一种皮肤衰老蛋白标志物—HBA蛋白及其无创性提取方法

技术领域

本发明涉及一种皮肤衰老蛋白标志物—HBA蛋白及其无创性提取方法，属于分子生物学领域。

背景技术

人类的皮肤随年龄增长自然老化或随着环境刺激而衰老，导致皮肤衰老。自然老化为内源性老化，表现为皮肤变白，出现细小皱纹、弹性下降、皮肤松弛等，环境刺激为外源性老化，如日晒所致的光老化。如果皮肤得不到良好的保养或随着年龄增长而衰退，死皮就会附着在皮肤表面而不脱落，因而造成一系列问题，严重影响美容。

人体内的血红蛋白由四个亚基构成，分别为两个α亚基和两个β亚基，在与人体环境相似的电解质溶液中血红蛋白的四个亚基可以自动组装成α2β2的形态。α亚基就是经过α螺旋的肽链，其中α螺旋就是肽链按右手螺旋方向卷曲形成的空间结构。

但是迄今为止没有通过HBA蛋白(血红蛋白亚基α，HBA1)判断判断皮肤衰老程度的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种皮肤衰老蛋白标志物—HBA蛋白及其无创性提取方法。

本发明血红蛋白亚基α(HBA1)在辅助判断衰老程度中的应用。

本发明中，所述血红蛋白亚基α(HBA1)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1。

本发明提供的用于检测受试者血红蛋白亚基α(HBA1)含量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为判断或辅助判断皮肤衰老。

本发明提供了用于检测受试者血红蛋白亚基α含量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为诊断或辅助诊断皮肤衰老程度。

上述的应用中，所述产品为试剂盒或芯片。

本发明一种产品，包括用于检测血红蛋白亚基α含量的物质；所述产品的功能为如下(a)或(b)：

(a)判断或辅助判断皮肤衰老；

(b)诊断或辅助诊断皮肤衰老程度。

上述的产品中，所述用于检测受试者血红蛋白亚基α含量的物质是质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段。

上述的产品中，所述用于检测受试者血红蛋白亚基α含量的物质的仪器为轨道阱高分辨率质谱仪。

上述的产品中，所述产品还包括记载有如下检测方法的载体：

1)取受试者表皮皮肤样本；

2)检测所得受试者皮肤样本中血红蛋白亚基α含量；

3)将步骤2)测得的血红蛋白亚基α含量与该年龄段正常人皮肤中的血红蛋白亚基α含量值进行比较，根据比较结果，判断受试者的皮肤衰老程度；

或4)将步骤2)测得的血红蛋白亚基α含量与各年龄段正常人皮肤中的血红蛋白亚基α含量标准曲线进行比较，根据比较结果，判断受试者皮肤的衰老程度或皮肤生理年龄。

本发明进一步提供了一种辅助判断衰老程度的数据处理装置系统，包括如下模块：

(1)数据接收模块；所述数据接收模块被配置为接收受试者皮肤样本中血红蛋白亚基α含量数据；

(2)数据存储模块：所述数据存储模块被配置为存储与受试者年龄一致的正常人员皮肤中的血红蛋白亚基α含量数据或所述数据存储模块被配置为存储正常人皮肤中的血红蛋白亚基α含量标准曲线；

(3)数据比较模块：所述数据比较模块被配置为将数据接收模块接受到的受试者皮肤样本中血红蛋白亚基α含量数据与数据存储模块中存储的与受试者年龄一致的正常人皮肤中的血红蛋白亚基α含量数据进行比较；或所述数据比较模块被配置为将数据接收模块接受到的受试者皮肤样本中血红蛋白亚基α含量数据与数据存储模块中存储的正常人皮肤中的血红蛋白亚基α含量标准曲线进行比较；

(4)判断模块；所述判断模块被配置为接收由所述数据比较模块发送的比较结果，并对比较结果进行判定，判定受试者的皮肤衰老程度，或判定受试者皮肤生理年龄是否与其实际年龄相符，并输出判定结果。

上述的数据处理装置系统中，所述辅助判断衰老程度的系统还包括检测受试者皮肤样本中血红蛋白亚基α含量的物质；

所述用于检测受试者血红蛋白亚基α含量的物质具体可为质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段。

