用于从人血浆和全血中去除抗A和/或抗B抗体的基于交联多糖的吸收剂

相关申请的交叉引用

本发明要求于2018年12月5日提交的美国专利申请No.62/775,476的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文。

政府权利

本发明是在美国陆军医学研究和物资司令部(U.S.Army Medical Research andMateriel Command)授予的合同No.W81XWH-17-C-0053的政府支持下进行的。政府对本发明具有某些权利。

技术领域

本发明涉及天然或合成化合物的生物缀合以形成新复合物的领域，该复合物具有其单独组分的组合特性，并且特别地是相对于单独组分具有增强的特性。可应用交联剂和修饰剂将化合物与固体支持物偶联。

背景技术

血液或血浆中的抗体限定了四种血液类型——A、B、AB和O。所述表征由抗原A和B的遗传性存在或不存在来确定。抗体可与和存在于个体自身RBC上的RBC抗原不同的RBC抗原发生交叉反应。交叉反应可以是致命的，并且因此在输血中是重要的。

目前用于降低来自人血浆/血液的抗A和抗B抗体的一些可商购产品包括Glycobar-A和Glycobar-B(Elicityl，France)、Glycosorb-ABO装置(GlycorexTransplantation AB，Sweden)。

所有上述商业产品均基于与适当的血型抗原A或血型抗原B类型配体偶联的天然聚合物(纤维素)或合成聚合物(聚丙烯酸酯)材料。

需要去除抗原A和B以提供普遍可捐赠的血浆或扩大捐赠的全血的相容性的改善的方法。

发明内容

在一些实施方案中，本发明涉及用于从人血浆中去除抗A抗体和抗B抗体之一或二者的基于经修饰天然多糖的聚合物介质，所述介质包含以下之一或二者：

(i)具有血型A抗原配体的聚合物固体支持物，所述血型A抗原配体以1至5mg/mL固体支持物的配体载量附着至固体支持物，并且其中所述介质在生理pH条件下是稳定的，以及

(ii)具有血型B抗原配体的聚合物固体支持物，所述血型B抗原配体以1至5mg/mL固体支持物的配体载量附着至固体支持物，并且其中所述介质在生理pH条件下是稳定的。所述A抗原配体和B抗原配体可在相同或分开的支持物上。

在某些实施方案中，血型A抗原配体是抗A-O-NH

聚合物介质可包含附着至第一聚合物固体支持物的血型A抗原配体和附着至第二固体支持物的血型B抗原配体。或者，这两种抗原可附着至相同的支持物。

任何合适的材料可用作固体支持物。这些材料包括包含纤维素、右旋糖酐、淀粉、琼脂糖和壳聚糖中的至少一种的那些。一些固体支持物包含珠尺寸范围为45至1,000um的珠状形式的功能性多糖，并且孔径范围为从非多孔到1至20,000埃孔直径。在一些实施方案中，珠尺寸为45至800um。某些固体支持物用NaIO

在一些实施方案中，基于交联多糖的珠状材料用天然或合成化合物来官能化，所述化合物包括肽、蛋白质、糖、多糖、核苷酸、寡核苷酸、脂质和药物。

在某些实施方案中，固体支持物在与双官能、三官能、四官能或多官能的伯胺或仲胺的部分交联下而对降解稳定并且使其在所述介质的宽范围pH(1至14)下稳定。一种优选的三官能胺是三(2-氨基乙基)胺(TREN)。

在一些实施方案中，固体支持物包含部分未反应的醛基(在NaIO

具体实施方式

本发明涉及用天然或合成化合物对基于交联多糖的珠状材料(右旋糖酐、纤维素等)的特定官能化。示例性但非包含性的化合物是肽和蛋白质、糖和多糖、核苷酸和寡核苷酸、脂质和药物。复合物配体的展示是从体液和其他复杂溶液中识别和或吸附大分子(例如免疫球蛋白、脂多糖和微囊泡)的关键因素。通过不利的方式与柔性或固体支持物进行生物缀合可导致配体活性损失。配体活性取决于所选择的支持物基质、接头、配体密度、官能化条件和其他因素。载体或固体支持物基质的合适的选择对于成功应用立体定向吸附具有决定性的重要性。另外，载体必须具有用于应用的合适的特征，例如：孔隙率(多孔或非多孔)、配体附着的稳定性；尺寸稳定性，即压力、温度和介质变化之后物理形状的保留；以及对微生物攻击的抗性。

