检测新冠疫苗注射后体内中和抗体的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种血液样本的快速定性检测试纸条及制备方法，尤其是利用免疫胶体金层析技术测定人体注射新冠疫苗后全血或血清中中和抗体的快速定性检测试纸条及其制备方法。

背景技术

目前还没有专门针对COVID-19的特效药，新冠疫苗便成了预防COVID-19的有效手段。当前，我国新冠疫苗研发工作总体上处于领先地位，每条技术路线都有进入临床阶段的疫苗，其中灭活疫苗和腺病毒载体疫苗，两种技术路线共4个疫苗进入了三期临床。随着后续疫苗的进一步成功，验证新冠疫苗的有效性便成为一大需求。因此，建立一种检测时间短、操作简单、灵敏度高、特异性高以及易于大规模推广的注射疫苗后人体内中和抗体测定方法，对患者提供早期、准确的实验室诊断是可行而必要的。

发明内容

为了检测注射新冠疫苗后人体是否产生相应抗体的需求，本发明提供一种快速定性检测注射新冠疫苗后人体内中中和抗体的快速胶体金免疫层析试纸条，所述胶体金免疫层析试纸条通过实际样本中的中和抗体与硝酸纤维素膜上包被的血管紧张素转化酶2（ACE2）竞争，有效的定性检测注射新冠疫苗后人体内是否含有中和抗体这一问题。并且所述试纸条具有较好的敏感性、特异性、重复性和稳定性，对目标化合物的回收率较高，能提供更准确可靠的检验结果。

实现本发明目的的技术方案是：

第一方面，本发明提供一种检测新冠疫苗注射后体内分泌中和抗体的胶体金免疫层析试纸条，包括PVC底板，所述PVC底板上从左到右依次搭接样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸；

所述胶体金垫上包被有胶体金标记的重组新型冠状病毒RBD蛋白；

所述硝酸纤维素膜上包被有血管紧张素转化酶2（ACE2）检测线，以及包被有鼠抗鸡IgG抗体作为质控线。

所述胶体金标记的重组新型冠状病毒RBD蛋白的浓度为500μg/mL-5mg/mL，其在胶体金垫上的包被量为 400uL；

所述血管紧张素转化酶2（ACE2）的浓度为0.5-2.6mg/ml，包被量为30uL；

所述鼠抗鸡IgG抗体的浓度为0.5-3mg/ml，包被量为30uL。

所述胶体金垫上还包括分离剂，所述分离剂为酪蛋白、BSA或PEG6000中的任意一种或至少两种的组合，优选为浓度10％的PEG6000。

发明人发现在胶体金垫上加入分离剂，使得重组新型冠状病毒RBD蛋白与胶体金颗粒的结合更加稳定，进一步降低了胶体金免疫层析试纸条的检测限，不仅如此，相比于BSA和酪蛋白，采用所述PEG6000作为分离剂时，金标物的复溶性和检测性能会进一步提升。

本发明，所述新冠病毒鼠抗人抗体隐球菌抗体为抗隐球菌荚膜多糖重组新冠抗原的单克隆抗体和/或抗隐球菌荚膜多糖重组新冠病毒抗原的多克隆抗体，优选为重组新冠病毒抗原抗隐球菌荚膜多糖抗原的单克隆抗体。

所述胶体金垫上的胶体金颗粒的粒径为30-40nm。

所述检测线的距离为3-5cm，检测线与质控线的距离为3-5cm，检测线和质控线相互不受干扰。

所述样品垫为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜；所述胶体金垫为玻璃纤维膜。

本发明中，所述胶体金免疫层析试纸条采用竞争层析免疫法，实际样本中的中和抗体在侧向移动的过程中，其会与硝酸纤维素膜上的血管紧张素转化酶2（ACE2）竞争标记了胶体金的重组新型冠状病毒RBD蛋白。若样本中中和抗体足够，则呈现检测线无显色质控线显色的结果，说明注射疫苗后产生抗体，疫苗产生中和抗体；若样本中中和抗体不足，呈现检测线显色、质控线显色的结果，说明注射疫苗后未产生抗体。质控线在检测阳性样本和阴性样本时均应出现条带，所显现的红色条带是判定层析过程是否是正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。

本发明，硝酸纤维素膜上包被的病毒抗体为血管紧张素转化酶2（ACE2），所述作为质控线的抗体为鼠抗鸡IgG抗体。鼠源性抗体是目前商业化抗体中最常见的抗体形式，来源广泛，成本较低，并且特异性和稳定性好。所述病毒抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，制备所述多克隆抗体或单克隆抗体的方法是本领域技术人员公知的，比如可以用相应病毒免疫动物，如鼠，从动物血清中纯化多克隆抗体，但是多克隆抗体相比单克隆抗体可能存在特异性不强的问题，有可能有假阳性结果的产生。具体到本发明，所述病毒抗体虽然可以采用多克隆抗体，但是单克隆抗体具有更明显的优势，因此是本发明的优选，制备所述单克隆抗体的方法比如可以是用相应病毒免疫动物，如鼠，取动物脾脏B细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，从中获取特异性较强的单克隆抗体。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

