皂苷、免疫刺激性核酸和/或QS-21。在某些实施例中，第二药征包括Toll样受体(TLR)激动剂。在某些实施例中，所述TRL激动剂是TLR4的激动剂。在某些实施例中，所述TRL激动剂是TLR7和/或TLR8的激动剂。在某些实施例中，所述TRL激动剂是TLR9的激动剂。在某些实施例中，所述TRL激动剂是TLR5的激动剂。

在某些实施例中，第二药征包括选自由以下组成的组的试剂中一种或多种试剂：来那度胺、地塞米松、白介素-2、重组干扰素α-2b和聚乙二醇干扰素α-2b。

在某些实施例中，当药物组合物、疫苗调配物或单位剂型用于治疗患有癌症的受试者时，第二药征包括化学疗法或放射疗法。在某些实施例中，化学治疗剂是低甲基化剂(例如，阿扎胞苷)。

在某些实施例中，当药物组合物、疫苗调配物或单位剂型用于治疗患有病原微生物感染的受试者时，第二药征包括一种或多种用于治疗传染病的抗感染干预措施(例如，抗病毒剂、抗菌剂、抗真菌药或抗蠕虫药)。

本发明的组合物、疫苗调配物或单位剂型可以通过相同或不同的递送途径与第二药征(例如，化学治疗剂、放射治疗剂、检查点靶向剂、IDO抑制剂、疫苗、佐剂、可溶性TCR、表达TCR的细胞、表达CAR的细胞和/或TCR模拟抗体)分开施用、按顺序地施用或同时施用。

5.5.4剂量方案

本文公开的组合物或疫苗调配物的剂量以及(如果要施用组合疗法的话)任何另外的治疗药征的剂量在很大程度上取决于所治疗对象的体重和总体健康状况，以及治疗的频率和施用途径。对这种用途有效的量还将取决于疾病的阶段和严重程度以及开药医生的判断，但是一般而言，对于70kg的患者，初始免疫(即，用于治疗性施用)的范围为约1.0μg到约1000μg(1mg)(包含例如10、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、240、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000μg)本文公开的任何一种组合物，然后根据患者的反应和状况，通过测量患者血液中的特定CTL活性，根据数周至数月的加强方案，将组合物的剂量加强约1.0μg到约1000μg(包含例如10、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000μg)。可以通过初始反应和临床判断来指导持续治疗的方案，包含部位、剂量和频率。佐剂的剂量范围和方案是本领域技术人员已知的，参见例如，Vogel和Powell,1995,《疫苗佐剂和赋形剂简编(A Compendium of Vaccine Adjuvants andExcipients)》；M.F.Powell、M.J.Newman(编者),普莱纽姆出版社(Plenum Press),纽约,第141-228页。

优选的佐剂包含QS-21(例如，QS-21

在某些实施例中，组合物的施用量取决于施用途径和组合物中HSP的类型。例如，组合物中HSP的量可以在例如每次施用5到1000μg(1mg)的范围内。在某些实施例中，包括Hsc70-、Hsp70-和/或Gp96-多肽复合物的组合物的施用量为例如5、10、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、250、300、400、500、600、700、750、800、900或1000μg。在某些实施例中，组合物的施用量在每次施用约10到600μg的范围内，如果进行皮内施用，则为约5到100μg。在某些实施例中，组合物的施用量为约5μg到600μg、约5μg到300μg、约5μg到150μg或约5μg到60μg。在某些实施例中，组合物的施用量小于100μg。在某些实施例中，组合物的施用量为约5μg、25μg、50μg或240μg。在某些实施例中，纯化包括应激蛋白和多肽的复合物的组合物。

在治疗方案的一个实施例中，基本上与观察到的对较小的非人类动物(例如，小鼠或豚鼠)有效的剂量相同的剂量对人类施用是有效的，基于此类哺乳动物和人类的相对淋巴结大小，可任选地接受不超过五十倍增加的校正因子。具体地说，对于人类剂量，非共价结合至抗原分子或与所述抗原分子混合的应激蛋白(或HSP)的种间剂量反应当量被估计为在小鼠中观察到的治疗剂量与单一缩放比率(不超过五十倍增加)的乘积。在某些实施例中，组合物的剂量可以比通过外推法估计的剂量小得多。

上述剂量可以一次性给予或重复地给予，如每天、每隔一天、每周、每两周一次或每月一次，持续长达一年或一年以上的时间。优选地，每28天给予一次剂量，持续约52周或更长时间。

在一个实施例中，将组合物与另外的一种或多种治疗药征合理地同时施用于受试者。这种方法的条件是，在少于一分钟到大约五分钟的时间范围内进行两次施用，或两次施用之间的间隔最长不超过约六十分钟，例如在同一位医生就诊时。

在另一个实施例中，在完全相同的时间施用组合物和另外的一种或多种治疗药征。

在又另一个实施例中，按顺序并在时间间隔内施用所述组合物和另外的一种或多种治疗药征，使得与单独施用本发明的复合物和另外的一种或多种治疗药征相比，它们可以共同发挥作用，从而提供更大的益处。

在另一个实施例中，在时间上足够接近地施用所述组合物和另外的一种或多种治疗药征，以提供期望的治疗或预防结果。每种药征均可以以适当的形式并通过任何合适的途径同时或分别向受试者施用。在一个实施例中，通过不同的施用途径来施用本发明的复合物和另外的一种或多种治疗药征。在一个替代性实施例中，每种治疗药征均都通过相同的施用途径进行施用。所述组合物可以在相同或不同的部位(例如，胳膊和腿)上施用。当同时施用时，所述组合物和另外的一种或多种治疗药征可以(或可以不)在同一混合物中或在相同施用部位通过相同施用途径进行施用。

