填充的不可压缩色谱树脂及其制备方法

本申请要求于2018年10月31日提交的题为“填充的不可压缩色谱树脂及其制备方法”的美国专利申请号62/753,604的优先权的权益，该申请通过整体引用并入本文。

技术领域

本公开涉及包含不可压缩树脂的填充色谱柱及其制备方法。

背景技术

柱色谱法是一种分离和/或纯化技术，其中填充色谱介质(也称为树脂)的固定“床”包含在刚性管或色谱柱内。填充介质可以是固体或凝胶颗粒(“固定相”)或涂覆有液体固定相的固体载体材料的形式。无论哪种方式，填充介质通常填充色谱柱管的内部容积。

通常，色谱柱分离涉及液体样品(“流动相”)通过色谱柱并通过色谱介质的填充“床”。样品中的一些化合物将与固定相结合并可能相对于流动相变慢；与固定相结合较强的化合物比那些结合不太强的化合物更慢地移动通过色谱柱，且该差异导致化合物在它们通过并离开色谱柱时彼此分离。

一组重要的树脂在固定相中使用陶瓷羟基磷灰石颗粒(CHP)。CHP颗粒通常形状不规则且不可压缩，并且在强烈压缩、振动或混合下可能破裂或剪切。由于CHP树脂的敏感性，可能难以在CHP颗粒没有劣化的情况下获得稳定的填充床。根据当前行业协议填充的床预制色谱柱的运输和长期存储可导致运输和存储期间的沉降或颗粒固结。现场填充的CHP色谱柱也容易因重复存储和使用周期而沉降，导致在色谱柱的上部流量调节器和床的上表面之间形成间隙。如果此间隙变得足够大，它会形成一个混合室，导致差的色谱分离度。对于许多应用，具有高CHP颗粒结构完整性的稳定的预填充CHP色谱柱将是理想的，但是目前还没有这样的色谱柱。

发明内容

本公开提供了预填充CHP色谱柱及其制备方法。填充床的稳定性得到提高，导致色谱柱在运输和/或存储后以及在多次使用后保持高性能。

一方面，本公开涉及一种色谱柱，其具有：具有第一端和第二端的管状构件，固定到管状构件第一端的第一流量分配器，固定到管状构件第二端的第二流量分配器，以及填充色谱介质。填充色谱介质可以包含不可压缩组分，且可以设置在第一和第二流量分配器之间的管状构件中，并且可以通过在第一和第二流量分配器之间压缩而形成填充色谱介质。色谱柱的分离性能可以由理论塔板高度(HETP)值和不对称值表征。在振动暴露之后，HETP值变化不可多于10％、20％或30％和/或不对称值变化不可多于10％、20％或30％，所述振动暴露选自(I)25mm总固定位移的固定位移振动或(II)总G

另一方面，在冲击暴露之后，其中(a)HETP值变化不可多于10％和/或(b)不对称值变化不可多于10％，所述冲击暴露选自(I)150mm的跌落、(II)造成至少1.7m/s速度变化的倾斜冲击或(III)造成至少1.7m/s速度变化的水平冲击。在一系列振动暴露-冲击暴露-振动暴露之后，HETP值变化不可多于10％和/或不对称值变化不可多于10％，其中所述冲击暴露选自(I)150mm的跌落、(II)造成至少1.7m/s速度变化的倾斜冲击或(III)造成至少1.7m/s速度变化的水平冲击，并且其中所述振动暴露选自(IV)25mm总固定位移的固定位移振动或(V)总G

在另一个实施方案中，填充色谱柱的第一和第二流量分配器中的至少一个包含多孔的聚乙烯、聚丙烯或聚四氟乙烯玻璃料。

在一方面，本公开涉及一种色谱柱(例如贮存稳定和/或运输稳定的色谱柱)，其包括具有第一端和第二端的管状构件，固定到管状构件第一端的第一流量分配器，固定到管状构件第二端的第二流量分配器，以及包含不可压缩组分的填充色谱介质，所述填充色谱介质设置在第一和第二流量分配器之间的管状构件中。可以通过在第一和第二流量分配器之间压缩而形成填充色谱介质。

