新化合物

发明领域

本发明涉及化合物、含有所述化合物的组合物、组合和药物以及它们的制备方法。本发明还涉及所述化合物、组合、组合物和药物的用途，例如用于治疗与α1抗胰蛋白酶相关的疾病和病症中的用途。

发明背景

许多人遗传疾病是由损害蛋白质折叠和运输的突变引起的。所述蛋白质可以以正常的量生产，但是由于它们受损的折叠可能导致问题。

α-1-抗胰蛋白酶或α1抗胰蛋白酶(A1AT)是属于丝酶抑制蛋白超家族的蛋白酶抑制剂。它是在肝细胞和较小程度上在其它细胞中产生并分泌到血液中的蛋白质，在血液中它起到限制关键蛋白酶，尤其是嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的酶活性的作用。在其不存在时(例如在α-1-抗胰蛋白酶缺陷时)，包括嗜中性粒细胞弹性蛋白酶在内的关键蛋白酶的活性未被抑制，导致弹性蛋白和结缔组织的过度分解。在病理学上表现为这种现象的最常见组织是在肺中，其中肺结缔组织降解的增加通常导致呼吸并发症，例如肺气肿或慢性阻塞性肺病(COPD)。更罕见的是，其它组织也可受A1AT缺陷/功能障碍影响，例如皮肤。

在许多患者中，α-1-抗胰蛋白酶缺陷是由突变引起的，所述突变包括例如E342K(Glu342Lys)错义突变，本文称为Z突变体(Z-AT)。突变体Zα-1-抗胰蛋白酶形成聚合物，其在细胞中积累并可扰乱受影响组织的功能。在α-1抗胰蛋白酶缺陷中最常受聚合物积聚影响的器官是肝脏，其引起肝脏损伤，并且在严重的情况下发展到需要肝脏移植。A1AT的聚合物也存在于其它组织中，包括血液、肺和皮肤。聚合物已显示为促炎的，并且可能有助于发现它们的组织中的病理学，特别是肺和皮肤。

目前对α-1-抗胰蛋白酶缺陷相关病症的治疗限于使用来源于人血浆的M-AT(野生型α1抗胰蛋白酶蛋白)的蛋白替代疗法，通常每周给药一次。虽然这种疗法对包括肺气肿在内的肺病有效，但它对肝细胞ER中聚合Z-AT的累积所引起的肝病没有作用。对于10-15％的Z-AT累及的肝病(包括纤维化、肝硬化和肝细胞癌)纯合子，肝移植是唯一可用的治疗选择。此外，聚合Z-AT在肺上皮中的积累对嗜中性粒细胞具有化学引诱物作用，这可能导致结缔肺组织的进一步破坏。因此，需要治疗与α-1-抗胰蛋白酶缺陷以及α-1-抗胰蛋白酶毒性积累相关的疾病状况的治疗剂和方法。

本发明人已经鉴定了能够调节α1抗胰蛋白酶、特别是突变Z-AT形式的化合物，防止其在肝脏中聚合，从而潜在地可用于治疗与α1抗胰蛋白酶、更特别是与α1抗胰蛋白酶的突变形式、特别是Z-AT相关的疾病，包括肝脏疾病。

本发明人特别鉴定了能够以防止蛋白质聚合的方式结合α

发明概述

在第一个方面，本发明提供了一种物质，其用于治疗由α

一种分子量为1000道尔顿或更小的化合物。

优选地，所述化合物能够通过诱导在α

优选地，所述化合物对M-α

所述化合物可以包含式(IA)的四价结构部分

其中所述化合物能够通过在以下之间形成氢键而结合包含SEQ ID NO:1的序列的α

其中：所述化合物能够通过在以下之间形成氢键而结合包含SEQ ID NO:1的序列的α

更具体地，所述化合物可包含式(IC)的单价结构部分

其中：所述化合物能够通过在以下之间形成氢键而结合包含SEQ ID NO:1的序列的α

其中R

更具体地，所述化合物可以具有式(ID)的结构

其中：所述化合物能够通过在以下之间形成氢键而结合包含SEQ ID NO:1的序列的α

任选地R

任选地R

其中：R

例如，所述化合物可以具有式(I)的结构

其中：R

任选地在式(I)中:R

本发明还提供了如上定义的物质。更进一步，本发明提供了一种鉴定候选药物化合物的方法，所述方法包括：使所述候选药物化合物与包含SEQ ID NO:1的序列的α

在更进一步的方面，本发明提供了下面的实施方案[1]至[11]。

[1]化合物:(a)其具有式(I)的结构:

其中：R

(b)是其药学上可接受的溶剂合物、复合物、互变异构体、同位素标记的衍生物或前药。

[2]用于治疗法的如[1]中所定义的化合物。

[3]如[1]中所定义的化合物，其用于治疗由α1抗胰蛋白酶介导的疾病或病症。

[4]药物组合物，其包含如[1]中所定义的化合物和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂。

[5]治疗个体中由α1抗胰蛋白酶介导的疾病或病症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的如[1]中所定义的化合物。

[6]如[1]中所定义的化合物在制备用于治疗由α1抗胰蛋白酶介导的疾病或病症的药物中的用途。

[7]组合，其包含如[1]中所定义的化合物和至少一种另外的治疗剂。

[8]组合，其包含如[1]中所定义的化合物和至少一种另外的治疗剂，所述组合用于治疗，特别是用于治疗由α1抗胰蛋白酶介导的疾病或病症。

[9]组合，其包含如[1]中所定义的化合物和至少一种另外的治疗剂，所述组合用于治疗由α1抗胰蛋白酶介导的疾病或病症。

[10]治疗由α1抗胰蛋白酶介导的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的人施用治疗有效量的组合，所述组合包含[1]中定义的化合物和至少一种另外的治疗剂。

[11]包含如[1]中所定义的化合物和至少一种其它治疗剂的组合在制备用于治疗由α1抗胰蛋白酶介导的疾病或病症的药物中的用途。

附图简述

图1是本发明的代表性化合物与α

图2是本发明的代表性化合物与α

图3是本发明的代表性化合物在蛋白质的结合位点的二维可视化示意图，突出了一些包含结合位点的氨基酸残基，以及与化合物形成显著分子间相互作用(例如氢键)的蛋白质内的部分化学结构(以虚线显示)，如实施例2中更详细描述。

发明详述

定义

如本文所用，烷基是直链或支链饱和烃基。在一个实例中，烷基含有1至5个碳原子。烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基和新戊基。

如本文所用，链烯基是含有一个或多个(例如一个)碳碳双键的直链或支链烃基。在一个实例中，烯基包含2至5个碳原子。

如本文所用，炔基是含有一个或多个(例如一个)碳碳三键的直链或支链烃基。在一个实例中，炔基含有2至5个碳原子。

如本文所用，烷氧基(例如，C

如本文所用，烷基硫羟(例如，C

如本文所用，芳基通常为C

如本文所用，杂芳基通常为含有5至14个环原子的单环、芳环或多环环系，其中至少一个环是芳环。杂芳基含有至少一个(例如1、2、3或4个)选自O、S、N的环杂原子(例如形成至少一个环O、S(O)