在各个实施例中，所述组合物和另外的一种或多种治疗药征的施用间隔小于1分钟、间隔约1分钟、间隔1小时到2小时、间隔2小时到3小时、间隔3小时到4小时、间隔4小时到5小时、间隔5小时到6小时、间隔6小时到7小时、间隔7小时到8小时、间隔8小时到9小时、间隔9小时到10小时、间隔10小时到11小时、间隔11小时到12小时、间隔不超过24小时或间隔不超过48小时。在其它实施例中，组合物和疫苗组合物的施用间隔2天到4天、间隔4天到6天、间隔1周、间隔1周到2周、间隔2周到4周、间隔一个月、间隔1个月到2个月或间隔2个月或更长时间。在优选的实施例中，所述组合物和另外的一种或多种治疗药征在两者均仍活跃的时间范围内进行施用。本领域技术人员将能够通过确定每种施用组分的半衰期来确定这种时间范围。

在某些实施例中，将组合物每周一次施用给受试者，持续至少四周。在某些实施例中，在四个每周剂量之后，每两周一次向所述受试者施用至少另外2剂(例如，2剂、3剂、4剂、5剂、6剂、7剂、8剂、9剂、10剂、11剂、12剂、13剂、14剂、15剂、16剂、17剂、18剂、19剂或20剂)组合物。在某些实施例中，在最后一次的每周或每两周剂量后三个月，将所述组合物作为加强剂施用。可以在所述受试者的一生中施用三个月一次的加强剂(例如，至少1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年、40年、50年或更长的时间)。在某些实施例中，施用给受试者的组合物的剂量总数为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。

在一个实施例中，在同一位患者就诊期间施用组合物和另外的一种或多种治疗药征。在某些实施例中，在施用另外的一种或多种治疗药征之前施用组合物。在一个替代性具体实施例中，在施用另外的一种或多种治疗药征之后施用组合物。

在某些实施例中，将组合物和另外的一种或多种治疗药征循环地施用给受试者。循环疗法涉及在一段时间内施用组合物，随后一段时间内施用药征，并重复该顺序施用。循环疗法可以减少对一种或多种疗法的抗药性的发展、避免或减少一种疗法的副作用和/或提高治疗的效力。在此类实施例中，本公开设想了组合物的交替施用，随后4到6天后(优选地，2到4天后，更优选地，1到2天后)施用药征，其中这种循环可以根据需要重复多次。在某些实施例中，以少于3周、每两周一次、每10天一次或每周一次的周期交替施用组合物和药征。在某些实施例中，在施用药征后一小时到二十四小时的时间范围内将组合物施用给受试者。如果使用的是缓慢释放或连续释放类型的药征递送系统，则时间范围可以进一步延长至几天或更长时间。

5.5.5施用途径

可以使用任何期望的施用途径来施用本文公开的组合物。可以使用许多方法来引入上述组合物，包含但不限于口服、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、粘膜、鼻内、肿瘤内和淋巴结内途径。非粘膜施用途径包含但不限于皮内施用和局部施用。粘膜施用途径包含但不限于口服施用、直肠施用和鼻腔施用。皮内施用的优点分别包含使用较低剂量和快速吸收。皮下施用或肌内施用的优点分别包含适合一些不溶性悬浮液和油性悬浮液。如下所述，用于粘膜施用的制剂适用于各种调配物。

溶解度和施用部位是选择组合物施用途径时应考虑的因素。施用模式可以在多种施用途径之间变化，包含以上列出的途径。

如果组合物是水溶性的，则可以将其配制在适当的缓冲液中，例如，磷酸盐缓冲盐水或其它生理相容性溶液，优选无菌的。可替代地，如果组合物在水性溶剂中的溶解度差，则可以用非离子表面活性剂(如Tween或聚乙二醇)配制组合物。因此，可以将组合物配制成用于通过吸入或吹入(通过口或鼻)或口服施用、经颊施用、肠胃外施用或直肠施用进行施用。

对于口服施用，组合物可以呈液体形式(例如，溶液、糖浆或悬浮液)，或者可以作为药物产品存在，用于在使用之前与水或其它合适的媒剂一起重构。此类液体制剂可以通过常规手段用药学上可接受的添加剂(如助悬剂(例如，山梨糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性媒剂(例如，杏仁油、油性酯或分馏的植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸))制备。组合物可以采取例如片剂或胶囊剂的形式，所述片剂或胶囊剂通过常规手段用药学上可接受的赋形剂(如粘合剂(例如，预糊化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羟乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如，月桂基硫酸钠))制备。片剂可以通过本领域熟知的方法包衣。

可以将用于口服施用的组合物适当地配制成以受控和/或定时的方式释放。

对于经颊施用，组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。

可以将制剂配制成用于通过注射(例如，通过团注或连续输注)进行肠胃外施用。注射用调配物可以以单位剂型存在，例如在安瓿或在多剂量容器中，并添加有防腐剂。制剂可以采用以下形式：在油性或水性媒剂中的混悬液、溶液或乳剂，并且可以含有配制剂，如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。可替代地，活性成分可以呈粉末形式，用于在使用之前与合适的媒剂(例如，无菌的无热原水)一起配制。