在各种实施方案中，填充色谱介质可以被压缩至少2％。填充色谱介质可以被压缩不多于20％。

本公开进一步涉及一种色谱柱，其中管状构件在操作过程中垂直定向，并且其中管状构件内的填充色谱介质的高度在至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个色谱使用循环后保持基本恒定。

在各种实施方案中使用的色谱柱包括如下的色谱柱：其中色谱柱的分离性能由理论塔板高度(HETP)值和不对称值表征，并且其中(a)在至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个色谱使用循环后，HETP值降低不多于2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％或50％，和/或(b)在至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个色谱使用循环后，不对称值增加或减少不多于5％、10％、20％、30％、40％或50％。

本公开进一步涉及一种色谱柱，其中管状构件在操作过程中垂直定向，并且其中管状构件内的填充色谱介质的高度在运输或存储前后保持基本恒定。

在各种实施方案中使用的色谱柱包括如下的色谱柱：其中色谱柱的分离性能由理论塔板高度(HETP)值或不对称值表征，并且其中HETP值和/或不对称值在运输或存储前后保持基本恒定。计算HETP值的方法在本领域是已知的。

本公开还涉及一种色谱柱，其中管状构件内的填充色谱介质的高度在运输或存储前后保持基本恒定。

在又一方面，本公开涉及一种制备色谱柱的方法，其包括在第一和第二流量分配器之间将沉降的色谱柱介质压缩至少2.5％，从而制备填充色谱介质。

继续本公开的此方面，在一些实施方案中，填充色谱介质被压缩不多于20％。

此外，在一些实施方案中，第一和第二流量分配器中的至少一个包含多孔的聚乙烯、聚丙烯或聚四氟乙烯玻璃料。

计算不对称值的方法在本领域是已知的。模拟存储和跌落条件的方法在本领域是已知的，例如国际安全运输协会2B测试。

在各种实施方案中，在振动暴露之后，HETP值和/或不对称值变化不可多于10％，所述振动暴露选自(I)25mm总固定位移的固定位移振动或(II)总G

色谱柱的分离性能可以由理论塔板高度(HETP)值或不对称值表征，且其中HETP值和/或不对称值在运输或存储前后保持基本恒定。

在一个方面，本公开可以描述制备色谱柱的方法。此方法可以包括在第一和第二流量分配器之间将沉降的不可压缩色谱介质压缩至少2.5％，从而制备填充色谱介质。

在各个方面，填充色谱介质可以被压缩不多于20％。第一和第二流量分配器中的至少一个可包含多孔的聚乙烯、聚丙烯或聚四氟乙烯玻璃料。不可压缩色谱介质可以是陶瓷羟基磷灰石树脂。可以将不可压缩色谱介质倒入色谱柱中至床高8-25cm。可以将第一玻璃料插入到色谱柱的底部，可以将陶瓷羟基磷灰石树脂浆料倒在第一玻璃料上以达到15-20cm的高度，并且可以将流量分配器和第二玻璃料插入到色谱柱中。可以以200cm/小时流动填充树脂，流量分配器可以降低到树脂的1mm以内，并以200cm/小时流动填充。