单环杂芳基的实例包括噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、三唑基、噻二唑基、噁二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基和四唑基。

多环杂芳基的实例包括氧化吲哚基(oxindolyl)、苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并三唑基、吲哚基、异吲哚基和吲唑基。氧化吲哚基包括2-氧化吲哚基(即衍生自2-吲哚酮的单价基团，也称为2-二氢吲哚酮)和3-氧化吲哚基(即衍生自3-吲哚酮的单价基团，也称为3-二氢吲哚酮)。

在芳基或杂芳基中，至少一个(例如1、2或3个)碳环原子可以被羰基取代(即-C(O)-)。例如，苯并噁唑基可以任选在其2-位上包含替代碳的-C(O)-，从而产生衍生自苯并噁唑酮的单价杂芳基。

除非另有说明，否则芳基或杂芳基通常是未取代的。然而，当这类基团被指明为未取代或被取代时，一个或多个氢原子可任选被氘原子、卤素原子或羟基、硫羟(-SH)、硝基、磺酸、腈(-CN)、氨基(例如-NR

优选的这种取代基是氘原子、氟原子、氯原子或羟基、硝基、腈(-CN)、-NR

优选地，取代的芳基或杂芳基具有1至5个取代基、更优选地1至3个取代基且最优选地1或2个取代基。优选地，取代的芳基或杂芳基带有不超过2个硝基取代基和不超过2个磺酸取代基。

如本文所用，卤素原子通常为F、Cl、Br或I原子，优选地为F或Cl原子。

为了避免疑义，术语α

除非另有说明，否则所有提及的包含一个或多个氢原子的有机基团也包括它们的部分或完全氘化的对应物。例如，本文提及的烷基包括由碳和氢原子组成的烷基、含有碳原子以及氢原子和氘原子的混合物的烷基、以及完全氘化的烷基。然而，优选地，除了明确指出的以外，此类有机基团不是部分或完全氘化的。

关于本发明化合物的通用信息、包含此类化合物的药物组合物和联合疗法

如本文所用，“本发明的化合物”包括能够抑制α

本文所用术语“有效量”是指将引起组织、系统、动物或人类的生物或医学响应的药物或活性剂的量，所述生物或医学响应是例如研究人员或临床医生所寻求的。此外，术语“治疗有效量”是指与未接受该量的相应个体相比，导致疾病、障碍或副作用的治疗、治愈、预防或改善，或者疾病或障碍的进展速率的降低的任何量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。

本文所用的术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适用于与人和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激性或其它问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和剂型。

本发明的化合物可以是盐的形式。

通常，本发明的盐是药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”中所包括的盐是指本发明化合物的无毒盐。关于合适的盐的综述参见Berge等,J.Pharm.Sci.1977,66,1-19。

本发明的化合物可以以固体或液体形式存在。在固体形式中，本发明的化合物可以以从完全无定形至完全结晶的连续固态存在。术语“无定形”是指其中材料在分子水平缺乏长程有序性并且根据温度可表现出固体或液体的物理性质的状态。通常，这种材料不能给出独特的X-射线衍射图，并且尽管表现出固体的性质，但形式上更描述为液体。在加热时，发生从固体到液体性质的变化，其特征在于状态的变化，通常是二阶(“玻璃化转变”)。术语“结晶”是指固相，其中材料在分子水平具有规则有序的内部结构，并且给出具有确定峰的独特的X射线衍射图。当充分加热时，所述材料也将表现出液体的性质，但是从固体到液体的变化的特征在于相变化，通常为一阶(“熔点”)。

本发明的化合物可以以溶剂化和非溶剂化形式存在。本文所用的术语“溶剂化物”是指由溶质(在本发明中，本发明的化合物和溶剂)形成的具有可变化学计量的复合物。用于本发明目的这些溶剂不会干扰溶质的生物活性。本领域技术人员将理解，对于结晶化合物可以形成药学上可接受的溶剂化物，其中溶剂分子在结晶过程中被结合到晶格中。所结合的溶剂分子可以是水分子或非水的，例如乙醇、异丙醇、DMSO、乙酸、乙醇胺和乙酸乙酯分子。与水分子结合的晶格通常称为“水合物”。水合物包括化学计量水合物以及含有可变量的水的组合物。本发明包括所有这些溶剂化物。

本发明的化合物可以具有以多于一种的形式结晶的能力，这是一种被称为多晶型的特征，并且应当理解，这样的多晶型形式(“多晶型物”)在本发明的范围内。多晶型现象通常可以作为对温度或压力或两者变化的响应而发生，并且还可以由结晶过程的变化引起。多晶型物可以通过本领域已知的各种物理特性来区分，例如X-射线衍射图、溶解度和熔点。

还应注意，本发明的化合物可形成互变异构体。应当理解本发明化合物的所有互变异构体和互变异构体的混合物都包括在本发明化合物的范围内。

本发明还包括同位素标记的化合物，其与本发明的化合物相同，但一个或多个原子被具有与自然界中最常见的原子质量或质量数不同的原子质量或质量数的原子所取代。适于包含在本发明化合物中的同位素的实例包括氢的同位素，诸如

本发明的某些同位素标记的化合物，例如，那些掺入放射性同位素的化合物，可用于药物和/或底物组织分布研究。放射性同位素氚，即

用较重同位素如氘即

同位素标记的本发明化合物通常可通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与所附实施例和制备中描述的那些类似的方法，使用适当的同位素标记的试剂代替先前使用的非标记的试剂来制备。

在一个实施方案中，本发明的化合物是下列之一：

尽管对于治疗用途，本发明的化合物可以作为原料化学品施用，但是本发明的化合物可以作为药物组合物中的活性成分存在。这样的组合物可以以药学领域公知的方式制备，并且包含至少一种活性化合物。因此，本发明还提供包含本发明化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。赋形剂必须是如下可接受的，即与组合物的其它成分相容，并且对其接受者无害。根据本发明的另一方面，还提供了制备药物组合物的方法，所述药物组合物包括所述活性剂和一种或多种药学上可接受的赋形剂。所述药物组合物可用于治疗和/或预防本文所述的任何病症。

通常，本发明的化合物以药学上有效的量施用。实际施用的化合物的量通常由医师根据相关情况确定，包括待治疗的病症、选择的施用途径、实际施用的化合物、个体患者的年龄、体重和响应、患者症状的严重程度等。