也可以将制剂配制成例如含有常规栓剂基质(如可可脂或其它甘油酯)的直肠制剂(如栓剂或保留灌肠剂)。

除了上文所述的调配物之外，制剂也可以被配制成贮库制剂。此类长效调配物可以通过植入(例如，皮下或肌内)或通过肌内注射进行施用。因此，例如，制剂可以用合适的聚合或疏水性材料(例如，作为在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂进行配制，或被配制成微溶的衍生物，例如，配制成微溶的盐。脂质体和乳剂是用于亲水性药物的递送媒剂或载剂的众所周知的实例。

为了通过吸入进行施用，使用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适合的气体)，从加压包或喷雾器以气雾剂喷雾呈现的形式方便地递送组合物。在加压气雾剂的情况下，可以通过提供用于递送计量的量的阀门来确定剂量单位。可以将用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(例如明胶)配制成含有化合物和合适的粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。

5.5.6患者(受试者)评估

可以测试用本文公开的组合物治疗的患者的抗肿瘤免疫应答。在此方面，可以获取患者的外周血并进行抗肿瘤免疫标志物的测定。通过使用标准实验室程序，可以从外周血中获得白细胞，并测定不同免疫细胞表型、HLA亚型的频率和抗肿瘤免疫细胞的功能。

抗肿瘤应答中的大多数效应子免疫细胞是CD8

为了确定抗肿瘤T细胞应答是否增加，可以进行酶联免疫斑点测定以定量产生IFNγ的外周血单核细胞(PBMC)。这种技术提供了一种用于抗原识别和免疫细胞功能的测定法。在一些实施例中，临床上对疫苗有反应的受试者可以具有肿瘤特异性T细胞和/或产生IFNγ的PBMC增加。在一些实施例中，使用流式细胞术评估免疫细胞频率。在一些实施例中，使用酶联免疫斑点测定法评估抗原识别和免疫细胞功能。

在一些实施例中，可以进行一系列测定以表征对单独组合物或与护理标准(例如，针对多形性胶质母细胞瘤，最大型的手术切除、放射疗法以及替莫唑胺辅助化学疗法)组合给予的组合物产生的免疫应答。在一些实施例中，测定板包含以下一项或多项测试：全血细胞计数；绝对淋巴细胞计数；单核细胞计数；CD4

在评估受试者时，可以进行许多其它测试以确定受试者的总体健康。例如，可以从受试者收集血液样品并分析血液学、凝血时间和血清生物化学。CBC的血液学可以包含红细胞计数、血小板、血细胞比容、血红蛋白、白细胞(WBC)计数以及WBC差异，并提供嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞的绝对计数。血清生物化学可以包含白蛋白、碱性磷酸酶、天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、总胆红素、BUN、葡萄糖、肌酐、钾和钠。还可以测试凝血酶原时间(PT)和部分凝血活酶时间(PTT)。还可以进行以下一项或多项测试：抗甲状腺(抗微粒体或甲状腺球蛋白)抗体测试、抗核抗体和类风湿因子的评估。可以进行尿液分析以评估尿液中的蛋白质、RBC和WBC水平。另外，可以进行抽血以确定组织相容性白细胞抗原(HLA)状态。

在一些实施例中，在整个治疗过程中进行一次或多次放射肿瘤评估，以评估肿瘤的大小和状态。例如，可以在手术前30天内、手术后48小时内(例如，以评估切除百分比)、第一次疫苗接种前1周(最多14天)进行肿瘤评估扫描(例如，作为基线评估)，此后大约每8周进行一次肿瘤评估扫描，持续特定的持续时间。可以使用MRI或CT成像。典型地，用于基线评估的相同成像药征用于每次肿瘤评估就诊。

5.6试剂盒

还提供了用于执行本文公开的预防和治疗方法的试剂盒。试剂盒可以任选地进一步包括关于如何使用试剂盒的各种组分的说明书。

在某些实施例中，试剂盒包括含有本文公开的组合物的第一容器和含有一种或多种佐剂的第二容器。佐剂可以是本文公开的任何佐剂，例如，皂苷、免疫刺激性核酸或QS-21(例如，QS-21

可替代地，试剂盒可以在单独的容器中包含本文公开的组合物的一种或多种应激蛋白和一种或多种多肽。在某些实施例中，试剂盒包括含有一种或多种本文公开的多肽的第一容器以及含有能够结合所述多肽的纯化的应激蛋白的第二容器。

第一容器可以含有任何数量的不同多肽。例如，在某些实施例中，所述第一容器含有不超过100种不同的多肽，例如2-50种、2-30种、2-20种、5-20种、5-15种、5-10种或10-15种不同的多肽。在某些实施例中，所述不同多肽中的每种多肽均包括相同的HSP结合肽和不同的抗原肽。在某些实施例中，所述第一容器中的所述一种或多种多肽的总量为单位剂量的合适量。在某些实施例中，所述第一容器中的所述一种或多种多肽的总量为约0.1到20nmol(例如，3、4、5或6nmol)。

第二容器可以含有本文公开的任何应激蛋白。在某些实施例中，所述应激蛋白选自由以下组成的组：Hsc70、Hsp70、Hsp90、Hsp110、Grp170、Gp96或钙网蛋白及其突变体或融合蛋白。在某些实施例中，应激蛋白是Hsc70(例如，人Hsc70)。在某些实施例中，所述应激蛋白是重组蛋白。在某些实施例中，所述第二容器中的所述一种或多种应激蛋白的总量为约10μg到600μg(例如，250μg到290μg)。在某些实施例中，所述第二容器中的所述一种或多种应激蛋白的总量为约50μg、100μg、200μg、300μg、400μg或500μg。在某些实施例中，药物组合物中的应激蛋白的量为约300μg。在某些实施例中，基于第一容器中的一种或多种多肽的总摩尔量，计算第二容器中的一种或多种应激蛋白的总摩尔量，使得一种或多种多肽与一种或多种应激蛋白的摩尔比为约0.5:1到5:1(例如，约1:1到2:1，例如，约1:1、1.25:1或1.5:1)。在某些实施例中，第二容器中的一种或多种应激蛋白的总量是多次施用的量(例如，小于或等于1mg、3mg、10mg、30mg或100mg)。