附图说明

图1示出了如本文所述实施方案中使用的示例性色谱柱的示意图。

图2是图1的色谱柱的示意性横截面。

图3示出了对照填充色谱柱预固结的洗脱曲线。

图4示出了床固结后对照填充色谱柱的洗脱曲线。

图5示出了轴向压缩前色谱柱的洗脱曲线。

图6示出了图5中测试的同一色谱柱在轴向压缩后的洗脱曲线。

图7示出了床干燥后图6的色谱柱的洗脱曲线。

图8示出了水平运行的图7的色谱柱的洗脱曲线。

图9示出了图7的色谱柱返回到垂直位置的调节运行的洗脱曲线。

图10示出了14cm压缩填充ISTA2B测试前后的压力相对流量曲线。

图11示出了在45.7cm I.D.色谱柱上放大压缩填充的ISTA2B测试前后的压力相对流量曲线。

具体实施方式

如本文所用，术语“床高”指包含在完整色谱柱内的填充色谱介质颗粒的床的线性高度。

如本文所用，术语“填充床”指色谱柱内色谱介质颗粒的最终状态。此最终状态通过多种方式实现。例如，如本文所述，一种方法是结合流体流动，然后在流量分配器之间轴向压缩床。本领域已知的其他方法包括颗粒的重力沉降、振动沉降和/或仅机械轴向压缩。

如本文所用，术语“流量分配器”是固定在色谱柱的每一端或附近的部件，例如圆柱形部件。流量分配器可以是提供多种用途的多部件组件。一个功能是通过端口将液体送入/送出色谱柱，该端口可以与将液体送入或进出色谱柱的不同管道/管匹配。另一个功能是引导液体从一个或多个较小的通道流入，以将液体尽可能均匀地分布在填充床的整个横截面积上。相反，在色谱柱出口侧的流量分配器必须有效地收集分布在整个横截面积上的液体，并通过一个或多个较小的通道(例如，200mm色谱柱可以具有6mm直径的入口/出口)将液体送出色谱柱。

如本文所用，术语“床支撑物”是允许各种液体通过但保留构成填充床的填充介质的小颗粒的网、筛、网格或玻璃料。这些床支撑物可以直接连接至流量分配器。

如本文所用，术语“永久性结合(permanent bond)”和“永久性结合的(permanently bonded)”用于表示两个部件之间这样的结合不能被分开，除非通过破坏结合或破坏结合的部件(例如管和流量分配器)中的一个或两个。

如本文所用，术语“诱导环向张力”指通过插入外径大于管内径的流量分配器而在管壁中产生的周向应力。这些值之间的直径差在本文中称为过盈配合。当流量分配器被迫压缩和向内偏斜且管壁向外拉伸时，通过由于过盈配合产生的内应力触发诱导环向张力。

如本文所用，应用于色谱柱的术语“贮存稳定”指这样的色谱柱能够承受通常在例如仓库的存储环境中发现的频率和幅度的振动或冲击，而没有结构特征和性能特征的显著退化。贮存稳定性还包括在数天、数周或数月的存储周期内保持性能特征和结构特征。

如本文所用，应用于色谱柱的术语“运输稳定”指这样的色谱柱能够承受通常在运输环境(例如公路、铁路和/或航空运输环境)中发现的频率和幅度的振动、冲击和旋转，而没有结构特征和性能特征的显著退化。

可以根据本领域当前使用的方法，例如在国际安全运输协会2B测试(ISTA2B)中描述的协议，来评估贮存和运输稳定性。

连词“或”和“和/或”作为非排他性的析取词可互换地使用。

不定冠词“一(a)”和“一(an)”指关联名词中的至少一个，并且可与术语“至少一个”和“一个或多个”互换使用。例如，“一个模块”指至少一个模块，或一个或多个模块。

本公开提供一种装载有例如陶瓷羟基磷灰石珠粒的不可压缩材料的填充色谱柱，其表现出对许多常见的环境和使用因素(包括运输、储存和多种用途)稳定的良好的分离特性。尽管不希望受任何理论的约束，但据信本公开的色谱柱的特征在于包含“互锁的”不可压缩颗粒的填充床，所述不可压缩颗粒紧密堆积并且例如在受到振动时抵抗相对于彼此的运动。此外——同样，不希望受任何理论的约束——在某些实施方案中，填充床与刚性元件(例如流量调节器或刚性玻璃料)紧密并置或甚至接触，最小化松弛空间以限制色谱柱内容物的晃动。这对于承受运输和搬运过程中施加在色谱柱上的力可能特别有用。