药物组合物可以以单位剂量形式存在，每单位剂量含有预定量的活性成分。术语“单位剂型”是指适合作为用于人类个体和其它哺乳动物的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位含有经计算产生所需治疗效果的预定量的活性物质，以及合适的药物赋形剂、媒介物或载体。典型的单位剂型包括液体组合物的预填充、预先计量的安瓿或注射器，或者在固体组合物的情况下包括丸剂、片剂、胶囊等。

优选的单位剂量组合物是含有活性成分的日剂量或亚剂量或其适当部分的那些。因此，这样的单位剂量可以每天施用一次或多于一次。这样的药物组合物可以通过药学领域公知的任何方法制备。

药物组合物可以适合于通过任何合适的途径施用，例如通过口服(包括含服或舌下)、直肠、吸入、鼻内、局部(包括含服、舌下或经皮)、阴道或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内或皮内)途径。这样的组合物可以通过药学领域已知的任何方法制备，例如通过将活性成分与载体或赋形剂结合。

适于口服施用的药物组合物可以作为离散单元存在，例如胶囊或片剂；粉剂或颗粒；在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；可食用泡沫或条状物(whips)；或水包油的液体乳剂或油包水的液体乳剂。

例如，对于以片剂或胶囊形式口服施用，活性药物组分可以与口服无毒的药学上可接受的惰性赋形剂如乙醇、甘油、水等组合。通过将化合物减小至合适的细小尺寸并与类似制备的药物赋形剂如可食用碳水化合物如淀粉或甘露醇混合来制备粉末。还可存在矫味剂、防腐剂、分散剂和着色剂。

胶囊通过如上所述制备粉末混合物并填充形成的明胶外壳来制备。在填充操作之前，可以将包括助流剂和润滑剂的赋形剂，例如胶态二氧化硅、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙或固体聚乙二醇加入到粉末混合物中。还可以加入崩解剂或增溶剂如琼脂、碳酸钙或碳酸钠以提高胶囊被摄取时药物的利用度。

此外，当需要或必要时，也可将包括合适的粘合剂、助流剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、崩解剂和着色剂的赋形剂掺入混合物中。合适的粘合剂包括淀粉、明胶、天然糖如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成树胶如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等。用于这些剂型的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、皂土、黄原胶等。片剂的配制例如通过制备粉末混合物、制粒或压缩块、加入润滑剂和崩解剂并压制成片剂。通过将适当粉碎的化合物与如上所述的稀释剂或碱，以及任选地与粘合剂如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、或聚乙烯吡咯烷酮，溶解阻滞剂(solution retardant)如石蜡，再吸收促进剂(resorption accelerator)如季盐和/或吸收剂如皂土、高岭土或磷酸二钙混合，来制备粉末混合物。粉末混合物可以通过用粘合剂如糖浆、淀粉糊、阿卡迪亚胶浆(acadiamucilage)或纤维素或聚合材料的溶液润湿并过筛而造粒。作为造粒的替代方案，该粉末混合物可以运行穿过压片机，得到形状不均匀的团块，将其打碎成颗粒。该颗粒可以通过添加硬脂酸、硬脂酸盐、滑石粉或矿物油来润滑以防止粘到片剂成型模具上。随后将润滑的混合物压制成片剂。本发明化合物还可以与自由流动的惰性载体混合并直接压制成片剂而不经过造粒或压块步骤。可以提供由虫胶的密封包衣、糖或聚合材料的包衣以及蜡的上光包衣组成的透明或不透明的保护包衣。可以向这些包衣中添加染料以区分不同的单位剂量。

口服流体如溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂可以以单位剂型制备，以便所给量含有预定量的化合物。糖浆剂可以通过在适当调味的水溶液中溶解化合物来制备，而酏剂通过使用无毒酒精媒介物来制备。混悬剂通过在无毒媒介物中分散化合物来配制。还可以添加增溶剂和乳化剂(如乙氧基化异硬脂醇和聚氧乙烯山梨糖醇醚)、防腐剂、调味添加剂(如薄荷油)或天然甜味剂或糖精或其它人造甜味剂等等。

在适当的情况下，用于口服施用的剂量单位组合物可以微胶囊化。还可以例如通过在聚合物、蜡等等中包衣或包埋颗粒材料，来制备组合物以延长或维持释放。

本发明化合物还可以以脂质体递送体系的形式施用，如小单室脂质体、大单室脂质体和多室脂质体。脂质体可以由多种磷脂，如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱来形成。

适于透皮施用的药物组合物可以以离散的贴剂形式存在，所述贴剂意在与接受者的表皮保持紧密接触达延长的时段。

适于局部施用的药物组合物可以配制成软膏剂、乳膏剂、混悬剂、洗剂、粉剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。

为了治疗眼睛或其它外部组织，例如口腔和皮肤，组合物优选以局部软膏剂或乳膏剂形式施加。当配制成软膏剂时，活性成分可以与石蜡或水混溶性软膏基质一起使用。或者，活性成分可以与水包油乳膏基质或油包水基质一起配制成乳膏剂。

适于局部施用于眼睛的药物组合物包括滴眼剂，其中活性成分溶解或悬浮在合适的载体(尤其是水性溶剂)中。

适于在口腔中局部施用的药物组合物包括锭剂、糖果锭剂和和漱口水。

适于直肠施用的药物组合物可以栓剂或灌肠剂形式存在。

用于鼻或吸入施用的剂型可以方便地配制成气雾剂、溶液剂、混悬剂、滴剂、凝胶剂或干粉剂。供鼻内施用的组合物包括通过滴入或加压泵施用至鼻的水性组合物。合适的组合物含有水作为用于此目的的稀释剂或载体。用于施用至肺部或鼻的组合物可含有一种或多种赋形剂(例如一种或多种混悬剂、一种或多种防腐剂、一种或多种表面活性剂、一种或多种张力调节剂、一种或多种共溶剂)，并且可包括控制组合物pH的组分，例如缓冲系统。此外，所述组合物可含有其它赋形剂，例如抗氧化剂(例如焦亚硫酸钠)和味道掩蔽剂。也可通过雾化将组合物施用至鼻或呼吸道的其它区域。

鼻内组合物可使本发明的组合物(一种或多种)能递送到鼻腔的所有区域(靶组织)，此外，可允许本发明的组合物(一种或多种)与靶组织保持接触较长时间段。鼻内组合物的合适施用方案将让患者在清洁鼻腔后通过鼻子缓慢吸入。在吸入期间，将所述组合物施用至一个鼻孔，而另一个则用手按住。然后对另一鼻孔重复该过程。通常，按照以上过程，每天1、2或3次，理想的是每天1次，给每个鼻孔施用一次或两次喷雾。特别感兴趣的是适用于每天一次施用的鼻内组合物。