在某些实施例中，试剂盒进一步包括用于由第一容器中的一种或多种多肽和第二容器中的一种或多种应激蛋白制备组合物的说明书(例如，如本文第5.4.2节所公开的复合反应说明书)。

在某些实施例中，试剂盒进一步包括含有一种或多种佐剂的第三容器。佐剂可以是本文公开的任何佐剂，例如，皂苷、免疫刺激性核酸或QS-21(例如，QS-21

在某些实施例中，容器中的组合物、一种或多种多肽、一种或多种应激蛋白、一种或多种佐剂和另外的治疗药征以有效治疗癌症或感染的预定量存在。如果需要的话，组合物可以存在于包装或分配器装置中，所述包装或分配器装置可以含有组合物的一种或多种单位剂型。包装可以例如包括金属或塑料箔，如泡罩包装。包装或分配器装置可以附有施用说明。

5.7 HPV肽

在另一方面，本公开提供了一种多肽，所述多肽包括HSP结合肽和来自人乳头瘤病毒(HPV)(例如，HPV16或HPV18)的氨基酸序列。这种氨基酸序列在本文中也被称为HPV肽。

HPV肽可以包括表3中公开的任何氨基酸序列。在某些实施例中，来自HPV的氨基酸序列包括SEQ ID NO:38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52或53的氨基酸序列。

表3.抗原HPV肽的氨基酸序列

HSP结合肽可以是在第5.2节中公开的任何HSP结合肽，或者是本领域中已知的任何HSP结合肽(参见例如，US20160331821A1和US7309491B2，其各自通过引用整体并入本文)。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:1、2、3、4或232的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:5、6、7、8、9、10、11、12、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、204、205、207、208、209、210、211、212、213、214或215的氨基酸序列。在某些实施例中，所述HSP结合肽包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

HPV肽可以通过本文(例如，在第5.3节中)公开的任何接头连接至HSP结合肽。在某些实施例中，HPV肽通过肽接头连接至HSP结合肽。在某些实施例中，肽接头包括氨基酸序列FR或FFRK(SEQ ID NO:13)。

在某些实施例中，HPV肽包括SEQ ID NO:54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68或69的氨基酸序列。

表4.结合HSP的抗原HPV肽的氨基酸序列

在另一方面，本公开提供了一种组合物(例如，药物组合物)，所述组合物包括多种不同的多肽，其中每种多肽包括HSP结合肽和HPV肽。在某些实施例中，至少一种HPV肽的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:38-53。在某些实施例中，每种HPV肽的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:38-53。在某些实施例中，所述组合物包括至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种或16种不同的HPV肽。

在某些实施例中，至少一种多肽的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:54-69。在某些实施例中，每种多肽的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:54-69。在某些实施例中，所述组合物包括至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种或16种不同的多肽。

在某些实施例中，所述组合物进一步包括纯化的应激蛋白。可以使用本文公开的任何应激蛋白(例如，在第5.4节中)。例如，在某些实施例中，所述应激蛋白选自由以下组成的组：Hsc70、Hsp70、Hsp90、Hsp110、Grp170、Gp96、钙网蛋白及其突变体或融合蛋白。在某些实施例中，应激蛋白是Hsc70(例如，人Hsc70)。

在某些实施例中，多肽与应激蛋白的比率可以是本文公开的任何比率，例如，约0.5:1到5:1。在某些实施例中，多肽与应激蛋白的比率为约1:1到2:1。在某些实施例中，多肽与应激蛋白的比率为约1:1、1.25:1或1.5:1。而且，一种或多种多肽和一种或多种应激蛋白的量可以是本文第5.4节中公开的任何量。在某些实施例中，所述组合物呈单位剂型。

在另一方面，本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括在单一容器中或在分开的容器中的本文公开的组合物，任选地进一步包括含有一种或多种佐剂和另外的治疗药征的容器，如本文第5.6节中所公开的。

在另一方面，本公开提供了一种在受试者中诱导对HPV肽的细胞免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本节中公开的组合物。在另一方面，本公开提供了一种在受试者中治疗与HPV相关的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本节中公开的组合物。在某些实施例中，与HPV相关的疾病是癌症(例如，子宫颈癌)。在某些实施例中，HPV是HPV16或HPV18。可以使用如本文第5.5.4节中公开的任何剂量方案和如本文第5.5.5节中公开的任何施用途径。所述方法可以进一步包括如本文第5.5.3节中公开的另外的治疗药征，并且可以进一步包括如本文第5.5.6节中公开的患者评估步骤。

6.实例

本节(即，第6节)中的实例通过说明而非限制的方式提供。

6.1实例1：鉴定以高亲和力结合Hsc70的肽

本实例描述了与具有氨基酸序列NLLRLTG(SEQ ID NO:70)的热休克蛋白(HSP)结合肽相比，与HSP结合改善的热休克蛋白结合肽的设计(参见公开为US20160331821A1的美国专利申请，所述美国专利申请通过引用整体并入本文)。

