一种游离DNA保存试剂及制备方法

技术领域

本发明属于生命科学和生物技术领域，特别一种游离DNA保存试剂及制备方法。

背景技术

循环游离DNA(cfDNA)是1948年发现的细胞外碎片DNA，主要来源于细胞坏死、凋亡。由肿瘤细胞释放的cfDNA通常称为循环肿瘤DNA(ctDNA)，其中一些能反应肿瘤特异性特征，如体细胞突变等，通过检测ctDNA可以很好的代表患者肿瘤的特征，动态监测ctDNA变化，对患者的疾病复发及疗效进行评估等。随着母血中胎儿游离DNA(cell-free fetalDNA,cffDNA)的发现，发展了无创产前筛查(non-invasive prenatal)。这些游离DNA片段大小集中在100-300bp，根据多篇文献报道，一般EDTA抗凝管，采血后都需要尽早分离出血浆，2小时内最佳，6小时已经降解，超过24小时反而含量增加，是因为采血管里的细胞凋亡后重新释放的游离DNA增加，而会稀释原本的游离DNA，尤其是对于无创产筛而言，新凋亡的细胞释放的游离DNA为母亲的游离DNA，会将原本不多的胎儿游离DNA稀释，导致检测失败或假阴性存在。正如前面所述，EDTA抗凝管采集全血后，立即分离出血浆是最佳的，但有的全血样本是要外送检测，立即分离的血浆需要干冰保存运输，这样运输成本大大增加。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种游离DNA保存试剂，可以保存DNA完整片段，并可实现室温保存至少3-5天，大大降低了保存和运输成本。

一种游离DNA保存试剂，其特征在于，所述游离DNA保存试剂包括乙二胺四乙酸钾盐(EDTA盐)、甲醛、甘氨酸、Tris-HCL、氯化钠和去离子水；各组分的质量百分比如下：

乙二胺四乙酸钾盐 1.5-5％

甲醛 0.1-1％

甘氨酸 1-3％

Tris-HCL 5-10％

氯化钠 1-20％

去离子水余量。

优选地，各组分的质量百分比如下：

更为优选地，各组分的质量百分比如下：

乙二胺四乙酸盐(EDTA盐)能与血液中的Ca离子结合成螯合物，凝血过程被阻断，不能凝血，血液也不能发生凝固。本保存试剂所用的EDTA盐为钾盐，可以为EDTA-K2，也可以为EDTA-K3。在血液中，最佳浓度为1.5mg/ml。EDTA钾盐，溶解度最高，抗凝速度最快。浓度15％的水溶液，每ml血液加1.2mgEDTA，即每5ml血液加0.04ml15％EDTA溶液，不影响白细胞计数，对红细胞形态影响最小，并且可以抑制血小板聚集。若浓度过高则会造成细胞皱缩，另EDTA溶液PH值与盐类关系较大，低PH可使细胞膨胀，可使红细胞体积轻度膨胀，采血后短时间内平均血小板体积非常不稳定，半小时后稳定。最佳浓度为1.5mg/ml血液。甲醛的作用是防腐和固定红细胞，氯化钠可以调节渗透压。

本发明的第二个目的在于提供上述游离DNA保存试剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将定量的乙二胺四乙酸二钠、Tris、氯化钠、甘氨酸置于烧杯中，加入去离子水溶解，再加入甲醛，用1％盐酸调节pH至5.8～6.8，最后添加去离子水定容至100mL，混合均匀；0.25μm滤膜过滤除菌，即得游离DNA保存试剂。

有益效果：本发明设计了NG淋病奈瑟菌的引物，采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。

附图说明

图1是使用本发明的保存液保存的孕妇外周血5天，文库片段分析图。

具体实施方式

实施例1

按以下质量百分比配制游离DNA保存试剂：

配制方法：将乙二胺四乙酸二钠、Tris、氯化钠、甘氨酸置于烧杯中，加入80％去离子水溶解，再加入甲醛，用1％盐酸调节pH至5.8～6.8，最后添加剩余去离子水定容至100mL，混合均匀；0.25μm滤膜过滤除菌，即得游离DNA保存液。

实施例2

使用实施例1配制的游离DNA保存液，采集孕妇自愿者外周血，常温保存全血游离DNA 5天。使用上述全血，用安诺优达核酸提取试剂和胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒进行提取cfDNA，并建库，所得结果及文库片段分析如下：

图1是使用本发明的保存液保存的孕妇外周血5天，文库片段分析图，片段大小符合200bp-300bp片段/200bp-400bp片段比例＞70％，且主峰位置＜280bp。