（（1）制备胶体金垫，在胶体金垫上包被胶体金标记的重组新型冠状病毒RBD蛋白；

（2）制备硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜上包被有血管紧张素转化酶2（ACE2）检测线，以及包被有鼠抗鸡IgG抗体作为质控线；

（3）在PVC底板上从左到右依次搭接样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸，即得。

本发明制备方法中，所述抗体包被为本领域的常规技术手段 ，没有特殊限定，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择和制备。

本发明制备方法中，抗体包被的抗体包被缓冲液为PBS缓冲液或PB缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。

所述PBS缓冲液的pH值为6-8.5，优选为7-8。

所述PB缓冲液的pH值为7-8，优选为7.2-7.4。

本发明制备方法中，所述胶体金垫的制备，包括以下步骤：

（1）器皿洗干净，采用硝酸钾将胶体金颗粒的pH值调整至8.5，加入器皿中，再向其中加入终浓度10％的分离剂，再加入重组新型冠状病毒RBD蛋白至终浓度30μg/ml，搅拌40min，得到胶体金溶液；

（2）向步骤（1）得到的胶体金溶液中加入10％封闭液至终浓度到1％进行封闭15min；

所述封闭液为酪蛋白和/或BSA溶液；

（3）将步骤（2）得到的胶体金溶液使用4℃、12000 rpm进行离心40min，离心后去上清，使用复溶液复溶沉淀，得到重组新型冠状病毒RBD蛋白标记液；

所述复溶液为吐温20和BSA两种的混合；

（4）将步骤（3）得到的重组新型冠状病毒RBD蛋白标记液使用喷金划膜仪按0.1μL/mm进行喷涂到胶体金垫上；

（5）将步骤（4）的胶体金垫在37℃烘箱中干燥240min，干燥后加干燥剂密封保存，即得到胶体金垫。

第三方面，本发明提供一种检测新冠疫苗注射后体内中和抗体的胶体金免疫层析试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的胶体金免疫层析试纸条。

第四方面，本发明提供如第一方面所述的胶体金免疫层析试纸条和/或如第三方面所述的检测试剂盒用于对注射新冠疫苗后对人体内所分泌的中和抗体快速定性检测。

本发明中，所述试纸条的使用方法，具体如下：

(1)吸取10μL待检样本缓慢滴加于试纸条的加样孔中；

(2)计时，10-15分钟读取结果，15分钟后结果可能出现异常。

结果分析：

阳性(+)：出现位于检测线和质控线，表示样本中存在新冠疫苗所引发的中和抗体。

阴性(-)：仅质控线出现一条红色条带，在检测线无红色条带出现，表示样本中存在新冠疫苗触发的中和抗体。

无效：质控线未出现红色条带，可能是由于不正确的操作或试剂已失效。在任何情况下，应重新测试。如果问题仍然存在，应立即停止使用此批号产品，并与当地供应商联系。

注意：由于样本中中和抗体浓度的不同，检测线和的红色条带会显现出不同深浅的颜色。但是，本试剂的测试结果不能作为判定样本中中和抗体梯度高低的依据。

本发明采用标记了胶体金的重组新型冠状病毒RBD蛋白的结合垫与喷涂包被了血管紧张素转化酶2（ACE2）的硝酸纤维素膜的组合。采用竞争法免疫层析的原理，实际样本中的中和抗体在侧向移动的过程中会与硝酸纤维素膜上的血管紧张素转化酶2（ACE2）竞争标记了胶体金的重组新型冠状病毒RBD蛋白。若样本中中和抗体足够，则呈现检测线无显色质控线显色的结果，说明注射疫苗后产生抗体，疫苗产生中和抗体；若样本中中和抗体不足，呈现检测线显色、质控线显色的结果，说明注射疫苗后未产生抗体。实现了对注射新冠疫苗后对人体内的中和抗体快速定性检测，且灵敏度高，批内、批间差异小，为临床使用提供了极大便利。