6.1.1肽与Hsc70的结合

为了鉴定以高亲和力结合人Hsc70的肽，设计了NLLRLTG(SEQ ID NO:70)序列的变体，并将具有氨基酸序列FFRK(SEQ ID NO:13接头)连接至N端。表5提供了合成和测试的肽的氨基酸序列。

表5.HSP结合肽的氨基酸序列

在Symphony-X自动合成仪(Gyros蛋白质技术公司)中，使用标准的Fmoc固相化学合成法与预上样的聚苯乙烯Wang(PS-Wang)树脂来合成肽。用标准的HCTU/NMM活化化学处理Fmoc保护的L-氨基酸。关于树脂取代，使用5倍过量的氨基酸、5倍过量的活化剂(HCTU)和10倍过量的N-甲基吗啉来偶联氨基酸以形成肽键。对于整个合成过程中的任何不完全偶联，以双偶联循环进行反应，持续6分钟。重复这些步骤，直到获得期望的序列。合成结束时，将树脂用二氯甲烷(DCM)洗涤并干燥。肽组装完成后，将树脂转移到另一个切割容器中，以从树脂上切割肽。将切割混合物试剂三氟乙酸:二硫苏糖醇水:三异丙基硅烷(88:5:5:2v/w/v/v)与树脂混合，并在25℃下搅拌4小时。通过过滤从树脂中分离出粗肽，并用N

将个体肽以10mg/ml溶解在100％DMSO中，然后在75％DMSO中通过第二步稀释至320μM。为了形成肽-Hsc70复合物，将Hsc70以7μM(0.5mg/ml)的浓度与适当浓度的肽在1XPBS中混合，最终体积为25μl。然后将混合的样品在37℃下孵育1小时，并在冰上冷却10分钟。为了评估溶液中复合物的量，将20μl(10μg)的样品上样至尺寸排阻色谱(SEC)柱TSKgelSuperSW3000(东曹(Tosoh)生物科技)，流速为0.2ml/分钟，使用1X PBS作为运行缓冲液。通过测量在280和214nm处的吸光度来收集数据。

在单独的实验中，产生了肽NLLRLTG(SEQ ID NO:70)的另外的变体，并且分析了这些肽形成肽-Hsc70复合物的能力。如上所述，再次使用标准的Fmoc固相化学合成法合成肽。将个体肽以250μM的浓度溶解在pH经调节的水中，并掺入聚山梨酯20，使其最终浓度为0.1％。为了形成肽-Hsc70复合物，以0.25:1、0.5:1、1:1、2:1和4:1的肽:Hsc70摩尔比将Hsc70(1mg/ml，0.1％聚山梨酯)与肽在30℃下混合60分钟。孵育后，将样品在室温下冷却5分钟，然后转移到HPLC小瓶中进行分析。为了评估溶液中复合物的量，将20μl(10μg)的样品上样至尺寸排阻色谱柱TSKgel SuperSW3000(东曹生物科技)，流速为0.2ml/分钟，使用1XPBS作为运行缓冲液。通过测量214nm处的吸光度来收集数据。

通过SEC计算与肽结合的Hsc70的百分比。如图1描绘的SEC色谱图所示，当进行SEC色谱分析时，重组人热休克同源71kDa蛋白(Hsc70)以单体(M)、二聚体(D)、三聚体(T)和高阶高分子量(HMW)寡聚物种的形式出现。通过紧密洗脱Hsc70单体与肽的复合物(Msh)，可以解决和评估与给定肽或肽混合物形成肽-Hsc70复合物的程度。对应于单体和复合物的峰重叠，并且无法通过常规SEC培养基完全分辨。为了更准确地计算复合物的形成程度，使用了以下数据分析方法。这种方法的主要特征是基于以下观察：观察到Hsc70的三聚体形式和二聚体形式被募集以形成单体肽复合物。这些蛋白质物种的峰面积积分可以从复合物和单体中很好地分辨出来。进一步地，形成复合物的程度似乎与三聚体和二聚体被募集以形成复合物的程度成反比。由于这种观察，三聚体和二聚体的变化反映了单体被募集以形成复合物的程度。因此，三聚体和二聚体水平的变化进程用于计算重叠的复合物和单体物种的峰面积的预期变化，并且这些计算出的峰面积用于计算复合物的净形成。这种数据分析方法如下所述。

用于各种色谱级分的术语包含：高分子量(HMW)、三聚体和其它中阶低聚物(T)、二聚体(D)、复合物(C)、单体肩峰(Msh)和单体(M)(参见图1)。从SEC数据中提取各个级分的峰面积，并使用以下等式集计算肽-Hsc70复合物形成的百分比：

复合物百分比＝(面积

面积

面积

面积

面积

面积

通过以下步骤将上述方法应用于每个复合反应的SEC色谱图：将竖直线应用于色谱图以产生HMW、T、C、D和M段(如图1所示)；计算所指示的HMW、T、C、D和M段中的每段的曲线下面积；并将值输入上述等式中。分析结果如表6所示。

表6.肽与Hsc70的复合百分比

选择PEP006用于进一步表征。

6.1.2 Hsc70与PEP006的复合

该实施例证明了PEP006以0.25:1到3:1的摩尔比范围与Hsc70结合的能力，如通过尺寸排阻色谱法所测定的。

简而言之，将PEP006肽在注射用水(WFI)中重构为645μM的浓度。将重组人Hsc70(rhHsc70)稀释至1.66mg/mL的浓度。将两种溶液在37℃的孵育箱中预热10分钟，然后合并，并在37℃下孵育60分钟。rhHsc70的最终浓度为1mg/mL(约14.1μM)，并且PEP006与rhHsc70的摩尔比为0.25:1、0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1和3:1。还制备了仅含有1mg/mL rhHsc70的阴性对照。