首先谈谈所述色谱柱的性能特征，它们通常以低不对称度(例如0.9、1、1.1、1.2、1.1-1.2等)和与常规制备的塔板相当的HETP(理论塔板高度)值为特征。本公开的色谱柱的直径可以从1-200cm直径变化，例如5cm、10cm、12.6cm、25cm、45cm或60cm内径。这些色谱柱的床高可以从5至60cm变化，例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60cm、10-30cm等。

本公开的色谱柱是通过将树脂浆料倾倒在例如聚合物玻璃料的刚性体顶部上，并且在通过流动沉降制备了稳定床之后，使用第二刚性体向该床施加压缩力而制备的。在一些情况下，第二刚性体是位于色谱柱的流量调节器下方或与流量调节器成一体的第二聚合物玻璃料，这有利地允许在色谱柱组装期间快速完成床的压缩，而不需要使用任何非一体部件。聚合物玻璃料可以包含完全刚性的材料，或者它可以稍微柔软，以吸收在压缩过程中施加的一些压缩力。在压缩过程中，床被压缩2％至20％，例如2.5％、5％、10％、12.5％、15％、17.5％等。所述压缩以任何合适的间隔施加，并且可以施加一次或多次。替代地或附加地，如下所述，其他填充方法可以与轴向压缩相结合，包括振动和/或敲击。一旦床被填充，就可以以常规方式继续色谱柱的制备。

根据本公开制备的色谱柱通常能够承受在运输过程中可能施加的力，包括振动和跌落。在某些情况下，可以模拟这些力，并可以测试色谱柱的性能，以确保在释放色谱柱进行运输之前，HETP值或不对称值足够。

应该注意，制造商通常不鼓励压缩CHP树脂，因为认为施加压缩力可能导致CHP颗粒破裂。此外，一些制造商填充方案被称为“轴向压缩填充”，但不需要如本公开的方法一样施加机械压缩力；相反，这些现有方法利用气体来搅动浆料。例如，GelTec

还应注意，已经参考预填充色谱柱设计描述了上述填充床及其制备方法。本领域技术人员将理解，这些填充床及其制备方法可以应用于任何合适的色谱柱设计或用途，包括但不限于现场浇筑床和/或具有高度可调的流量调节器的色谱柱。某些色谱柱配置可以不承受与上述预填充色谱柱相同的应力，但仍将受益于通过本公开的实施方案获得的性能和稳定性的改善。在不限制前述的情况下，在本公开的某些实施方案中使用利用玻璃壁容器的现场填充色谱柱设计(例如马萨诸塞州比勒利卡市EMD Millipore的

在本文中描述并在图1和图2中描绘的色谱柱50主要由色谱柱管20和一对流量分配器24A、24B(或一个流量分配器和一个端盖)组成。流量分配器24A、24B包括圆柱形盘和能够使液体流入和流过所述盘的一个或多个入口管/出口管。另外，流量分配器24A、24B可包括附接到流量分配器盘的填充介质侧的床支撑物、筛和/或过滤器。色谱柱50在流量分配器与色谱柱管之间也可能或可能不结合O形环，但本公开的色谱柱不是必须需要O形环。

流量分配器24A、24B的流路可以根据标准实践和已知设计来设计，并且流量分配器本身可以例如由与管相同或相似的塑性材料制成，但是也可以由金属、陶瓷和对待流过色谱柱的液体和试剂呈惰性的其他材料制成。

管20是中空的圆柱形构件，其通常是允许流体(例如液体)从第一端(例如上端)流到第二端(例如下端)的圆形圆柱。管内径被设计尺寸并配置成容纳用于向管输送流体和从管中移除流体的流动分配器。基于各种色谱柱的性能规格，管20可以制成多种不同的尺寸和配置。在一些实施方案中，管20被设计尺寸并配置成在系统的诱导内部操作压力下保持结构完整性，同时能够承受高达约185psi(例如约20、30、40、50或60psi)的内部压力。在一些实施方案中，管20通常是圆柱形构件，其内径为约10cm至约100cm，且其长度为约10至约90cm。管20被最初选择为期望的最终床高的约两倍长，并且在两个流量分配器都固定在色谱柱管内的适当位置后切短。

