一种检测乳制品中8种甜味剂的方法

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种检测乳制品中8种甜味剂的方法。

背景技术

甜味剂是能改善食品口味的一类添加剂，广泛应用于食品行业。但是甜味剂过量使用，会对人体产生毒副作用，可能会导致高血糖、葡萄糖耐受不良等代谢系统性疾病，造成易怒、抑郁、记忆衰退等神经系统异常，甚至有报道，糖精钠、甜蜜素的过量使用会有致癌、致畸等不良反应。因此，必须对其使用量进行严格管控，国家标准 GB 2760-2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中对甜味剂适用范围及添加限量都有明确规定。

甜味剂的最常用检测技术为气相色谱法、液相色谱法、液质联用法、气质联用法等。但是大部分检测方法或者标准只能单一的检测一种或两种甜味剂，耗时耗力；而且关于新型甜味剂爱德万甜的相关资料很少，尚未有其相关检测标准。液相色谱-串联质谱法分析效率高，兼具定性定量功能，能有效防止假阳性，尤其适用于复杂基质的定性和定量检测，因此适用于甜味剂的高通量分析。由于乳制品基质复杂，富含蛋白质和脂肪，处理不当会造成色谱柱及质谱的污染，对于甜味剂的检测造成一定的困难。

发明内容

针对上述检测甜味剂中存在的问题，及为了一种方法来检测更多种类的甜味剂，本发明提供了一种检测乳制品中8种甜味剂的方法，采用有机相和水相混合提取溶剂，用有机相初步沉淀蛋白，通过固相萃取柱净化脂肪等未除尽的杂质，方法简单，回收率高，易于操作，检测甜味剂种类多。

本发明的技术方案如下：

一种检测乳制品中8种甜味剂的方法，包括以下步骤：

（1）样品处理：采用甲醇、三氯甲烷的水溶液为提取液，离心，上清液过OasisPRiME HLB固相萃取柱，取净化液氮吹用水定容，混匀后经微孔滤膜过滤，得待检测溶液；

（2）色谱条件：流动相A：甲醇；流动相B：含0.1%甲酸的水；采用梯度洗脱法，时间为10 min，流速为0.3 mL/min，0 min流动相组成为10%A+90%B，1 min流动相组成为10%A+90%B，5 min时90%A+10%B，8 min时90%A+10%B，8.1 min时10%A+90 %B，10 min时10%A+90%B；

（3）质谱条件：电喷雾离子源ESI(-)ESI(+)，扫描模式：多反应监测模式MRM；

（4）定量工作曲线，采用步骤（2）、（3）的条件，检测步骤（1）的待测物质。

所述步骤（1）的甲醇、三氯甲烷和水的体积比为：7:2:1。

甜味剂易溶于极性溶剂中，因此用水和甲醇来提取目标物。但是由于乳制品基质复杂，处理不当会造成色谱柱堵塞及质谱的污染，对于甜味剂的检测造成一定的困难，因此本发明采用甲醇和三氯甲烷来初步沉淀蛋白，通过固相萃取柱净化未除尽的杂质。选用Oasis HLB柱、Oasis PRiME HLB柱两种色谱柱，发现Oasis HLB柱对安赛蜜、甜蜜素、糖精钠回收率较低，Oasis PRiME HLB柱可以采用过滤式样品制备流程，吸附样品中非极性干扰物质，收集滤液得到待检测样品，方法简单，且对8种甜味剂的回收均较好。

本发明的有益效果

1、结果精密度和准确度分析

在同一空白基质中加入不同浓度的甜味剂标准溶液，在同样的色谱质谱条件下对样品进行加标回收试验，所测回收率均在80.21%-109.75%之间，证明该方法准确度高。并对该加标样品进行精密度分析，连续检测6次，相对标准偏差在1.34%-7.30%之间，证明该方法精密度好。

2. 操作简单

本发明采用甲醇、三氯甲烷和水作为提取溶液，通过有机相甲醇和三氯甲烷初步沉淀蛋白，通过Oasis PRiME HLB固相萃取柱净化脂肪等未除尽的杂质，可以测定乳制品中8种甜味剂，方法简单高效，检测灵敏度及准确性高，易于操作。

附图说明

图1是甜味剂的总离子流图；

图2 为发酵乳中添加甜味剂的总离子流图；

图3为某品牌发酵乳提取总离子流图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。

实施例1

（1）样品处理

准确称取待测样品2 g于50 mL离心管中，用甲醇：水：三氯甲烷体积比为7:2:1的混合提取溶液定容至25 mL，涡旋振荡2 min，超声提取10 min，6000 r/min离心5 min，取上清液3-4 mL，直接过Oasis PRiME HLB固相萃取柱，取净化液2 mL氮吹至0.5 mL左右，用水定容至2 mL，混匀，取上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，得待检测溶液。

（2）流动相的选择

分别用甲醇和乙腈作为有机相测定8种甜味剂，发现甲醇的分离效果较好，信号响应较高；分别在在水相中添加0.1%的甲酸及0.5 mM的乙酸铵，发现乙酸铵能抑制大部分甜味剂的离子化效率，导致响应信号降低，因此最终选择甲醇-0.1%甲酸水作为流动相。

（3）色谱条件

色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C

（4）质谱条件

电喷雾离子源ESI(-)ESI(+)，扫描模式：多反应监测模式MRM；离子源温度（TEM）：500℃；雾化气（Gas1）：55 psi；辅助气（Gas2）：55 psi；气帘气（CUR）：30 psi；电喷雾电压（IS）：5500V[ESI(+) ]/-4500V[ESI(-)]；碰撞气（CAD）：8 psi；8种甜味剂的总离子流图如图1所示。

（4）标准工作曲线制作及定量限测定

配制不同浓度的混合标准工作溶液，其中甜蜜素、纽甜、阿斯巴甜、安赛蜜、糖精钠的浓度分别为0.5、1、5、10、50、100、500 ng/mL；三氯蔗糖的浓度分别为1、2、10、20、100、200、1000 ng/mL；爱德万甜、阿力甜的浓度分别为0.2、0.4、2、4、20、40、200 ng/mL，按照上述的方法进行测定，结果表明在线性范围内，8种甜味剂均可以保持良好线性关系，相关系数均大于0.997。用空白基质添加标准物质提取进样以计算检出限，3倍检出限为定量限，在称样量为2 g时，8种甜味剂的线性关系和定量限见表1。

表1 8种甜味剂标准曲线线性关系与定量限

（5）回收率和精密度

以不含此8种甜味剂实际样品为空白基质，分别对添加低中高三个浓度的样品进行测定，以考察方法的精密度（RSD）和回收率。结果表明：8种甜味剂的回收率在80.21%-109.75%之间，精密度在1.34%-7.30%，均具有较好的回收率和精密度，具体结果见表2。

表2 8种甜味剂低、中、高三个浓度加标样品回收率及精密度结果

（5）实际样品的测定

采集市场上不同种类的乳制品样品用上述方法进行分析。其中一批次发酵乳中检出甜蜜素含量为93.60 mg/kg，阿斯巴甜含量为53.75 mg/kg，见图3，未超过国家标准 GB2760-2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中对发酵乳中甜味剂的限量要求。将本发明检测方法与国标方法进行比较，检测含量变化见表3。

表3 不同检测方法测定发酵乳中甜味剂含量