使用色谱柱TSKgel SuperSW3000(东曹生物科技，目录号18675)，每次进样10μg的每种样品，一式三份，以通过尺寸排阻HPLC(Alliance HPLC，Waters Model#2695分离模块；双波长UV检测器，Waters Model 2487)进行分离。柱温控制在25℃±5℃，自动进样器温度控制在5℃±3℃。流动相由10mM磷酸钠和300mM氯化钠(pH 7.2)组成，并以0.2mL/分钟的流速递送30分钟。在214nm和280nm的波长处测量PEP006肽和rhHsc70蛋白的UV吸光度。通过Waters Empower(V2)软件处理吸光度数据。

图2示出了PEP006-Hsc70幅合产物的色谱图，其中当rhHsc70结合PEP006时，柱保留时间变短。

6.1.3 Hsc70与包括PEP006的多肽的复合

该实例描述了Hsc70与多肽LGVVRPRALHRELDLVDDSPTPGSPGSFFRKNWLRLTW(SEQ IDNO:77)的结合的表征，所示多肽包括PEP006和从患者肿瘤中观察到的肽(LGVVRPRALHRELDLVDDSPTPGSPGS(SEQ ID NO:76))。在该实例中，测试的多肽与Hsc70的摩尔比为0.125:1、0.25:1、0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1和4:1。

图3A示出了多肽-Hsc70幅合产物的色谱图，其中当rhHsc70结合多肽时，柱保留时间变短。图3B是示出在使用实例6.1.1中所述的方法根据类似于图3A的尺寸排阻色谱法迹线所计算的范围从0.125:1到4:1的多肽:Hsc70摩尔比范围内，包括PEP006的多肽与HSC70的复合百分比的图。示出了三个独立的实验。

为了进一步表征Hsc70与包括C端PEP006或PEP001的多肽的结合，产生了一系列具有C端PEP001、PEP006的多肽，并且在一些情况下，产生了不具有C端HSC70结合肽的相同多肽。所用的肽显示在下表7中。合成多肽，进行复合，并根据上文实例6.1.1中所述的方法分析SEC数据。

表7.多肽

图4A是示出五种不同肽的复合百分比的图，其中五种不同肽中的每种肽均包括C端PEP001、C端PEP006或不包括C端HSC70结合肽。图4B是示出六种不同肽的复合百分比的图，其中六种不同肽中的每种肽均包括C端PEP001或C端PEP006。

6.2实例2：通过HSP结合肽增强细胞免疫

该实例证明了在两种动物模型中包括HPV E6-E7肽和PEP001或PEP006的多肽的免疫原性和肿瘤抑制活性。

6.2.1通过HSP结合肽增加抗原肽的免疫原性

在该实例中，在免疫原性动物模型中分析了四种多肽的库的免疫原性，每种多肽均包括与PEP001或PEP006连接或不与HSP结合肽连接的免疫原性HPVE6或E7肽。

简而言之，化学合成具有表8中提供的氨基酸序列的四种单独的或与PEP001或PEP006连接的HPV E6或E7肽，并将所述肽以25到100mg/ml的浓度溶解在100％DMSO中。已知这些HPV E6和E7肽在C57BL/6小鼠中具有免疫原性(参见Bartkowiak等人(2015)《美国国家科学院院刊》112(38)；以及Manuri等人(2007)《疫苗》25(17):3302-10，所述文献中的每一个文献均通过引用整体并入本文)。PEP059和PEP060的已知表位序列是RAHYNIVTF(SEQ IDNO:78)，而PEP061和PEP062的已知表位序列是VYDFAFRDL(SEQ ID NO:79)。

表8.HPV肽的氨基酸序列

依次使用弱阴离子Q Sepharose柱、ATP琼脂糖亲和柱和DEAE-FF弱阴离子交换柱，通过色谱法从表达rhHsc70的大肠杆菌中纯化重组人Hsc70(rhHsc70)蛋白。将纯化的rhHsc70蛋白稀释在补充有0.01％聚山梨酯20的过滤后的PBS中。

对于疫苗的制备，在75％DMSO中以320μM的总浓度制备了四种多肽的等摩尔库。将纯化的rhHsc70蛋白在37℃下预孵育30分钟，然后将多肽库以2:1或1:1摩尔比添加到rhHsc70蛋白溶液中，以达到0.5mg/ml的rhHsc70蛋白浓度。将混合物在37℃下孵育1小时，然后依次用0.8μm和0.2μm滤膜过滤。然后将混合物在冰上放置30分钟，并在-80℃下保存。

对于疫苗接种，将从杰克逊实验室购买的六周大的雌性C57BL/6J小鼠保持在无特定病原体的环境中。通过皮下注射疫苗对小鼠进行免疫。每次注射总共含有30μg(约0.42nmol)与肽库复合的Hsc70(1:1比率下为0.42nmol，或2:1比率下为0.84nmol)，所述肽库补充有10μg QS-21

第二次免疫后一周，进行IFNγELISpot测定。简而言之，对被免疫的小鼠实施安乐死，将脾细胞轻柔地分离，并将来自每只小鼠的5×10

如图5A所示，与裸HPV肽相比，含有与Hsc70复合的PEP001连接肽或PEP006连接肽的HPV疫苗显示出增加的免疫原性。对于这些特定的HPV肽，在所用条件下，含有与Hsc70复合的PEP006连接肽的疫苗显示出比含有与Hsc70复合的PEP001连接肽的疫苗更高的免疫原性。