供肺部或鼻施用的组合物可含有一种或多种赋形剂，其可通过包括一种或多种防腐剂而防止微生物或真菌污染和生长。药学上可接受的抗微生物剂或防腐剂的实例包括、但不限于季铵化合物(例如苯扎氯铵、苄索氯铵、溴化十六烷基三甲铵、西吡氯铵、劳拉氯铵和肉豆蔻基甲基吡啶鎓氯化物)、汞剂(例如硝酸苯汞、醋酸苯汞和硫柳汞)、醇试剂(例如氯丁醇、苯乙醇和苯甲醇)、抗细菌的酯类(例如对羟基苯甲酸酯类)、螯合剂例如乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)和其它抗微生物剂例如氯己定、氯甲酚、山梨酸及其盐(例如山梨酸钾)和多粘菌素。药学上可接受的抗真菌剂或防腐剂的实例包括、但不限于苯甲酸钠、山梨酸、丙酸钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯。防腐剂(一种或多种)，如果包括的话，其用量可占组合物总重量的0.001-1％(w/w)，例如0.015％至0.5％(w/w)。

组合物(例如其中至少一种化合物是在混悬液中)可包含一种或多种表面活性剂，其作用是促进药物颗粒在组合物水相中溶解。例如，所用的表面活性剂的用量是在混合期间不会导致发泡的量。药学上可接受的表面活性剂的实例包括脂肪醇类、酯类和醚类，例如聚氧乙烯(20)、脱水山梨醇单油酸酯(聚山梨酯80)、聚乙二醇酯和泊洛沙姆。表面活性剂的用量可占组合物总重量的约0.01-10％(w/w)，例如0.01-0.75％(w/w)，例如约0.5％(w/w)。

可包含一种或多种张力调节剂以达到体液(例如鼻腔液体)的张力，从而减少刺激水平。药学上可接受的张力调节剂的实例包括、但不限于氯化钠、右旋糖、木糖醇、氯化钙、葡萄糖、甘油和山梨醇。张力调节剂，如果存在的话，其用量可占组合物总重量的0.1-10％(w/w)，例如4.5-5.5％(w/w)，例如约5.0％(w/w)。

可通过加入合适缓冲剂，使本发明组合物得到缓冲，所述缓冲剂例如柠檬酸钠、柠檬酸、氨基丁三醇、磷酸盐例如磷酸氢二钠(例如十二水合物、七水合物、二水合物和无水形式)或磷酸钠及其混合物。

缓冲剂，如果有的话，其用量可占组合物总重量的0.1-5％(w/w)，例如1-3％(w/w)。

味道掩蔽剂的实例包括三氯蔗糖、蔗糖、糖精或其盐、果糖、右旋糖、甘油、玉米糖浆、阿司帕坦、乙酰舒泛-K、木糖醇、山梨醇、赤藓醇、甘草酸铵、奇甜蛋白、纽甜(neotame)、甘露醇、薄荷醇、桉叶油、樟脑、天然矫味剂、人工矫味剂及其组合。

可包含一种或多种共溶剂以帮助溶解药物化合物(一种或多种)和/或其它赋形剂。药学上可接受的共溶剂的实例包括、但不限于丙二醇、二丙二醇、乙二醇、甘油、乙醇、聚乙二醇(例如PEG300或PEG400)和甲醇。在一个实施方案中，共溶剂是丙二醇。

共溶剂(一种或多种)，如果有的话，其用量可占组合物总重量的0.05-30％(w/w)，例如1-25％(w/w)，例如1-10％(w/w)。

供吸入施用的组合物包括通过加压泵或吸入器(例如，贮库干粉吸入器(reservoir dry powder inhaler)、单位剂量干粉吸入器、预计量的多剂量干粉吸入器、鼻吸入器或加压气溶胶吸入器、雾化吸入器或吹入器)施用至呼吸道的水性、有机或水性/有机混合物、干粉或结晶组合物。出于此目的合适的组合物含有水作为稀释剂或载体，并且可与常规赋形剂一起提供，所述赋形剂例如缓冲剂、张力调节剂等。水性组合物也可通过雾化施用至鼻和呼吸道的其它区域。这类组合物可以是从加压包装(例如计量剂量吸入器)并使用合适的液化抛射剂递送的含水溶液或混悬液或气溶胶。

用于局部施用至鼻(例如用于治疗鼻炎)或肺部的组合物，包括通过加压泵递送到鼻腔的加压气溶胶组合物和水性组合物。非加压的并适于局部施用至鼻腔的组合物是特别感兴趣的。合适的组合物含有水作为用于此目的的稀释剂或载体。用于施用至肺部或鼻的水性组合物可与常规赋形剂一起提供，所述赋形剂例如缓冲剂、张力调节剂等。水性组合物也可通过雾化施用至鼻。

流体分配器通常可用于将流体组合物递送到鼻腔。流体组合物可以是水性或非水性的，但通常是水性的。这样的流体分配器可具有分配喷嘴或分配口，在使用者向流体分配器的泵装置施加力以后，通过这些分配喷嘴或分配口分配计量剂量的流体组合物。这样的流体分配器通常提供有多计量剂量的流体组合物的贮库(reservoir)，在连续驱动泵以后就可分配所述剂量。分配喷嘴或口可以构造成用于插入到使用者鼻孔中，以用于将流体组合物喷雾分配到鼻腔中。

通过吸入而局部递送到肺部的干粉组合物可以例如呈胶囊或药筒(cartridge)，例如明胶胶囊或药筒，或泡眼包装形式，例如层压铝箔的泡眼包装形式，用于吸入器或吹入器。粉末混合组合物通常含有用于吸入本发明的化合物的粉末混合物和合适的粉末基质(载体/稀释剂/赋形剂物质)例如单糖、二糖或多糖(例如乳糖或淀粉)。除药物和载体之外，干粉组合物还可包含另外的赋形剂(例如三元剂(ternary agent)例如糖酯例如纤维二糖八乙酸酯、硬脂酸钙或硬脂酸镁)。

在一个实施方案中，可将适用于吸入施用的组合物装入安装于合适的吸入装置中的药物包装(一个或多个)上提供的多个密封剂量容器中。所述容器可以是可破坏的、可撕开的或用其它方式可打开的，一次开一个，并且干粉组合物的剂量通过在吸入装置接口管吸入施用，正如本领域已知的那样。药物包装可以采用多种不同形式，例如盘状或长条状。

干粉可吸入组合物的另一种递送方法是组合物的计量剂量在胶囊剂中提供(每个胶囊一份剂量)，所述胶囊剂然后装在吸入装置中，通常按照患者的需要。该装置具有工具以打破、刺穿或其它方法打开胶囊，使得当患者在装置接口管吸气时剂量能够被带入至患者肺部。

