一种皮肤衰老蛋白标记物—APOA2蛋白及其无创法提取方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种皮肤衰老蛋白标记物—APOA2蛋白及其无创法提取方法。

背景技术

皮肤衰老分为外源性衰老和内源性衰老，外源性衰老(extrinsic ageing)主要指由紫外线辐射、吸烟、风吹、日晒及接触有害化学物质等环境因素导致的衰老；内源性衰老又叫作“时程老化”，它主要是由基因决定的。皮肤老化一般从30岁开始，随年龄增长逐渐明显。其老化速度有明显的个体差异，并受到内外环境因素综合作用的影响，正确判断皮肤的衰老程度以及判断衰老的生理年龄是否与实际年龄相符，是美容或者医学美容的前提。

APOA2：在蛋白互作网络关系中具有较高的蛋白节点关系，是一种载脂蛋白，它是由肝脏产生的，参与胆固醇酯的形成和胆固醇从组织向肝脏的运输，通过与脂质结合来稳定HDL(高密度脂蛋白)结构，并影响HDL代谢。APOA2是一种涉及甘油三酸酯，脂肪酸和葡萄糖代谢的蛋白质，是高密度脂蛋白的主要成分之一，在脂质代谢和肥胖中起着至关重要的作用。同时，apoA2与CRP有关，提示与炎症之间的普遍关系。这个蛋白一般与肥胖有关。

目前没有将载脂蛋白A-Ⅱ(APOA2)用于辅助判断皮肤衰老程度的先例。

发明内容

本发明的目的是提供载脂蛋白A-Ⅱ(其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)在辅助判断衰老程度中的应用。

本发明提供了用于检测载脂蛋白A-Ⅱ含量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为辅助判断衰老程度。

本发明提供了用于检测载脂蛋白A-Ⅱ含量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为辅助判断皮肤衰老程度。

所述用于检测载脂蛋白A-Ⅱ含量的物质具体可为质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段；更具体可为轨道阱高分辨率质谱仪。

所述用于检测载脂蛋白A-Ⅱ含量的物质还包括从皮肤表面取样所用的物质。

以上任一所述应用中，所述产品为试剂盒或芯片。

本发明还保护一种产品，包括用于检测载脂蛋白A-Ⅱ含量的物质；所述产品的功能为如下(a)或(b)：

(a)辅助判断衰老程度；

(b)辅助判断皮肤衰老程度。

所述产品中，所述用于检测载脂蛋白A-Ⅱ含量的物质具体可为质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段；更具体可为轨道阱高分辨率质谱仪。

所述产品中，所述用于检测载脂蛋白A-Ⅱ含量的物质还包括从皮肤表面取样所用的物质。

所述产品还包括记载有如下检测方法的载体：

1)取受试者皮肤样本；

2)检测所得受试者皮肤样本中载脂蛋白A-Ⅱ含量；

3)将步骤2)测得的载脂蛋白A-Ⅱ含量与该年龄段正常衰老的人员皮肤中的载脂蛋白A-Ⅱ含量值进行比较，根据比较结果，判断受试者的皮肤衰老程度。

还可进一步包括4)将步骤2)测得的载脂蛋白A-Ⅱ含量与各年龄段正常衰老的人员皮肤中的载脂蛋白A-Ⅱ含量标准曲线进行比较，根据比较结果，判断受试者皮肤的生理年龄，

若受试者的皮肤衰老程度较快，或受试者皮肤生理年龄大于其实际年龄，则采用相应的干预措施，延缓皮肤衰老，达到美容的效果。

本发明还提供一种辅助判断衰老程度的系统。

本发明所提供的辅助判断衰老程度的系统，可包括如下模块：

(1)数据接收模块；所述数据接收模块被配置为接收受试者皮肤样本中载脂蛋白A-Ⅱ含量数据；

(2)数据存储模块：所述数据存储模块被配置为存储与受试者年龄段一致的正常衰老的人员皮肤中的载脂蛋白A-Ⅱ含量数据或所述数据存储模块被配置为存储各年龄段正常衰老的人员皮肤中的载脂蛋白A-Ⅱ含量标准曲线；