为了将含有PEP001和PEP006的疫苗的免疫原性与采用相同肽剂量的裸肽的疫苗的免疫原性进行比较，使用与上述相同的程序进行了另外的实验，不同之处在于，在不存在Hsc70的情况下，游离肽在2:1比率组和1:1比率组中的量分别为0.84nmol和0.42nmol。

如图5B所示，与以1:1和2:1的摩尔比与Hsc70复合的裸肽的等效剂量相比，含有与Hsc70复合的PEP001连接肽或PEP006连接肽的HPV疫苗引起了更大数量的产生IFNγ的脾细胞。与不以1:1和2:1的摩尔比与Hsc70复合的游离肽的等效剂量相比，含有与Hsc70复合的PEP001连接肽和PEP006连接肽的疫苗还引起了更大的应答。对于这些特定的HPV肽，在所用条件下，含有与Hsc70复合的PEP006连接肽的疫苗显示出比含有与Hsc70复合的PEP001连接肽的疫苗更高的免疫原性。

在相关实验中，使用上文针对HPV E6或E7肽描述的免疫原性动物模型和方案评估了三种不同MC38肽的三个库的免疫原性。MC38肽库的详细信息在表9中列出。如图6所示，所有肽库均引发一定水平的免疫应答。

表9.MC38肽疫苗库

6.2.2通过HSP结合肽增加肿瘤疫苗效力

该实例使用TC1HPV16E6/E7同基因小鼠肿瘤模型证明了第6.2.1节中描述的HPV疫苗的治疗效力。

TC1细胞表达致癌基因HRAS、HPV16E6和E7，如以下文献中所公开的：Lin等人(1996)《癌症研究(Cancer Res.)》56(1):21-26，所述文献通过引用整体并入本文。将低传代TC1细胞在无血清PBS中洗涤，然后以2×10

用卡尺每3-4天测量一次肿瘤。使用公式1/2×D×d

如图7A-7E所示，注射了包括连接PEP001或PEP006的HPV肽的疫苗的小鼠的肿瘤生长比注射了包括裸HPV肽的疫苗或注射了PBS的小鼠的肿瘤生长慢。在存活曲线中观察到了包括连接PEP001和PEP006的HPV肽的疫苗的类似治疗效果(图7F)。

包括与rhHsc70复合的连接PEP006的HPV肽的疫苗比包括与rhHsc70复合的连接PEP001的HPV肽的疫苗在抑制肿瘤生长方面更有效(图7A、7D和7E)。值得注意的是，在这些实验中，这种差异转化为针对死亡率的实质性保护(图7F)。

6.2.3包括PEP006和一组新的HPV肽的肿瘤疫苗的效力

该实例证明了包括新的一组HPV肽的HPV疫苗的治疗效力。疫苗中使用的多肽的序列在表4中提供。具体地说，PEP073和PEP074包括氨基酸序列EVYDFAFRDL(SEQ ID NO:92)、鼠H-2Db和人HLA-A*24:02表位。PEP081包括氨基酸序列YMLDLQPET(SEQ ID NO:93)和MLDLQPETT(SEQ ID NO:94)、人HLA-A*02:01表位。PEP084包括氨基酸序列RAHYNIVTF(SEQID NO:78)、鼠H-2Db表位。PEP086包括氨基酸序列LLMGTLGIVC(SEQ ID NO:95)、人HLA-A*02:01表位。每种肽还包括PEP006的氨基酸序列。

通过第6.2.2节中描述的方法制备疫苗，并且对于HPV肽库，肽与rhHsc70蛋白的比率为2:1。使用与第6.2.2节中所述的小鼠模型相同的小鼠模型评估疫苗的效力，并将包括PEP063-066库的疫苗用作比较剂。

如图8A和8B所示，与TC1HPV16E6/E7同基因肿瘤模型中的PBS对照相比，含有Hsc70和PEP071-086的疫苗可减少肿瘤生长并提高存活率。

6.2.4两种包括PEP006的肿瘤疫苗调配物的效力

该实例证明了使用两种不同调配物的疫苗的治疗效力，在一种调配物中，最初将所有肽都重构DMSO中，而在另一种调配物中，最初仅将不溶于中性、酸性或碱性水中的肽重构在DMSO中。表4中提供了用于疫苗中的多肽的序列，其含有来自HPV E6和E7癌蛋白的肿瘤相关抗原。具体地说，该实例中使用的疫苗包括十六种肽，PEP071-PEP086。每种肽在C端包括氨基酸序列PEP006。

产生了两种疫苗调配物用于评估。在调配物A中，最初由100％DMSO中的粉末重构16种HPV肽中的每种肽。具体地说，将肽以25mg/ml的浓度重悬于100％DMSO中，然后将等摩尔量的每种肽合并到在无菌水中稀释的75％DMSO溶液中，最终合并浓度为320μM(每种肽@≌20μM)。在调配物B中，测试每种肽在中性水中的溶解度，然后如果需要的话，测试其在pH经调节的水(即酸性、含有HCl，或碱性，含有NaOH)中的溶解度。仅当肽不溶于水时才使用DMSO。具体地说，将16种肽以500μM的浓度溶解在中性水溶液、pH经调节水或100％DMSO(当肽无法重悬于水溶液中时)中。然后将这些肽以等体积混合，以形成500μM的工作库(每种肽@≌31μM)。对于两种疫苗调配物，随后将肽在水性缓冲液中稀释至与Hsc70复合所需的浓度。