一般来说，基于多种因素，管20的总诱导环向张力可以基于最终用户的规格而变化，例如色谱柱将经受的预期内部压力。例如，管20必须具有足够厚或足够坚固的壁以避免在流量分配器插入期间管的屈服。例如，管20的壁厚可以足够大，使得它可以通过获得期望的诱导环向张力来承受高于最大操作压力的足够的安全系数。例如，根据材料的性质，例如对于聚丙烯，20cm色谱柱具有标称内径为199.90mm、标称壁厚为10.0mm的管。30cm聚丙烯色谱柱具有标称内径为300.00mm、标称壁厚为13.0mm的管。在一些实施例中，根据材料的性质，内径为200mm的管的壁厚应为约7.5mm至15mm，例如约8、9、10、11、12或13mm。直径为300mm的管的壁厚应为约10至20mm，例如约12、13、14、15、16、17或18mm。可以指定管的壁厚，以使管具有合适的强度以承受使用过程中的内部压力(例如约20psi至约40psi，例如20、25、30或35psi)。此外，适当的壁厚有助于在整个预期的操作压力范围内保持色谱柱的几何形状(例如体积)，从而限制色谱柱壁的挠曲量，这将有助于确保色谱柱的适当功能。由热塑性塑料制成的管中的壁可能更薄，该热塑性塑料由额外的结构材料(例如玻璃或碳纤维或颗粒)增强。

在一些实施例中，管的诱导环向张力应为25PSI至250PSI，例如约50、75、100、125、150、175、200、225或250PSI。可以指定管的诱导环向张力，以使管具有合适的材料特性以承受使用过程中的内部压力(例如约20psi至约40psi，例如20、25、30或35psi)。此外，足够的诱导环向张力有助于在整个预期的操作压力范围内保持色谱柱的几何形状(例如体积)，从而限制色谱柱壁的挠曲量，这将有助于确保色谱柱的适当功能。适当的诱导环向张力还允许色谱柱承受大的操作压力并保持液压密封，而不永久地固定在适当位置。

另外，管的内壁可在端部或至少在一端变薄或减小厚度，以形成约0.0至约20度，例如约1、3、5、7、9、11、13、15或17度的斜坡或倒角，这可以利于流量分配器的插入。倒角应从管端向内延伸约10mm至约30mm。如下面详细讨论的，流量分配器的外径大于管的内径，并且倒角在制造过程中帮助将流量分配器对齐到管。

在一些实施方案中，管是具有在每一端处沿着内表面形成的倒角的圆柱体。流量分配器被设计尺寸并配置成容纳在管中，其具有液压连接到出口孔的入口孔和流体分配导管网络，例如从入口孔延伸到流量分配器的填充介质侧的凹槽。因此，流量分配器被配置成在一个或多个入口位置处从流量分配器的第一侧接收流体，并沿着流量分配器的第二侧径向向外分配流体，所述流量分配器第二侧在其插入管中时面向填充介质。此外，通常通过反转流动方向，流量分配器可沿其整个第二侧接收流体，并将流体向内引导到第一侧上的一个或多个出口位置。

通常，流量分配器24A、24B是其外径略大于它们要插入的管的内径的圆形的盘状构件，使得其插入将产生过盈配合，所述过盈配合足以诱导有效地预防泄露至期望内压的环向张力。因为流量分配器相对径向不可压缩且管壁相对柔软，所以过盈配合引起管膨胀，导致液密密封的形成。例如，对于内径为200mm的聚丙烯管20，聚丙烯流量分配器的外径可以在201至204mm之间(例如，大约202mm)。对于300mm的内径，流量分配器24的外径可以为约302至306mm。管20和流量分配器24A、24B都被设计成使得在组装过程中引起的环向张力小于材料的屈服强度。因此，在色谱柱的寿命期间，管壁以及在许多实施例中的流量分配器在较小程度上经历塑性变形并保持其环向张力。正是这种环向张力值确保了管和流量分配器接口处的防泄漏密封，并限制了色谱柱的最大操作压力。