上述的数据处理装置系统中，所述辅助判断衰老程度的系统还包括检测受试者皮肤样本中血红蛋白亚基α含量的仪器；

所述检测受试者皮肤样本中血红蛋白亚基α含量的仪器具体可为轨道阱高分辨率质谱仪。

本发明提供了受试者表皮皮肤样本中血红蛋白亚基α中肽段的提取方法，包括如下步骤：(1)受试者表皮皮肤样本取样：将3M胶贴于前臂曲侧部位；1分钟后，轻轻揭下3M胶贴片，保证受试者的皮肤没有损伤，得到胶带状皮肤样品；

(2)干燥的肽段样品的获得：1)将胶带状皮肤样品切成小块，用无菌刀片并沉积在玻璃板上在转移到1.5毫升离心管之前；

2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟；然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜；

3)以下在离心力25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM处理 DTT在56℃的水浴中放置1小时；

4)然后用55mM IAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟，得到最终的蛋白质溶液上清液；蛋白质浓度使用Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS-PAGE进行质控；每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时；随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时；水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥，即得到干燥的肽段样品。

本发明进一步提供了受试者表皮皮肤样本中血红蛋白亚基α基于质谱的相对含量的测定方法，包括如下步骤：

(1)受试者表皮皮肤样本取样：将3M胶贴于前臂曲侧部位；1分钟后，轻轻揭下3M胶贴片，保证受试者的皮肤没有损伤，得到胶带状皮肤样品；

(2)干燥的肽段样品的获得：1)将胶带状皮肤样品切成小块，用无菌刀片并沉积在玻璃板上在转移到1.5毫升离心管之前；

2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟；然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜；

3)以下在离心力25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM处理 DTT在56℃的水浴中放置1小时；

4)然后用55mM IAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟，得到最终的蛋白质溶液上清液；蛋白质浓度使用Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS-PAGE进行质控；每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时；随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时；水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥，即得到干燥的肽段样品；

(3)检测

a)将干燥的肽段样品用流动相A(2％ACN，0.1％FA)复溶，20,000g离心10分钟后，取上清进样；通过UHPLC进行分离；样品首先进入trap柱富集并除盐，随后与自装C18柱(150μm内径，1.8μm柱料粒径，25cm柱长)串联，以500nl/min流速通过如下有效梯度进行：

分离：0-5min，5％流动相B(98％ACN，0.1％FA)；5-160min，流动相B从5％线性升至35％；160-170min，流动相B从35％升至80％；170-175min，80％流动相B； 176-180min，5％流动相B；纳升液相分离末端直接连接质谱仪；

b)DDA和/或DIA质谱检测

DDA质谱检测：

经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进入到串联质谱仪Q-Exactive HF(Thermo Fisher Scientific，San Jose,CA)进行DDA(data-dependent acquisition)模式检测；主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为60,000；二级质谱起始m/z固定为100；分辨率15,000；二级碎裂的母离子筛选条件为：电荷2+到7+，峰强度超过10,000的强度排在前20的母离子；离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测；动态排除时间设定为30s，AGC设置为：一级3E6，二级1E5；

DIA质谱检测：

经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进入到串联质谱仪Q-Exactive HF(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA)进行DIA(data-independent acquisition)模式检测；参数设置如下：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为120,000；将350-1500Da均分为40个窗口进行碎裂及信号采集；离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测；动态排除时间设定为30s；AGC设置为：一级3E6，二级1E5。

本发明具有以下优点：

通过检测待测者的血红蛋白亚基α含量与标准曲线对比判断皮肤衰老程度，其方法更为简便，且结果准确，效率高；其为不同年龄的受试者皮肤衰老程度提供依据，对皮肤管理起指导意义。

附图说明

图1为本发明血红蛋白亚基α(HBA1)的特征肽段(VADALTNAVAHVDDMPNALSALSDLHAHK)的质谱图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例

以生活环境比较接近、身体健康的白领人群为样本，通过无创法进行表皮皮肤样本取样(具体为3M胶粘皮，完成取样)。

本发明对受试者表皮皮肤样本中蛋白质含量的测定方法，按照如下步骤：

(1)高效液相

受试者表皮皮肤样本取样：将3M胶(3M医用胶贴的生产厂家为3M Health Care 3MBrookings)贴于前臂曲侧部位，以排除光老化因素；1分钟后，轻轻揭下3M胶贴片，保证受试者的皮肤没有损伤，得到胶带状皮肤样品。

干燥的肽段样品的获得：1)将胶带状皮肤样品切成小块(0.5×0.5厘米)，用无菌刀片并沉积在玻璃板上在转移到1.5毫升离心管之前；

2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟。然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜。