(3)数据比较模块：所述数据比较模块被配置为将数据接收模块接受到的受试者皮肤样本中载脂蛋白A-Ⅱ含量数据与数据存储模块中存储的与受试者年龄段一致的正常衰老的人员皮肤中的载脂蛋白A-Ⅱ含量数据进行比较；或所述数据比较模块被配置为将数据接收模块接受到的受试者皮肤样本中载脂蛋白A-Ⅱ含量数据与数据存储模块中存储的各年龄段正常衰老的人员皮肤中的载脂蛋白A-Ⅱ含量标准曲线进行比较；

(4)判断模块；所述判断模块被配置为接收由所述数据比较模块发送的比较结果，并对比较结果进行判定，判定受试者的皮肤衰老程度，或判定受试者皮肤生理年龄是否大于其实际年龄，并输出判定结果。

上述辅助判断衰老程度的系统还进一步包括检测受试者皮肤样本中载脂蛋白A-Ⅱ含量的仪器，所述仪器具体可为轨道阱高分辨率质谱仪；

上述辅助判断衰老程度的系统还进一步包括用于获取受试者皮肤样本的物质。具体说，该物质为胶贴，更具体地，该胶贴可以为3M胶。

本发明提供的辅助判断皮肤衰老程度的方法，包括以下步骤：

1)用胶贴贴在皮肤表面，然后撕下，获得受试者表皮皮肤样本；该步骤具体为用3M胶贴在受试者前臂曲侧部位，然后轻轻撕下胶贴，保证不对受试者皮肤造成伤害，仅仅沾下受试者皮肤表面的脱落层；

2)检测所得受试者皮肤样本中载脂蛋白A-Ⅱ含量；

3)将步骤2)测得的载脂蛋白A-Ⅱ含量与受试者年龄相同的正常人皮肤中的载脂蛋白A-Ⅱ含量值进行比较，根据比较结果，判断受试者的皮肤衰老程度；

或4)将步骤2)测得的载脂蛋白A-Ⅱ含量与各年龄段正常人皮肤中的载脂蛋白 A-Ⅱ含量标准曲线进行比较，根据比较结果，判断受试者皮肤的生理年龄；

受试者皮肤中载脂蛋白A-Ⅱ含量低于正常人皮肤中载脂蛋白A-Ⅱ含量的，判定受试者皮肤的生理年龄比实际年龄年轻；受试者皮肤中载脂蛋白A-Ⅱ含量高于正常人皮肤中载脂蛋白A-Ⅱ含量的，判定受试者皮肤的生理年龄比实际年龄年老。

本发明还提供一种无创获得皮肤中与皮肤衰老相关的蛋白标记物—APOA2的方法，包括：(1)受试者表皮皮肤样本取样：将3M医用胶贴贴于前臂曲侧部位，1分钟后，轻轻揭下3M胶贴片，得到胶带状皮肤样品；

(2)干燥的肽段样品的获得：1)将胶带状皮肤样品切成小块，沉积在玻璃板上在转移到离心管；

2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟，然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜；

3)在离心力25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM处理DTT 在56℃的水浴中放置1小时；

4)然后用55mM IAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟，得到最终的蛋白质溶液上清液；蛋白质浓度使用Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS-PAGE进行质控；每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时；随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时；水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥，即得到干燥的肽段样品。

本发明还进一步提供表皮皮肤样本中载脂蛋白A-Ⅱ基于质谱的相对含量的测定方法，包括如下步骤：(1)受试者表皮皮肤样本取样：将3M医用胶贴贴于前臂曲侧部位，1分钟后，轻轻揭下3M胶贴片，得到胶带状皮肤样品；