为了与HSC70复合，按照无菌程序将rh-Hsc70在37℃下孵育0.5小时，然后在37℃下以2:1的总肽:蛋白质摩尔比与16种肽的库一起再孵育1小时。然后将复合物在冰上孵育15分钟。将复合物过滤并等分。

向C57BL/6小鼠(n＝13/组)在腹侧皮下注射2x10

监测肿瘤生长动力学和存活率。从肿瘤激发后第5天开始，研究的每3-4天用卡尺测量肿瘤体积。肿瘤长度基于最长的线性距离。宽度基于垂直于长度的最长线性距离。当肿瘤体积达到2000mm

肿瘤在用PBS治疗的对照小鼠中迅速生长(图9A和9B)。相反，在用任一疫苗调配物治疗的小鼠中观察到肿瘤生长速率的显著延迟(图9A和9B)(与用PBS治疗的小鼠的肿瘤生长相比，用调配物A治疗的小鼠的肿瘤生长**p≤0.01以及与用PBS治疗的小鼠的肿瘤生长相比，用调配物B治疗的小鼠的肿瘤生长****p≤0.0001：Wilcoxon秩和检验)。将单个小鼠的肿瘤生长动力学绘制为时间的函数。与用PBS治疗的小鼠相比，在用调配物A或调配物B治疗的小鼠中观察到延长的存活期(图9C)。

已知TC-1肿瘤对抗原靶向疗法产生抗性表型，所述抗原靶向疗法可由免疫编辑和肿瘤表达的表位的丧失来驱动((Smahel等人,2007)，这很可能解释了两种疫苗调配物从～d28开始的肿瘤最终进展。总之，这些数据表明，针对肿瘤相关抗原(如HPV E6和E7癌蛋白)的有效的疫苗诱导的免疫应答可以转化为显著的肿瘤控制和延长的存活期。

6.3实例3：通过Hsc70结合肽改善肽合成

该实例证明了PEP001和PEP006在合成期间提高肽的粗物质纯度的能力。

6.3.1通过添加PEP001或PEP006提高Ova抗原肽的粗物质纯度

通过第6.1.1节中描述的方法合成Ova抗原肽，所述抗原肽包括氨基酸序列EVSGLEQLESIINFEKLTEWTSSNVME(PEP053，SEQ ID NO:97)，所述氨基酸序列裸露或连接至PEP001(PEP052,SEQ ID NO:230，EVSGLEQLESIINFEKLTEWTSSNVMEFFRKNLLRLTG)或PEP006(PEP054，SEQ ID NO:231，EVSGLEQLESIINFEKLTEWTSSNVMEFFRKNWLRLTW)。该Ova抗原肽包括具有氨基酸序列SIINFEKL(SEQ ID NO:96)的MHC结合表位。使用Vanquish Bioanalytical和Ultimate 3000 Dionex工作站，通过反相色谱法测定肽的纯度，并遵循Chromeleon 7.0软件包随附的Vanquish/Ultimate 3000用户指南和Data Explorer用户指南中提供的程序。

在添加氨基酸残基的循环之后，将合成的肽从树脂上切割下来，并以1mg/mL的浓度溶于1:1的乙腈:水(v/v)中。使用Phenomenex Luna C18 10μm 4.6x250mm色谱柱通过分析型HPLC分析溶解的样品。注射20μL体积的样品，并按照表10的梯度，使用溶液A(0.1％TFA，于水中)和溶液B(0.1％TFA，于乙腈中)的混合物作为流动相进行梯度洗脱。柱温保持在37℃±5℃。通过在214nm和280nm的波长处的UV吸光度来检测肽。

表10.HPLC流动相的梯度表

在洗脱曲线中，每个峰代表具有特定保留时间的肽，峰下的面积反映了该肽的量。通过质谱确认正确的肽的峰。将肽的粗物质纯度计算为正确肽的峰下的面积除以整个曲线下的总面积。

如图10A所示，裸Ova肽(中间图)具有异质信号。相比之下，Ova-PEP001(上图)和Ova-PEP006(下图)制剂在预期的保留时间显示出几乎单个峰。色谱图的定量还表明，Ova-PEP001和Ova-PEP006具有显著增加的粗物质纯度(图10B)。该结果与较长的肽更难于合成和纯化的一般规则相悖，并表明PEP001和PEP006提高了肽的化学合成中的粗物质纯度。

6.3.2通过添加PEP006提高一系列肽的粗物质纯度

通过第6.1.1节中描述的方法合成了下表11中所示的50种肽。这组50种肽含有25个独特的肽序列(标记为A-Y)，其在添加或不添加(“裸肽”)C端PEP006肽序列的情况下合成。如上文第6.3.1节所述，通过反相色谱法测定肽的纯度。如图11所示，与相应的裸肽相比，PEP006肽序列的添加增加了大多数肽的粗物质纯度。由于样品的复杂性，许多肽分离是多维的。在高达95％的标准反相梯度下，在C18色谱柱中未检测到三种肽。对于这三种肽，在整个梯度中均没有可检测到的峰以进行积分，并且粗物质纯度列为零。缺少对这三种肽的检测的可能原因可能包含样品粘附到C18色谱柱或储存瓶上和/或样品从溶液中掉出。

表11.肽

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本发明的范围不受本文所描述的具体实施例限制。事实上，除了所述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将从前面的描述和附图中变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求书的范围内。

本文所引用的全部参考文献(例如，出版物或专利或专利申请)均以全文引用的方式并且出于所有目的并入本文中，其程度如同每个单独的参考文献(例如，出版物或专利或专利申请)出于所有目的被特别地或单独地指出以全文引用的方式并入一样。其它实施例在以下权利要求书内。