3)以下在离心力25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM处理 DTT在56℃的水浴中放置1小时；

4)然后用55mM IAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟，得到最终的蛋白质溶液上清液；蛋白质浓度使用Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS-PAGE进行质控；每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时；随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时；水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥；即得到干燥的肽段样品。

将干燥的肽段样品用流动相A(2％ACN，0.1％FA)复溶，20,000g离心10分钟后，取上清进样；通过UHPLC进行分离。样品首先进入trap柱富集并除盐，随后与自装 C18柱(150μm内径，1.8μm柱料粒径，25cm柱长)串联，以500nl/min流速通过如下有效梯度进行：

分离：0-5min，5％流动相B(98％ACN，0.1％FA)；5-160min，流动相B从5％线性升至35％；160-170min，流动相B从35％升至80％；170-175min，80％流动相B； 176-180min，5％流动相B。纳升液相分离末端直接连接质谱仪。

(2)DDA质谱检测

经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进入到串联质谱仪Q-Exactive HF(Thermo Fisher Scientific，San Jose,CA)进行DDA(data-dependent acquisition)模式检测。主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为60,000；二级质谱起始m/z固定为100；分辨率15,000。二级碎裂的母离子筛选条件为：电荷2+到7+，峰强度超过10,000的强度排在前20的母离子。离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测。动态排除时间设定为30s。AGC设置为：一级3E6，二级1E5。

(3)DIA质谱检测

经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进入到串联质谱仪Q-Exactive HF(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA)进行DIA(data-independent acquisition)模式检测。主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为120,000；将350-1500Da均分为40个窗口进行碎裂及信号采集。离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测。动态排除时间设定为30s。AGC设置为：一级3E6，二级1E5。

经上述方法测定，血红蛋白亚基α(HBA1)的特征肽段(VADALTNAVAHVDDMPNALSALSDLHAHK)的质谱如图1所示。

按照上述方法分别对受试者皮肤样本中血红蛋白亚基α(HBA1)进行测定，得到基于质谱的相对含量数据如下表1所示：

表1受试者皮肤样本中HBA1基于质谱的相对含量

由上表1中数据可以看出，随着年龄的增长，受试者皮肤样本中血红蛋白亚基α(HBA1)基于质谱的相对含量增加。

在实际应用中，根据血红蛋白亚基α(HBA1)基于质谱的相对含量辅助判断受试者皮肤衰老程度的方法如下：

(1)首先采集大量的各个年龄阶段的具有统计学意义的正常人的皮肤样本，分别测定各皮肤样本中HBA1基于质谱的相对含量；

(2)测定受试者皮肤样本中的HBA1基于质谱的相对含量；然后进行(3)或(4)；

(3)将步骤(2)中受试者的数据，与该年龄段正常人皮肤中的HBA1基于质谱的含量值进行比较，根据比较结果，判断受试者的相对皮肤衰老程度；

(4)基于步骤(1)中的数据，绘制年龄-HBA1基于质谱的相对含量的标准曲线，再测定受试者皮肤样本中的HBA1基于质谱的相对含量，与上述标准曲线比较，判定受试者的皮肤衰老程度或皮肤年龄，即可。

本发明中，上述血红蛋白亚基α(HBA1)的具体如下所示：

Gene:HBA1

Protein:Hemoglobin subunit alpha

氨基酸序列如SEQ ID NO.1，具体如下：

MVLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHFDLSHG SAQVKGHG

KKVADALTNAVAHVDDMPNALSALSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHCLLVTLAA HLPAEFTP

AVHASLDKFLASVSTVLTSKYR 。

序列表

<110>杨森

<120>一种皮肤衰老蛋白标志物—HBA蛋白及其无创性提取方法

<130>GNCLW211026

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 142

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Val Leu Ser Pro Ala Asp Lys Thr Asn Val Lys Ala Ala Trp Gly

1 5 10 15

Lys Val Gly Ala His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg

20 25 30

Met Phe Leu Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp

35 40 45

Leu Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys Gly His Gly Lys Lys Val Ala

50 55 60

Asp Ala Leu Thr Asn Ala Val Ala His Val Asp Asp Met Pro Asn Ala

65 70 75 80

Leu Ser Ala Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro

85 90 95

Val Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Ala

100 105 110

His Leu Pro Ala Glu Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys

115 120 125

Phe Leu Ala Ser Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg

130 135 140