(2)干燥的肽段样品的获得：1)将胶带状皮肤样品切成小块，沉积在玻璃板上在转移到离心管；

2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟，然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜；

3)在离心力25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM处理DTT 在56℃的水浴中放置1小时；

4)然后用55mM IAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟，得到最终的蛋白质溶液上清液；蛋白质浓度使用Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS-PAGE进行质控；每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时；随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时；水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥，即得到干燥的肽段样品；

(3)检测

将干燥的肽段样品用流动相A(2％ACN，0.1％FA)复溶，20,000g离心10分钟后，取上清进样；通过UHPLC进行分离；样品首先进入trap柱富集并除盐，随后与自装 C18柱串联，以500nl/min流速通过如下有效梯度进行：

分离：0-5min，5％流动相B(98％ACN，0.1％FA)；5-160min，流动相B从5％线性升至35％；160-170min，流动相B从35％升至80％；170-175min，80％流动相B； 176-180min，5％流动相B；纳升液相分离末端直接连接质谱仪；

DDA质谱检测

经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进口到串联质谱仪Q-Exactive HF模式检测；主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为60,000；二级质谱起始m/z固定为100；分辨率15,000。二级碎裂的母离子筛选条件为：电荷2+到7+，峰强度超过10,000的强度排在前20的母离子；离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测；动态排除时间设定为30s；AGC 设置为：一级3E6，二级1E5；

DIA质谱检测

经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进口到串联质谱仪Q-Exactive HF模式检测；主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为120,000；将350-1500Da均分为40个窗口进行碎裂及信号采集；离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测；动态排除时间设定为30s；AGC设置为：一级3E6，二级1E5。

本发明通过检测皮肤中载脂蛋白A-Ⅱ含量，辅助判断皮肤衰老程度，从根源上找到导致皮肤衰老的内在因素，在皮肤老化外在表现出现前提前干预皮肤衰老，另外可以正确判断皮肤的衰老程度以及判断衰老的生理年龄是否与实际年龄相符，为美容或者医学美容提供参考和方向

附图说明

图1为检测得到的载脂蛋白A-Ⅱ的特征肽段 (KAGTELVNFLSYFVELGTQPATQ)的质谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明提供载脂蛋白A-Ⅱ在辅助判断衰老程度中的应用。

本发明提供了用于检测载脂蛋白A-Ⅱ含量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为辅助判断衰老程度。

本发明提供了用于检测载脂蛋白A-Ⅱ含量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为辅助判断皮肤衰老程度。

所述用于检测载脂蛋白A-Ⅱ含量的物质具体可为质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段；更具体可为轨道阱高分辨率质谱仪。

所述用于检测载脂蛋白A-Ⅱ含量的物质还包括从皮肤表面取样所用的物质。

以上任一所述应用中，所述产品为试剂盒或芯片。

本发明还保护一种产品，包括用于检测载脂蛋白A-Ⅱ含量的物质；所述产品的功能为如下(a)或(b)：

(a)辅助判断衰老程度；

(b)辅助判断皮肤衰老程度。

所述产品中，所述用于检测载脂蛋白A-Ⅱ含量的物质具体可为质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段；更具体可为轨道阱高分辨率质谱仪；