配件是可以紧固或固定到流量分配器的机械附件，以将流体输送到流量分配器和其中布置有流量分配器的管或者从流量分配器和管中移除流体。为了输送流体，配件具有沿着其中心轴线穿过配件形成的流体输送孔。配件还包括要容纳在流量分配器的配件孔中以保持配件的一个或多个特征。如图1和图2所示，配件38具有螺纹端40(例如M30×3.5螺纹端)，以接合流量分配器24。配件38还具有螺母部分42，螺母部分42可以由用于将配件38转动并固定在配件孔26内的工具(例如扭矩扳手)夹持。在一些实施方案中，配件38包括其他类型的连接机构，例如结合剂、焊接、卡口或鲁尔连接件，或其他足够的连接技术。

色谱柱50还可以进一步包括顶端盖54，顶端盖54包围管20和上部流量分配器24A。顶盖54包括容纳和固定管20的一部分(例如上部)的特征(例如孔、凹部或夹持元件)。顶盖54包括入口配件孔56和出口配件孔58，入口配件孔56和出口配件孔58被设计尺寸并配置成分别容纳入口配件38A和远程快速断开出口配件48。顶盖54还可以包括一个或多个手柄60，其可用于拾取和搬动色谱柱50或用于操纵/引导具有整体脚轮或之前放置在滚动推车/手推车上的较大的色谱柱。顶盖54由任何各种结构上合适的材料(例如金属、塑料或复合材料)制成，所述材料可以在用手柄提起色谱柱时支撑色谱柱的重量。在此实施例中，顶盖由ABS、PE、PP或玻璃填充(例如玻璃纤维)塑料制成。

还可以进一步包括护罩或侧护件62。护罩62可以被设计尺寸并配置成从底座52延伸到顶盖54并且覆盖色谱柱50的一些内部部件(例如将出口配件38B连接到远程出口配件48的软管46)。护罩62可由任何各种合适的材料(例如金属、塑料或复合材料)形成。

在色谱柱的制造和填充过程中，将顶部和底部流量分配器24A、24B安装(例如压配合)到管20的顶部和底部。在一些实施方案中，在插入顶部流量分配器24A和用介质材料填充管20之前，将管20和流量分配器24A、24B中的一个或两个永久性结合。在对色谱柱进行满意的测试之后，第二个(例如顶部)流量分配器24A任选地永久性结合在适当的位置。这样的永久性结合不能被容易地分离，除非通过破坏粘合或粘合的物品(例如管20和流量分配器24A、24B)。在上端处，附加盖(例如顶盖)54可以任选地安放在管20上并固定到管20并对齐，使得安装在色谱柱顶部处的流量分配器24A上的入口配件38A穿过附加顶端盖54的入口配件孔56。这样的任选的顶盖54(主要是美学特征件)可以使用各种固定机构(例如紧固件、结合剂、管和顶盖之间的摩擦或其他机构)固定到管20。

在下端处，管20可以任选地安放在底盖(例如底座)52上并固定到底盖(例如底座)52。底座52可以使用各种固定机构(例如紧固件、结合剂、管和底盖之间的摩擦或其他机构)固定到管20。当使用任选的底座52时，安装在管20底部处的流量分配器24B上的出口配件38B可以延伸到任选的底座52中的空腔中，并且从底部流量分配器24B连接到出口配件38B的软管46向外导向管20周边外侧的区域。如所示出的，软管46可以从任选的底座52引出并沿着管20的侧面向上引导，以连接到固定在色谱柱50的顶部处或附近的远程快速断开出口配件48。通过使用软管46并将远程出口配件48布置在色谱柱50的顶部附近，用户不需要接近管20的下侧，从而使得色谱柱50使用更容易。