尽管用于将生物配体共价附着至固体表面的技术是本领域公知的，但这些方法并不适用于所有配体。例如但非排他性地，多糖配体的识别对展示特征(例如碳水化合物的间隔和取向、接头长度和柔性以及配体密度)敏感。对在固定于基于交联多糖的珠期间使用的条件敏感的配体结构的一个实例示于方案1中。这些功能性四糖(tetrasaccharide)(四糖(tetraose))由Glycobar(France based公司)提供，并代表具有近似于存在于红细胞表面上的天然六糖的长度的接头臂的血型A和B抗原四糖。个体的血型由来源于与红细胞表面上的糖脂附着的特定A和B碳水化合物结构的ABO抗原系统确定。个体针对其所不具有的血型产生抗A或抗B免疫球蛋白，如果将其输血至a，则可使错配的输血接受者的RBC溶血。具有AB型血浆的个体针对A或B抗原不产生抗体，因此可将AB型血浆输血至任何ABO血型的个体。AB型血浆供应有限；因此，从来自A、B和O供体的血浆和血液中去除抗A和抗B抗体是期望的。最佳地，该装置必须具有生物相容性，以使其不导致溶血、或者凝血或结垢(fouling)，并且具有特异性，以使得在保留有益物质(例如凝血因子和白蛋白)的同时，有效地从血液和血浆中去除抗A和抗B血型抗体。这样的装置将是有益的，因为其将简化输血物流(transfusionlogistic)、降低维护成本并消除由ABO不相容引起的错误。

方案1示出了具有接头臂和NH

·具有接头臂和NH

抗A-O-NH

·具有接头臂和NH

抗B-O-NH

方案1.在与右旋糖酐或纤维素制备的珠偶联期间所使用的功能性四糖的结构。

目前用于降低来自人血浆/血液的抗A和抗B抗体的一些可商购产品包括Glycobar-A和Glycobar-B(Elicityl，France)、Glycosorb-ABO装置(GlycorexTransplantation AB，Sweden)。

所有上述商业产品均基于与适当的血型抗原A或血型抗原B类型配体偶联的天然聚合物(纤维素)或合成聚合物(聚丙烯酸酯)材料。

本文中描述了在用或不用还原胺化方法情况下对基于交联的右旋糖酐或纤维素的珠的官能化、稳定化以及与合适的四糖偶联的官能化。代表性的化学转化总结于方案2、3和4中。

在本发明中，我们公开了基于右旋糖酐或纤维素的珠的制备(使用多官能胺的二次交联来稳定)及其使抗A和抗B四糖固定化以用于随后从人血浆或全血中进行抗A和抗B抗体去除的用途。这些实例表明了多种展示的影响。

注意：(CY18085和CY18084使用抗A-O-NH

方案2.用血型A和B四糖使基于交联右旋糖酐的珠官能化。

交联右旋糖酐氧化，随后与最少量的任何多官能伯胺(例如三(2-氨基乙基)胺(TREN))进行二次交联，提供了在碱性条件下稳定并且还能够与血型A和/或B四糖偶联的珠。可进行包含末端NH2基的四糖的偶联，而无需在交联和氧化的右旋糖酐醛基与血型A或B四糖的含氨基臂的反应期间形成的亚氨基(＞C＝N-)的基于硼氢化物的还原步骤。

实施例1.交联右旋糖酐珠的氧化和二次交联：CY18099基础聚合物珠(200至600um)的合成

将交联右旋糖酐(珠尺寸为100至300um的Aldrich材料)50.0g悬浮于水中，导致约600mL的凝胶形成。将该交联右旋糖酐水凝胶(600mL)用NaIO

实施例2.CY18130的合成：血型A：抗A-S-NH

将CY18099聚合物珠(5mL，湿，200至600um)、溶解于30mL pH＝7.4PBS缓冲液中的血型A四糖：抗A-S-NH2(15mg)混合于50mL玻璃小瓶中。反应时间：在25℃下24小时。在反应完成之后，将珠用5×50mL DI H