所述产品中，所述用于检测载脂蛋白A-Ⅱ含量的物质还包括从皮肤表面取样所用的物质。

所述产品还包括记载有如下检测方法的载体：

1)取受试者皮肤样本；

2)检测所得受试者皮肤样本中载脂蛋白A-Ⅱ含量；

3)将步骤2)测得的载脂蛋白A-Ⅱ含量与该年龄段正常衰老的人员皮肤中的载脂蛋白A-Ⅱ含量值进行比较，根据比较结果，辅助判断受试者的皮肤衰老程度。

还可进一步包括4)将步骤2)测得的载脂蛋白A-Ⅱ含量与各年龄段正常衰老的人员皮肤中的载脂蛋白A-Ⅱ含量标准曲线进行比较，根据比较结果，判断受试者皮肤的生理年龄，

若受试者的皮肤衰老程度较快，或受试者皮肤生理年龄大于其实际年龄，则采用相应的干预措施，延缓皮肤衰老，达到美容的效果。

本发明还提供一种辅助判断衰老程度的系统。

本发明所提供的辅助判断衰老程度的系统，可包括如下模块：

(1)数据接收模块；所述数据接收模块被配置为接收受试者皮肤样本中载脂蛋白A-Ⅱ含量数据；

(2)数据存储模块：所述数据存储模块被配置为存储与受试者年龄段一致的正常衰老的人员皮肤中的载脂蛋白A-Ⅱ含量数据或所述数据存储模块被配置为存储各年龄段正常衰老的人员皮肤中的载脂蛋白A-Ⅱ含量标准曲线；

(3)数据比较模块：所述数据比较模块被配置为将数据接收模块接受到的受试者皮肤样本中载脂蛋白A-Ⅱ含量数据与数据存储模块中存储的与受试者年龄段一致的正常衰老的人员皮肤中的载脂蛋白A-Ⅱ含量数据进行比较；或所述数据比较模块被配置为将数据接收模块接受到的受试者皮肤样本中载脂蛋白A-Ⅱ含量数据与数据存储模块中存储的各年龄段正常衰老的人员皮肤中的载脂蛋白A-Ⅱ含量标准曲线进行比较；

(4)判断模块；所述判断模块被配置为接收由所述数据比较模块发送的比较结果，并对比较结果进行判定，判定受试者的皮肤衰老程度，或判定受试者皮肤生理年龄是否大于其实际年龄，并输出判定结果。

上述辅助判断衰老程度的系统还进一步包括检测受试者皮肤样本中载脂蛋白A-Ⅱ含量的仪器，所述仪器具体可为轨道阱高分辨率质谱仪；

上述辅助判断衰老程度的系统还进一步包括用于获取受试者皮肤样本的物质。

实施例

以生活环境比较接近、身体健康的人群为样本，无创法进行前臂曲侧部位皮肤样本取样(用3M胶粘皮取样)。

本发明对受试者皮肤样本中不同蛋白质含量的测定方法，按照如下步骤：

(1)高效液相

样品的获得：将3M医用胶贴贴于前臂曲侧部位，排除光老化因素。(3M医用胶贴为2.4cm，生产厂家：3M Health Care 3M Brookings.)，1分钟后，轻轻揭下3M胶贴，保证受试者的皮肤没有损伤，得到胶带状皮肤样品；

(1)将胶带状皮肤样品切成小块(0.5x 0.5厘米)用无菌刀片并沉积在玻璃板上再转移到1.5毫升离心管之前；(2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟。然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜。 (3)以下在25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM处理DTT在56 ℃的水浴中放置1小时；(4)然后用55mM IAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟以得到最终的蛋白质溶液上清液。蛋白质浓度使用 Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS-PAGE进行质控(包括蛋白提取是否充分，有无降解及定量预估)。为了进行蛋白水解，每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时(蛋白质：酶之比＝40：1)。随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时。水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥，即得到干燥的肽段样品；

将干燥的肽段样品用流动相A(2％ACN，0.1％FA)复溶，20,000g离心10分钟后，取上清进样。通过Thermo公司UltiMate 3000UHPLC进行分离。样品首先进入trap 柱富集并除盐，随后与自装C18柱(150μm内径，1.8μm柱料粒径，25cm柱长)串联，以500nl/min流速通过如下有效梯度进行：

分离：0-5min，5％流动相B(98％ACN，0.1％FA)；5-160min，流动相B从5％线性升至35％；160-170min，流动相B从35％升至80％；170-175min，80％流动相B； 176-180min，5％流动相B。纳升液相分离末端直接连接质谱仪。