色谱柱部件(例如管20、流量分配器24A、24B、配件38A、38B和其他部件)可以由各种结构和化学上合适的材料中的任一种制成。例如，所述部件可以由一种或多种热塑性塑料(例如丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)、丙烯酸(例如PMMA)、聚丙烯(PP)、聚氯乙烯(PVC)、聚四氟乙烯(PTFE)、其他热塑性塑料或复合材料)和热固性塑料(例如环氧树脂和纤维(例如玻璃纤维或碳纤维)增强塑料)制成。材料选择考虑因素包括材料的特定机械性能以及材料是否将承受系统的诱导内部工作压力。

本公开的原理将通过以下非限制性实施例进一步说明:

为了使用现有的填充方法建立色谱柱性能的基线，使用标准振动填充方法用40μm陶瓷羟基磷灰石1型树脂(加利福尼亚州赫拉克勒斯市的Bio-Rad的

如下执行三次敲击循环：在无流动的情况下，使用塑料棒以每分钟2-3次敲击的速度敲击该色谱柱。进行三次敲击循环。在每个循环中，以半随机模式围绕柱的圆周和沿柱的长度进行敲击1分钟，或K10气动球振动器(英国萨塞克斯郡Vibratechniques有限公司的K-10)以30PSI和大约375Hz进行敲击。然后以200cm/小时重新开始流动1分钟。

在三次敲击循环后，床高稳定在15.8cm。这是6mm或3.7％的固结。

在床固结之前，性能测试得出的塔板数为11041N/m，不对称度为1.1(图3)。制造商对40μm CHP性能的指南是塔板数大于4500N/m且不对称度在0.8和2.3之间。对于一些应用，可以接受大于3000N/m的塔板数。在振动固结后，塔板数下降至1339，不对称度为1.51(图4)。该填充床将不再被认为是可用的。

结果见下表1：

这些结果描述了在这种填充方法中获得的低性能。

如在实施例1中所述，在敲击循环之前进行色谱柱填充和流动沉降。如图5所示，测试了色谱性能。然后，通过手动降低顶部玻璃料和流量分配器并将床压实2.5％至床高为16.0cm来施加轴向压缩。压实后没有立即进行测试；相反，进行敲击循环以评估床的稳定性，并查看是否发生了额外的固结。床高未见降低，表明床没有进一步固结。

轴向压缩填充的结果如下表2所示：

轴向压缩色谱柱的色谱性能稍好于初始结果(15341N/m，相比于12539N/m)(表2，#3)(图6)。为了进一步对压缩填充床进行应力测试，将色谱柱用K10振动器振动三个完整循环并进行测试。振动循环不显著影响填充床。未观察到床高降低，且塔板数稳定在12,000N/m以上。不对称度也未改变(表2，#4)填充色谱柱经受另外的3轮振动和敲击，然后进行测试。未观察到对性能结果的影响或进一步的床固结(表2，#5)。

对实施例2中制备的压缩填充色谱柱进行了三种另外的应力测试。首先，通过空气注入将色谱柱干燥。将60ml空气(床体积的25％)注入色谱柱顶部。立即测试色谱柱而没有再水化期，尽管注意到内径较大的色谱柱可能会受益于再水化期。视觉上，随着空气排出出口管线，色谱柱是干燥的，但在脉冲注入测试过程中，在向下流动的第一分钟内，色谱柱迅速再水化。塔板或不对称度没有明显变化(表2，#6)(图7)。

其次，通过将流量适配器降低另外的2mm来施加另外的压缩力。重新测试色谱柱，未检测到性能的显著变化(表2，#7)。

最后，水平操作色谱柱以评估色谱柱的填充质量——松散填充的色谱柱预计会重新沉降并形成流动通道，从而降低性能。将色谱柱在水平位置以100cm/hr的流量运行1小时，然后在相同条件下测试。塔板数的损失小于10％，但观察到不对称度的显著变化，为1.15至1.69(表2，#8)，以及色谱图中可见峰的轻微拖尾(图8)。尽管这一变化显著，但未使性能结果超出规格。视觉上，在床内没有观察到通道或间隙。