适用于吸入的加压气溶胶组合物可以是混悬液或溶液并且可含有本发明的化合物或其药学上可接受的盐和合适的抛射剂例如碳氟化合物或含氢的含氯氟烃或其混合物，特别是氢氟烷烃(hydrofluoroalkane)，尤其是1,1,1,2-四氟乙烷、1,1,1,2,3,3,3-七氟-正丙烷或其混合物。气溶胶组合物可任选包含本领域众所周知的另外的组合物赋形剂，如表面活性剂，例如油酸、卵磷脂或低聚乳酸或其衍生物，例如描述于WO 94/21229和WO 98/34596(Minnesota Mining and Manufacturing Company)中的那些；和共溶剂，例如乙醇。加压组合物通常装在罐(例如铝罐)中，用阀(例如计量阀)密闭并装入具有接口管的驱动器中。

适于阴道施用的药物组合物可以阴道栓、卫生棉条、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫或喷雾制剂形式存在。

适于胃肠外施用的药物组合物包括水性和非水性无菌注射液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及使该组合物与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌混悬剂，其可以包含助悬剂和增稠剂。该组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶中，并可以以仅需要在临使用前添加无菌液体载体(例如注射用水)的冷冻干燥(冻干)条件储存。即时注射液和混悬剂可以由无菌粉末、颗粒和片剂来制备。

要理解的是，除了上文特别提及的成分之外，该组合物可以包含就相关制剂类型而言在本领域中常规的其它试剂，例如适于口服施用的那些可以包含矫味剂。

活性剂的治疗有效量将取决于许多因素，包括例如，个体的年龄和体重，需要治疗的确切病症及其严重程度，制剂的性质，以及施用途径，并最终将由监护医师或兽医自主决定。特别地，待治疗的个体是哺乳动物，特别是人。

该活性剂可以以每日剂量施用。该量可以以每天单一剂量给予，或更通常以每天多个(如两个、三个、四个、五个或六个)分剂量给予，以使得每日总剂量相同。

适宜地，根据本发明施用的本发明的化合物的量将是选自每天0.01mg至5g的量(作为游离或未盐化化合物计算)。。

另外，本发明的化合物可以作为前药施用。如本文所用，本发明化合物的“前药”是所述化合物的功能衍生物，当对患者施用时，其最终在体内释放本发明化合物。作为前药的本发明化合物的施用可以使本领域技术人员能够进行以下一项或多项：(a)改变化合物在体内活性的发起；(b)改变化合物在体内的作用持续时间；(c)修饰化合物在体内的运输或分布；(d)改变化合物在体内的溶解度；和(e)克服所述化合物遇到的副作用或其它困难。用于制备前药的典型功能衍生物包括化合物的修饰，其在体内是化学或酶可分裂的。包括磷酸酯、酰胺、酯、硫酯、碳酸酯和氨基甲酸酯的制备的这些修饰是本领域技术人员公知的。

本发明含义内的前药的具体且严格非限制性实例包括式(IA)、(IB)、(IC)、(ID)和(I)化合物的衍生物，其中羟基部分被能够在体内降解(例如通过水解)产生羟基结构部分的反应性结构部分替代。为了避免疑问，式(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的羟基结构部分是由化学式中的标记“I”指示的，并且式(I)的羟基结构部分是连接至在化合物的苯环与丙基侧基之间的碳原子的羟基结构部分。类似地，本发明包括式(II)化合物的衍生物，其中Z是能够在体内降解(例如，通过水解)产生羟基结构部分的反应性结构部分。这种反应性结构部分的严格非限制性且仅是代表性的实例包括式OR

本发明的化合物可以单独使用，或与其它治疗剂组合使用。本发明的化合物和其它药物活性剂(一种或多种)可以一起或单独施用，并且当单独施用时，可以同时施用或以任意次序顺序施用，通过任何方便的途径以单独或组合的药物组合物的形式施用。

对本发明的组合物(一种或多种)和其它药物活性剂(一种或多种)的量和施用的相对时间安排进行选择以实现所需组合治疗效果。本发明的化合物和其它治疗剂(一种或多种)可以通过在包含两种化合物的单一药物组合物中同时施用来组合使用。或者，该组合可以在单独的药物组合物(各药物组合物包含化合物之一)中以顺序方式单独施用，其中，例如首先施用本发明的化合物，接着施用另一化合物，并且反之亦然。此类顺序施用可以在时间上接近(例如同时)或在时间上远离。此外，无所谓该化合物是否以相同的剂型施用，例如一种化合物可以局部施用，而另一种化合物可以口服施用。适宜地，两种化合物均口服施用。

组合可以组合试剂盒形式存在。本文中所用的术语“组合试剂盒”或“多部分试剂盒”是指用于施用本发明的组合的一种或多种药物组合物。当两种化合物同时施用时，该组合试剂盒可以以单一药物组合物(如片剂)或以单独的药物组合物含有两种化合物。当化合物并非同时施用时，该组合试剂盒将在单一包装中的单独药物组合物中或在单独包装中的单独药物组合物中含有各化合物。

该组合试剂盒还可以通过说明书提供，如剂量和施用说明书。此类剂量和施用说明书可以是提供给医生的类型，例如通过药品标签，或者它们可以是由医生提供的类型，例如给患者的说明书。

当组合以顺序方式单独施用时，其中首先施用一种，接着施用另一种，或反之亦然，此类顺序施用可以在时间上接近或在时间上远离。例如，包括在第一种活性剂施用后几分钟至几十分钟施用另一活性剂，以及在第一种活性剂施用后几小时至几天施用另一活性剂，其中时间间隔不受限制，例如，一种活性剂可以每天施用一次，另一种活性剂可以每天施用2或3次，或者一种活性剂可以每周施用一次，另一种活性剂可以每天施用一次等等。

本领域技术人员将清楚，在适当的情况下，其它治疗成分(一种或多种)可以以盐的形式(例如作为碱金属或胺盐或作为酸加成盐)、或前药的形式、或作为酯(例如低级烷基酯)、或作为溶剂化物(例如水合物)来使用以优化该治疗成分的活性和/或稳定性和/或物理特性(如溶解度)。还将清楚的是，在适当的情况下，该治疗成分可以以光学纯的形式使用。

当在同一组合物中组合时，要理解的是两种化合物必须是稳定的，并且彼此相容和与该组合物的其它组分相容，并可以配制用于施用。当单独配制时，它们可以以任何方便的组合物形式提供，方便地以本领域中对此类化合物已知的方式提供。

当本发明的化合物与针对相同的疾病、病症或障碍有效的第二治疗剂组合使用时，各化合物的剂量可以不同于单独使用该化合物时的剂量。本领域技术人员将容易了解适当的剂量。

在一个实施方案中，本发明的方法与用途中的哺乳动物是人。

本发明化合物的详述

本发明的化合物是能够抑制α

所述化合物通常是小分子化合物。如本文所用，小分子化合物通常具有2000道尔顿或更小，更经常1000道尔顿或更小，优选800道尔顿或更小的分子量。更优选分子量为600或更低，最优选500或更低。例如，小分子药物可以具有250至800，例如300至600的分子量。

在本发明的一个方面，能够抑制α

其中:

-R

-R

-R

-Z是OH、F、-NHCHO、-CH

-Q是-C(＝O)-、-C(＝S)-、-C(＝NOH)-、-C(＝NNH

优选基团R

优选的基团R

优选的基团R

Z优选地是OH或F，最优选是OH。

Q优选地是-C(＝O)-,-C(＝S)-或-S(O)

在优选的实施方案中，通式(II)的化合物是通式(ID)的化合物，再更优选地是通式(I)的化合物，如本文其他地方另外定义的。

化合物与α

本发明的化合物能够结合α

表达“能够结合α

X

其中X

为了避免疑义，如果化合物能够结合任何这样的蛋白质，即包含SEQ ID NO:1的序列的任何单一蛋白质，则它是本发明的化合物(即，化合物不必须结合SEQ ID NO:1所包括的所有可能的变体，并且这样的结合也不排除化合物也可以结合其它蛋白质，例如包含不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的那些蛋白质的可能性)。

此外，也为了避免疑问，归于α

野生型M-AT的最常见等位基因是M1V等位基因(估计占总量的44-49％)。在M1V等位基因中，X

MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLAEDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQVTTVKVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK。

Z-α

MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLAEDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQATTVKVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDKKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK。

为了易于处理(例如，在产生α

在一个优选实施方案中，所述化合物能够结合包含SEQ ID NO:1的蛋白质，其中X

在另一个示例性实施方案中，蛋白质可以是包含SEQ ID NO:1的序列，并且其另外包含由表达载体提供的亲和标记物(例如六组氨酸亲和标记物)和/或氨基酸。例如，这种蛋白质可以是在大肠杆菌中表达的蛋白质。一种这样的示例性蛋白质的全序列是SEQ ID NO:4的序列，即

MRGSHHHHHHTDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQVTTVKVPMMKRLGMFNIQHSKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK。

本发明实施例2中所用的该蛋白包含N-末端序列MRGSHHHHHHT，其具有六组氨酸亲和标记物和合成中所用表达载体提供的氨基酸，其中X

本发明的重要发现是主题化合物能够特异性结合到α

更特别地，所述结合位点优选位于所述α

因此，优选地，所述结合位点位于所述α

“位于β-折叠-A和β-折叠-B之间”是指当化合物与α

更具体地说，结合位点更优选位于对应于以下三个或更多个的氨基酸链之间:(a)SEQ ID NO:1的残基191-194；(b)SEQ ID NO:1的残基288-293；(c)SEQ ID NO:1的残基371-374；(d)SEQ ID NO:1的残基249-253；和(e)SEQ ID NO:1的残基240-243。特别优选的是，结合位点位于对应于以下四个或更多个、最优选位于对应于以下每一项的氨基酸链之间：(a)SEQ ID NO:1的残基191-194；(b)SEQ ID NO:1的残基288-293；(c)SEQ ID NO:1的残基371-374；(d)SEQ ID NO:1的残基249-253；和(e)SEQ ID NO:1的残基240-243。另外优选的是，结合位点还位于相应于(f)SEQ ID NO:1的残基338-341的氨基酸链之间。“氨基酸链”是指蛋白质中如本文编号的多个氨基酸残基，例如对应于SEQ ID NO:1的残基191-194的氨基酸链是指SEQ ID NO:1的氨基酸191、192、193和194。“位于”所述氨基酸链“之间”是指当化合物与α

在一个示例性的方面，结合位点包含SEQ ID NO:1的W194、Y244、L291、P289、F252、K290、I293、L338、I340、F372和M374中的一个或多个。在该示例性的方面，所述结合位点优选包含SEQ ID NO:1的W194、Y244、L291、P289、F252、K290、I293、L338、I340、F372和M374中的三个或多个、更优选五个或多个、还更优选七个或多个、更优选九个或多个。结合位点可例如包含SEQ ID NO:1的W194、Y244、L291、P289、F252、K290、I293、L338、I340、F372和M374中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或全部11个。与结合位点相关的特别优选的氨基酸是W194、Y244、L291和P289，因此优选地结合位点至少包含W194、Y244、L291和P289。如本文进一步所述，化合物可以最佳地能够与蛋白质的相关氨基酸残基的官能团形成非共价键(包括但不限于氢键)。

优选地，所述化合物对M-α

有助于蛋白质结合的优选结构元件

在本公开的一个示例性方面，化合物包含β-羟基酰胺结构部分，即式–C(OH)(X)-CX

重要的是，已经发现所述β-羟基酰胺结构基序基本上有助于本发明化合物在本发明结合位点结合α

因此，优选所述化合物包含式(IA)的四价结构部分

其中所述化合物能够通过在以下之间形成氢键而结合包含SEQ ID NO:1的序列的α

四价表示式(IA)的结构部分含有四个结合点，即在如下所示的1、2、3和4位:

更优选地，所述化合物包含式(IB)的二价结构部分

二价是指式(IB)结构部分含有两个结合点，即在如下所示的1和2位

在式(IB)中，如在式(IA)中，通常所述化合物能够通过在以下之间形成氢键而结合α

R

R

R

特别优选的R

再更优选地，所述化合物包含式(IC)的单价结构部分

单价是指式(IC)结构部分含有一个结合点，即在以下1位

在式(IC)中，如在式(IA)和(IB)中，通常所述化合物能够通过在以下之间形成氢键而结合α

R

当R

当R

对于其中一个碳环原子被羰基取代的任何芳基或杂芳基，所得环实体为-C(O)-。当“母体”碳环原子与相邻环原子形成双键时，该碳环原子取代为-C(O)-伴随着所述相邻环原子的饱和，例如通过向其加入氢原子或本文定义的任选取代基。

特别优选的R

其中与环原子(优选碳环原子)连接的一个或多个H-基团可以被取代基取代。

再更优选地、R

优选R

R

在一个示例性方面，R

其中R

特别优选的是，所述化合物具有式(ID)的结构

在式(ID)中，如在式(IA)、(IB)和(IC)中，通常所述化合物能够通过在以下之间形成氢键而结合α

式(ID)中的R

R

特别优选的R

其中R

优选地在R

式(ID)中R

-R

-R

-R

式(ID)中R

-R

-R

-R

其中与环原子连接的一个或多个(例如1-3个)H-基团任选被选自卤素原子和C

-R

式(ID)中R

-R

-R

-R

-R

-其中R

在一个示例性方面，所述化合物具有式(I)的结构

其中

-R

-R

-R

优选地在式(I)中，R

特别优选地在式(I)中，R

非限制性的示例性式(I)化合物是那些，其中:(a)R

治疗适应证

本发明的化合物可用于治疗由α1抗胰蛋白酶介导的疾病，包括α-1-抗胰蛋白酶缺陷。由α-1抗胰蛋白酶介导的疾病包括α-1抗胰蛋白酶缺陷、肝功能障碍、纤维化、肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌，肺部疾病、功能障碍和炎症包括哮喘、COPD、肺气肿和肺癌，皮肤炎性病症包括皮炎和瘙痒。通常，由α-1抗胰蛋白酶介导的疾病是α-1抗胰蛋白酶基因突变的结果，并符合被称为‘丝氨酸蛋白酶病’的一般疾病类别。