(2)DDA质谱检测

经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进口到串联质谱仪Q-Exactive HF(Thermo Fisher Scientific，San Jose,CA)进行DDA(data-dependent acquisition)模式检测。主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为60,000；二级质谱起始m/z固定为100；分辨率15,000。二级碎裂的母离子筛选条件为：电荷2+到7+，峰强度超过10,000的强度排在前20的母离子。离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测。动态排除时间设定为30s。AGC设置为：一级3E6，二级1E5。

(3)DIA质谱检测

经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进口到串联质谱仪Q-Exactive HF(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA)进行DIA(data-independent acquisition)模式检测。主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为120,000；将350-1500Da均分为40个窗口进行碎裂及信号采集。离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测。动态排除时间设定为30s。AGC设置为：一级3E6，二级1E5。

图1为检测得到的载脂蛋白A-Ⅱ的特征肽段(KAGTELVNFLSYFVELGTQPATQ) 的质谱图。

受试者皮肤样本中载脂蛋白A-Ⅱ相对含量数据如下：

由上表中数据可以看出，随着年龄的增长，受试者皮肤样本中载脂蛋白A-Ⅱ相对含量增加。

在实际应用中，首先采集数量上有统计学意义的各个年龄正常人的皮肤为样本，分别测定各皮肤样本中载脂蛋白A-Ⅱ相对含量，绘制年龄-载脂蛋白A-Ⅱ相对含量标准曲线，再测定受试者皮肤样本中的载脂蛋白A-Ⅱ相对含量，与标准曲线比较，判定受试者的皮肤衰老程度，即可。也可以是对某个特定年龄的人群进行操作。比如要为某个城市中40岁的人群进行服务，那么首先采集数量上有统计学意义的这个城市生活的40岁正常人的皮肤样本，测定各皮肤样本中载脂蛋白A-Ⅱ相对含量，并且取得平均值。这个平均值，就是一个衡量受试者皮肤衰老程度的阈值，当有受试者来进行评估的时候，采用与获得阈值相同的方法测量去皮肤中载脂蛋白A-Ⅱ的含量，当载脂蛋白A-Ⅱ的含量低于阈值的时候，说明该受试者皮肤的生理年龄比实际年龄年轻；受试者皮肤中载脂蛋白A-Ⅱ含量高于阈值的时候，判定受试者皮肤的生理年龄比实际年龄年老。

至于说怎样测量皮肤中载脂蛋白A-Ⅱ的含量，除了本实施例中质谱的方法以外，其余的任何能够测定蛋白的绝对和相对含量的方法，比如抗原抗体结合法等，都是可以的，并且应受到本发明的保护。

除了皮肤以外，载脂蛋白A-Ⅱ的含量，也可作为辅助判断人整体衰老程度的指标。

Gene:APOA2

Protein:Apolipoprotein A-II，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：

MKLLAATVLLLTICSLEGALVRRQAKEPCVESLVSQYFQTVTDYGKDLMEKVKSPELQAE AKSYFEKSKEQLTPLIKKAGTELVNFLSYFVELGTQPATQ 。

SEQUENCE LISTING

<110> 杨森

<120> 一种皮肤衰老蛋白标记物—APOA2蛋白及其无创法提取方法

<130> GNCAQ211028

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 100

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Lys Leu Leu Ala Ala Thr Val Leu Leu Leu Thr Ile Cys Ser Leu

1 5 10 15

Glu Gly Ala Leu Val Arg Arg Gln Ala Lys Glu Pro Cys Val Glu Ser

20 25 30

Leu Val Ser Gln Tyr Phe Gln Thr Val Thr Asp Tyr Gly Lys Asp Leu

35 40 45

Met Glu Lys Val Lys Ser Pro Glu Leu Gln Ala Glu Ala Lys Ser Tyr

50 55 60

Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gln Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly

65 70 75 80

Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly Thr Gln

85 90 95

Pro Ala Thr Gln

100