基于纤维素的珠以至少两种方式制备。首先通过纤维素粉末的直接氧化。

1).用NaIO4将悬浮于DI水中的纤维素粉末直接氧化，随后与TREN配体进行二次交联。

0.02mmol TREN/1ml湿聚合物颗粒：醛基的部分消耗：纤维素颗粒的交联。氧化颗粒中的醛含量(mmol/mL)：需要确定：对于纤维素粉末同样氧化的文献值：至少＞1mmol/mL湿颗粒。在更长的氧化时间之后观察到的球状珠形成：168至240小时。降低搅拌速率和提高反应(氧化时间)显示产生更大(＞100um)和更具球状的珠。

方案3.用血型A和B四糖(抗A-O-NH

实施例3.CY18074聚合物珠的制备：将纤维素(微晶，20um粉末(Aldrich)悬浮于200mL的含有20g NaIO

2).使用反相乳液技术(用环氧氯丙烷作为交联剂)，随后用NaIO4氧化并与TREN配体进行二次交联来制备纤维素交联珠。

方案4.用血型A和B四糖(抗A-O-NH

实施例4.CY18075的合成：血型A：抗B-S-NH

将CY18074聚合物珠(5mL，湿，200至600um)，溶解于30mL pH＝7.4PBS缓冲液中的血型B四糖：抗B-S-NH

实施例5.CY18208纤维素CL珠的制备：

将40g NaOH和16.5g硫脲在200mL DI水中的溶液装入1L玻璃反应器(配备有机械搅拌器)中。添加纤维素(Aldrich)粉末。在将纤维素溶解(在8℃、200rpm下，4小时)之后，然后是有机相(由100mL甲苯、170mL异辛烷、30mL环氧氯丙烷和2.5g Span 80构成)(在8℃、200rpm下)，并将乳液在70℃下加热16小时。在反应完成之后：去除有机相，并将形成的白色珠用3×300mL DI水洗涤，随后用2×300mL异丙醇洗涤，并最终用2×300mL DI水洗涤。在100至600um下筛分珠。产量为约120mL(湿)。将如此制备的50mL的纤维素CL珠用15g NaIO

实施例6.CY18277的合成：使用还原胺化方法将血型A四糖：抗A-S-NH

将CY18208聚合物珠(5mL，湿，100至600um)与溶解于20mL pH＝7.4PBS缓冲液(含有3mg/mL NaBH3CN)中的血型A：抗A-S-NH

实施例7.使用聚合物介质从全血中去除抗A和抗B抗体

其中还用于从全血中去除抗A和抗B抗体的基于右旋糖酐或纤维素的聚合物(珠状形式)基质，一些实例包括但不限于方案5中描述的聚合物。这些特定的聚合物是使用用高碘酸钠对多糖珠进行氧化，随后将氨基官能血型A和B四糖直接偶联到珠表面上来官能化(不使用还原胺化或二次交联)。

方案5.不使用二次交联和还原胺化方法情况下进行的右旋糖酐CL G-50的氧化以及抗A-O-NH

方案2、3、4中描述的显示出血型抗体的去除[16∶1的血浆∶聚合物比率]≥88％的CytoSorbents聚合物：

使用全血测试的CytoSorbents聚合物：CY18006(B配体)、CY18007(A配体)。N＝5。

用于使用CytoSorbents聚合物从血液中去除抗体的改良的单程方法：

1.在柠檬酸盐-磷酸盐-右旋糖中收集的人全血，并在5天内使用。

2.使全血达到环境温度[22至25℃]。

3.使用15毫升离心管，添加湿聚合物至0.5ml分界线。使用0.9％盐水使完整体积至10ml，并颠倒以洗涤聚合物。使用移液器去除盐水。添加8ml全血[16∶1血液∶聚合物比率]。