将色谱柱垂直重新放置，并以100cm/hr流动调节1个柱体积(CV)，然后进行测试(表2，#9)(图9)。不对称度提高到1.24但塔板数下降到9212N/m，仍然是非常高的效率结果。进行另外2个CV的流动调节，然后测试。不对称度不变化，但塔板数提高到13288N/m，表明床可以修复到接近原始性能(表2，#10)。结果表明，压缩床非常坚固，甚至可以使用与制造商的指南相抵触的非水平床操作。

基于这些结果，在此色谱柱尺寸下使用轴向压缩将床压实2.5％，足以稳定床高使其免于进一步固结，并纺织由于振动剪切导致的性能损失。此结果与基于CHT

实施例4：测试填充床压缩的不同水平

为了确定压缩对色谱效率和不对称度的影响，用40μm陶瓷羟基磷灰石1型树脂(加利福尼亚州赫拉克勒斯市的Bio-Rad的CHT

在将流量分配器压缩到沉降的树脂床中之前，测试色谱柱的HETP(N/m)和不对称度。没有床压缩的初始测试结果为6985N/m和不对称度为1.85。然后将流量分配器以0.5cm的间隔降低到树脂床中并在每个点进行性能测试。在降低顶部流量分配器之前，从在100cm/hr下观察到的原始流动沉降床高(23cm)计算压缩百分比。效率和不对称度随着压缩增加到最高8.7％而得到改善，然后随着另外的压缩而缓慢降低。在19.6％的压缩下柱效率为6366N/m和不对称度为1.42。此结果仍符合制造商推荐的性能规格。所有性能结果均在表3中。

表3.可在下表中找到12.6cm内径压缩填充的结果：

实施例5：14cm压缩填充ISTA运输测试

如实施例4中所述进行色谱柱填充、流动沉降、流动调节。本实验中没有使用聚乙烯玻璃料。用40μm陶瓷羟基磷灰石1型树脂(加利福尼亚州赫拉克勒斯市的Bio-Rad的CHT

在10％压缩下将色谱柱存储在含有10mM磷酸钠的0.1N氢氧化钠中并包装，以在马萨诸塞州萨顿市的UN1F1ED2 Global Packing Group进行国际安全运输协会2B测试(ISTA2B)。ISTA2B程序包括以下测试类别：710lbs压缩1小时，G

在ISTA2B前后的压力-流量曲线保持不变(图10)。这些数据以及所保持的色谱性能表明，以10％压缩填充的14cm内径色谱柱足以稳定运输。

表4. 14cm内径压缩填充的ISTA运输测试结果

实施例6：按比例放大压缩填充ISTA运输测试，45.7cm I.D.色谱柱

为了证明所述压缩填充方法的可放大性，用40μm陶瓷羟基磷灰石1型树脂(加利福尼亚州赫拉克勒斯市的Bio-Rad的CHT

在10.2％压缩下将色谱柱存储在含有10mM磷酸钠的0.1N氢氧化钠中并包装，以在马萨诸塞州萨顿市的UN1F1ED2 Global Packing Group进行国际安全运输协会2B测试(ISTA2B)。ISTA2B程序包括以下测试类别：环境预处理，环境处理，G

在ISTA2B前后的压力-流量曲线保持不变(图11)。这些数据以及所保持的色谱性能表明，以10％压缩填充的45.7cm内径色谱柱足以稳定运输。

表5. 45.7cm内径压缩填充的ISTA运输测试结果

实施例7：CHT

将80μm陶瓷羟基磷灰石1型树脂(加利福尼亚州赫拉克勒斯市的Bio-Rad的CHT

表6. 80μm CHT

压缩至7.9％后未观察到不对称度的变化，但柱效率从7.9％(3030N/m)降至12.4％(2717N/m)。这些性能结果仍在制造商推荐的规格范围内。

在通过振动和跌落循环对色谱柱应力测试后，柱效率和不对称度没有改变。这些结果表明所述压缩填充方法适用于填充80μm CHT