与现有技术相比，具有如下有益效果：

(1)本发明所述胶体金免疫层析试纸条采用竞争法检测人体内中和抗体，具有较好的敏感性、特异性、重复性和稳定性，对目标化合物的回收率较高，检验结果准确可靠；

(2)本发明所述胶体金免疫层析试纸条通过在胶体金垫添加分离剂，使得重组新型冠状病毒RBD蛋白与胶体金颗粒的结合更加稳定，进一步降低了金免疫层析试纸条的检测限；

(3)本发明所述胶体金免疫层析试纸条对于中和抗体的检测均有较高的灵敏度和特异性。

附图说明

图1为本发明胶体金免疫层析试纸条的结构示意图；

图中，1.样品垫 2. 胶体金垫 3.硝酸纤维素膜 4.检测线 5.质控线 6. 吸水滤纸 7. PVC底板。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。

实施例中所用的试剂和仪器设备的来源：

重组新型冠状病毒RBD蛋白、血管紧张素转化酶2（ACE2）、为鼠抗鸡IgG抗体购自深圳幂次方生物科技有限公司；硝酸纤维素膜购自默克密理博；三维平面划膜仪购自上海金标生物科技有限公司；切条机购自上海金标生物科技有限公司；PVC胶板、吸水纸、玻璃纤维膜和卡壳购自上海金标生物科技有限公司。

实施例1：胶体金免疫层析试纸条的制备

胶体金免疫层析试纸条按照下述方法制备，其结构如图1所示：

在聚氯乙烯(PVC) 底板7上从左到右依次相互搭接地贴上样品垫1、胶体金垫2、硝酸纤维素膜3和吸水滤纸6，然后将PVC底板7及贴附的材料切成宽度为3mm的试纸条，并装入卡壳内，卡壳上开有加样区和显色区(观察区域)。

其中，样品垫1为玻璃纤维膜；胶体金垫2上包被有胶体金标记的重组新型冠状病毒RBD蛋白；硝酸纤维素膜8上包被有血管紧张素转化酶2（ACE2）检测线4，还包被有鼠抗鸡IgG抗体作为质控线5；检测线4与质控线5的距离为3cm。

实施例2：抗体包被

首先，用包被缓冲液0.05mol/L pH为7.2-7.4的PB稀释鼠抗鸡IgG抗体和血管紧张素转化酶2（ACE2），得到检测线4鼠抗鸡IgG抗体包被液和质控线5血管紧张素转化酶2（ACE2）稀释液；

其次，将得到的稀释液使用喷金划膜仪划到硝酸纤维素膜，按0.1μL/cm的条件进行划线；

最后，将硝酸纤维素膜置于烘箱37℃进行干燥3小时，干燥后加干燥剂密封保存；

实施例3：胶体金垫的制备

（1）器皿洗干净，采用硝酸钾将胶体金颗粒的pH值调整至8.5，加入器皿中，再向其中加入终浓度10％的PEG6000分离剂，再加入重组新型冠状病毒RBD蛋白至终浓度30μg/ml，搅拌40min，得到胶体金溶液；

（2）向步骤（1）得到的胶体金溶液中加入10％BSA封闭液至终浓度到1％进行封闭15min；

（3）将步骤（2）得到的胶体金溶液使用4℃、12000 rpm进行离心40min，离心后去上清，使用复溶液复溶沉淀，得到重组新型冠状病毒RBD蛋白标记液；

所述复溶液为吐温20和BSA两种的混合；

（4）将步骤（3）得到的重组新型冠状病毒RBD蛋白标记液使用喷金划膜仪按0.1μL/mm进行喷涂到玻璃纤维膜上；

（5）将步骤（4）的玻璃纤维膜在37℃烘箱中干燥240min，干燥后加干燥剂密封保存，即得到胶体金垫。

实施例4：

胶体金试纸条的组装，如图1所示：

首先，将包被好的硝酸纤维素膜3和胶体金垫2与吸水滤纸6、样品垫1在PVC底板7上进行组装；

其次，将得到的组装板用切条设备切成3mm的胶体金试纸条；

最后，将得到的试纸条置于密封袋中加干燥剂保存。

如图1所示，本发明的胶体金试纸条的检测原理，具体如下：

在加样区(样品垫)加入被检测样品后，通过毛细作用，检测中和抗体的区域中：样品中中和抗体-RBD-胶体金的结合物向吸水纸一端的方向移动。如果被检测样品中含有该中和抗体，样品移动到检测线4即血管紧张素转化酶2（ACE2）时，中和抗体-RBD-胶体金的结合物中的RBD不再与血管紧张素转化酶2（ACE2）结合，不显示一条红色条带；样品继续流动，流动到质控线5即鼠抗鸡IgG抗体时，会出现一条红色条带，证明该试纸条的有效性。若检测的实际样品中不存在中和抗体时，中和抗体-RBD-胶体金不会形成免疫复合物，则复合物中的RBD与血管紧张素转化酶2（ACE2）结合，在检测线4处显示红色条带，而后在质控线5显色。只要质控线5不显色，证明该试纸条无效，需要重新检测实际样品。