4.轻轻颠倒10次。静置60秒。

5.将血液-聚合物混合物添加至带有50微米聚酯过滤器/橡胶O形环的30ml分割装置(cut device)。通过重力流来过滤血液。

6.通过离心从血液中分离血浆。使用Thermo Scientific Megafuge 16R，4000RPM，10分钟。

7.将血浆转移至新的经标记的微离心管。通过凝胶卡凝集测定确定抗体效价。将样品的效价指定为凝集的最低稀释度。

用于使用CytoSorbents聚合物从血浆中去除抗体的管法过程：

1.在37℃水浴中解冻血浆源。在室温下去除、干燥并放置，直至使用。

2.使用2ml微离心管，添加湿聚合物至0.25ml分界线。使用0.9％盐水使完整体积至2ml，并颠倒以洗涤聚合物。使用移液器去除盐水，并添加盐水至1ml分界线。连续稀释聚合物至0.625ml。使用移液器去除盐水。添加1ml血浆[16∶1血液∶聚合物比率]。

3.使用TalBoys微板振动器(Microplate shaker)(500RPM)在室温下振动(sharing)孵育15分钟。

4.通过离心从血液中分离血浆。使用Thermo Scientific Megafuge 16R，4000RPM，10分钟。

5.将血浆转移至新的经标记的微离心管。在确定抗体效价之后，将样品在-80℃下冷冻。

使用血浆测试的聚合物：全部列于上表中。

用于使用Ortho Clinical Diagnostics凝胶卡从用聚合物处理的血浆中确定抗体效价的测试程序

1.使用玻璃试管，使用0.9％盐水连续稀释血浆。应凭经验确定各血浆源的稀释程度。

2.目视检查凝胶卡并确定未损坏箔密封。确保每个微管中的基质是完整的，并覆盖有液体层。轻轻拍打凝胶卡可使液体层再沉降。

3.将每个卡用相应的样品和稀释因子进行标记。

4.轻轻混合每个试剂红细胞小瓶，直至细胞完全悬浮。在小瓶底部上的细胞聚集体应是不可见的。

5.将50μL的红细胞试剂A或B添加至微管。

6.将50μL的血浆样品和相关稀释液添加至相关微管。

7.使用Ortho工作站将凝胶卡在37℃下孵育15分钟。

8.使用Ortho工作站离心在预设条件(1032RPM，10分钟)下将凝胶卡离心。

9.人工读出卡的抗体效价确定。将抗体去除效率作为试剂红细胞凝集的最低稀释度计算。

在本说明书通篇，除非另有指明，否则词语应被赋予其如相关领域的技术人员所理解的正常含义。然而，为了避免误解，某些术语的含义将被明确定义或澄清。

在本公开内容中，未用数量词修饰的名词包括一个/种或更多个/种，并且对特定数值的提及至少包括该特定值，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“一种材料”是指本领域的技术人员已知的这样的材料及其等同物等等中的至少一者。

当通过使用描述符“约”将值表示为近似值时，应理解，特定值构成另一个实施方案。一般而言，术语“约”的使用表示近似值，该近似值可取决于由所公开的主题获得的所寻求的期望特性而变化，并且应基于其功能在所使用的特定背景中进行理解。本领域技术人员将能够将其理解为常规问题。在一些情况下，被用于特定值的有效数字的数目可以是确定词语“约”的范围的一个非限制性方法。在另一些情况下，在一系列值中所使用的等级可被用于确定术语“约”对于每个值的可用的预期范围。

在存在的情况下，所有范围均是包含性的并且能够进行组合。即，对以范围表示的值的提及包括该范围内的每个值，包括端点值。

当呈现列表时，除非另有说明，否则应理解，该列表的每个单独元素以及该列表的每个组合将被理解为单独的实施方案。例如，呈现为“A、B或C”的实施方案的列表将被理解为包括以下实施方案“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”或“A、B和C”。

应理解，为清楚起见，本文中在单独实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可在单个实施方案中组合提供。即，除非明显不相容或被明确排除，否则每个单独的实施方案被认为可与任何其他可能的实施方案组合，并且这样的组合被认为是另一个实施方案。相反地，为简洁起见，也可单独地或者以任何子组合提供上下文中的单个实施方案中描述的本发明的多种特征。此外，尽管实施方案可被描述为一系列步骤的一部分或更一般结构的一部分，但每个所述步骤或部分本身也可被认为是独立的实施方案。