本发明的化合物可特别用于治疗呼吸系统疾病，包括COPD和肺气肿。

更特别地，本发明的化合物可用于治疗由α1抗胰蛋白酶的突变形式引起的病症，包括α1抗胰蛋白酶的突变Z-AT形式，因此可用于治疗与Z-AT相关的疾病，特别是肝脏疾病，包括黄疸、肝衰竭、肝硬化、自身免疫性肝炎和肝细胞癌。

α-1抗胰蛋白酶缺陷在每2000北欧血统的人中累及1人，导致肝和肺病。在编码α

α

在丝酶抑制蛋白超家族的其它成员中也观察到丝酶抑制蛋白抑制的生理机制和聚合物的病理学产生之间的共性，并且产生一类称为丝酶抑制蛋白病的相关病理学。这些包括神经抑丝酶包涵体家族性脑病(FENIB)，其由神经萜中的聚合突变引起，以及由聚合和抗凝血酶缺陷引起的血栓形成形式。

治疗法和治疗方法

本发明还提供了本发明的化合物，其用于治疗法。本发明具体提供了本发明的化合物作为活性治疗物质在治疗由α-1-抗胰蛋白酶介导的疾病中的用途。

本发明还提供本发明化合物在制备用于治疗由α-1-抗胰蛋白酶介导的疾病的药物中的用途。

在另一个方面，提供了包含本发明化合物和至少一种可用于治疗由α-1-抗胰蛋白酶介导的疾病的其它治疗剂的组合。

在另一个方面，提供了包含本发明化合物和至少一种可用于治疗由α-1-抗胰蛋白酶介导的疾病的其它治疗剂的组合，其用于治疗由α-1-抗胰蛋白酶介导的疾病。

在另一个方面，提供了包含本发明化合物和至少一种可用于治疗COPD的其它治疗剂的组合在制备用于治疗由α-1-抗胰蛋白酶介导的疾病的药物中的用途。

在另一个方面，提供治疗COPD的方法，其包括向有此需要的人施用治疗有效量的组合，所述组合包含本发明的化合物和至少一种可用于治疗由α-1-抗胰蛋白酶介导的疾病的其它治疗剂。

在另一个方面，提供了药物组合物，其包含含有本发明化合物和至少一种可用于治疗α-1-抗胰蛋白酶介导的疾病的其它治疗剂的组合以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。

呼吸系统疾病

对于治疗呼吸系统疾病，包括COPD，本发明的化合物或药物组合物可以与一种或多种支气管扩张剂或其药物组合物一起施用。例如，本发明的化合物可以与一种或多种支气管扩张剂一起配制在单一组合物中，例如用于吸入的干粉剂。或者，包含本发明化合物的药物组合物可与包含一种或多种支气管扩张剂的药物组合物同时或依次施用。在另一个替代方案中，包含本发明化合物和支气管扩张剂的组合物可以与包含另一种支气管扩张剂的药物组合物联合施用。在一个实施方案中，包含本发明化合物的药物组合物和包含一种或多种支气管扩张剂的药物组合物可以各自保持在适于通过吸入同时施用两种组合物的装置中。在另一个实施方案中，包含本发明化合物以及支气管扩张剂的药物组合物和包含另一种支气管扩张剂的药物组合物可以各自保持在适于通过吸入同时施用两种组合物的装置中。

与本发明化合物一起施用的合适支气管扩张剂包括β

肝病

为了治疗肝病，本发明的化合物或药物组合物可以与用于治疗这些疾病的其它治疗剂一起施用。

通用合成方法

通式(I)化合物可以通过有机合成领域已知的方法制备。在所有方法中，应充分理解，根据化学一般原理，必要时可以使用用于敏感或反应性基团的保护基团。保护基团根据有机合成的标准方法(T.W.Green和P.G.M.Wuts(1999)Protective Groups in OrganicSynthesis，第3版，John Wiley&Sons)操作。这些基团在化合物合成的方便阶段使用本领域技术人员容易明白的方法除去。方法的选择以及反应条件和它们的实施顺序应与式(I)化合物的制备一致。本发明的其它化合物也可使用本领域常规已知的方法制备，并且在适用的情况下，参考本文所述的原理和具体反应。

鉴定候选药物化合物的方法

本发明人发现，本发明的化合物通过在特定结合位点与α

因此，本发明还提供了鉴定候选药物化合物的方法。在该方法中，使候选药物化合物与α

随后，该方法包括解析复合物的结构，这可以使用本领域公知的晶体结构解析方法常规地进行(还参见例如本申请的实施例2)。

最后，该方法包括，确定在复合物中，候选药物化合物是否存在于如本文定义的结合位点中。如果候选药物化合物存在于结合位点中，则这表明化合物可能能够抑制α

实施例

实施例1

通用方法

除非另有说明，原料是可商购的。所有溶剂和商业试剂都是实验室级的，并且按原样使用。

式(I)化合物可以基本上按照反应流程1从相应的氨基醇和相应的苯甲酸的酰胺偶联来合成。

反应流程1

缩写:

DMSO 二甲基亚砜

HATU N-[(二甲基氨基)-1H-1,2,3-三唑并-[4,5-b]吡啶-1-基亚甲基]-N-甲基甲胺鎓六氟磷酸盐N-氧化物

r.t. 室温

Rt 保留时间

LCMS方法

手性HPLC方法

化合物1:

N-[(1S,2R)-1-(3-氟-2-甲基苯基)-1-羟基戊-2-基]-2-氧代-2,3-二氢-1H-吲哚-4-甲酰胺

在圆底烧瓶中，在0℃向(1S,2R)-2-氨基-1-(3-氟-2-甲基苯基)戊-1-醇盐酸盐(中间体1，12.9g，51.9mmol)、2-氧代二氢吲哚-4-甲酸(9.2g，51.9mmol)和三乙胺(10.5g，103.9mmol)在二甲基甲酰胺(100ml)中的溶液中加入HATU(19.8g，51.9mmol)。将该反应混合液在0℃搅拌1h，然后用乙酸乙酯(200ml)稀释。将该溶液用NaHCO3的饱和溶液(100ml)和盐水(2x100 ml)洗涤。将有机部分经硫酸钠干燥，过滤并减压蒸发，得到粗产物，将其经快速色谱纯化(Biotage Isolera,340g柱，二氯甲烷/乙腈80/20至40/60作为洗脱剂)，得到N-[(1S,2R)-1-(3-氟-2-甲基苯基)-1-羟基戊-2-基]-2-氧代-2,3-二氢-1H-吲哚-4-甲酰胺，为白色固体(12.5g，Y＝65.0％)。

在圆底烧瓶中，在室温将(12.5g，33.74mmol)混悬于乙酸乙酯(100ml)中。将该混悬液加热至60℃，并加入乙酸乙酯直至混合物变得均匀(总计≈200ml溶剂)。将该溶液在室温下冷却过夜，通过抽滤收集形成的白色沉淀。将固体在真空下于40℃的烘箱中储存，得到结晶的N-[(1S,2R)-1-(3-氟-2-甲基苯基)-1-羟基戊-2-基]-2-氧代-2,3-二氢-1H-吲哚-4-甲酰胺，为白色固体(10.8g，>98％ee，87％回收)。

LCMS:Rt 0.90min,MH+371(方法A)

手性HPLC:Rt 6.3min

中间体1:

(1S,2R)-2-氨基-1-(3-氟-2-甲基苯基)戊-1-醇盐酸盐

在圆底烧瓶中，在0℃将((1S,2R)-1-(3-氟-2-甲基苯基)-1-羟基戊-2-基)氨基甲酸叔丁酯(中间体2,15.8g，50.74mmol)溶于HCl的4M二噁烷溶液(100ml)中。将该混合物在相同温度下搅拌2小，蒸发溶剂。将残余物混悬于300ml乙醚中，并搅拌1h。将该混悬液过滤，得到(1S,2R)-2-氨基-1-(3-氟-2-甲基苯基)戊-1-醇盐酸盐，为白色固体(11.9g，Y＝95.0％)。

LCMS:Rt 0.85min,MH+212(方法B)

中间体2:

((1S,2R)-1-(3-氟-2-甲基苯基)-1-羟基戊-2-基)氨基甲酸叔丁酯

在圆底烧瓶中，将(R)-(1-(3-氟-2-甲基苯基)-1-氧代戊-2-基)氨基甲酸叔丁酯(中间体3,18.7g，60.4mmol)溶于甲苯(150ml)中，并在室温下加入异丙醇(100ml)和异丙醇铝(49.4g，241.8mmol)。将该溶液在50℃搅拌16小时，，然后将其倒入NH

LCMS:Rt 1.16min,MH+312(方法A)

中间体3:

(R)-(1-(3-氟-2-甲基苯基)-1-氧代戊-2-基)氨基甲酸叔丁酯

在室温下，向圆底烧瓶中的(3-氟-2-甲基苯基)硼酸(中间体4，50g，0.32mol)、(R)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)戊酸对甲苯基硫醇酯((R)-S-p-tolyl2-((tert-butoxycarbonyl)amino)pentanethioate)(53.2g,0.16mol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(7.3g，8.0mmol)和噻吩-2-羧酸铜(I)(61.0g，0.32mol)在1,4-二噁烷(500ml)中的混合物中加入亚磷酸三乙酯(10.6g，64.0mmol)。将该反应混合液在室温搅拌4h，然后在硅藻土垫上过滤。减压蒸发溶剂，并将粗品溶于中乙酸乙酯(500ml)；将该溶液用水(500ml)和盐水(2x 500ml)洗涤。将有机部分经硫酸钠干燥，过滤并减压蒸发，得到粗物质(100g)，为黑色油状物。将65g批次的粗制的物质经快速色谱纯化(Biotage Isolera,3x340g柱，环己烷/二氯甲烷60/40至0/100作为洗脱剂)，得到(R)-(1-(3-氟-2-甲基苯基)-1-氧代戊-2-基)氨基甲酸叔丁酯，为无色油状物(18.7g，60.4mmol)。

LCMS:Rt 1.26min,MH+310(方法A)

中间体4:

(R)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)戊酸对甲苯基硫醇酯((R)-S-p-tolyl2-((tert-butoxycarbonyl)amino)pentanethioate)

在圆底烧瓶中，向(R)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)戊酸(中间体5,85.0g，0.39mol)在乙酸乙酯(800ml)中的溶液中加入4-甲基苯-1-硫醇(53.5g，0.43mol)和1-羟基苯并三唑(50.0g，0.59mol)。将该混合液冷却至0℃，并加入N,N′-二环己基碳二亚胺(80.5g，0.39mol)。将该反应混合液在室温搅拌16h；然后通过抽滤除去形成的白色固体。将滤液用NaHCO3的饱和溶液(700ml)、水(700ml)和盐水(700ml)洗涤。将有机部分经硫酸钠干燥，过滤，并将溶剂减压蒸发，得到粗产物，为白色固体。将粗制的物质经快速色谱纯化(BiotageIsolera,340g柱，环己烷/二氯甲烷60/40至0/100作为洗脱剂)，得到(R)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)戊酸对甲苯基硫醇酯，为白色固体(111.0g，Y＝88.0％)。

LCMS:Rt 1.30min,MH+324(方法A)

中间体5:

(R)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)戊酸

在圆底烧瓶中，在室温下，向(2R)-2-氨基戊酸(75.0g，0.64mol)在水(250ml)中的混悬液中加入碳酸钠(68.0g，0.64mol)。经一小时滴加二碳酸二叔丁酯(139.9g，0.64mol)在四氢呋喃(400ml)中的溶液。将该反应混合液在室温搅拌24h，然后减压浓缩(约400ml)。加入饱和柠檬酸溶液(300ml)，直到pH值达到≈3。将水层用乙酸乙酯(4x 500ml)洗涤。收集有机部分，用硫酸镁干燥并减压蒸发，得到(R)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)戊酸，为浅黄色油状物(137.0g，Y＝98.6％)。

LCMS:Rt 0.82min,MH+218(方法A)

类似地制备了:

本发明化合物抑制Z-α-1-抗胰蛋白酶(Z-A1AT)聚合的效力可通过对本文所述纯化的Z-A1AT进行时间分辨荧光能量转移(TR-FRET)试验来测定。所有式(I)化合物都已证明具有半数最大抑制浓度(IC

Z-α-1-抗胰蛋白酶聚合抑制试验方案

从Z-A1AT型纯合供体的人血浆中纯化Z-α-1-抗胰蛋白酶。根据公开的方案(Lomas等Biochemistry 1993；32:500-508)进行纯化，包括硫酸铵沉淀、硫醇交换分级和阴离子交换分级。

在384孔测定板中，在含有0.01％Tween-20的PBS缓冲液中将纯化的Z-A1AT稀释至5nM，并与溶解于DMSO中的不同浓度的抑制剂化合物混合。在37℃下孵育72小时后，通过向测定板中加入抗体检测混合物，使用时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)测定模式检测Z-A1AT聚合物的量。检测混合物含有A1AT-聚合物特异性单克隆抗体(Miranda等人Hepatology 2010；52:1078–1088)、铽标记的抗小鼠抗体，多克隆兔抗A1AT抗体和Alexa488标记的抗兔抗体。将TR-FRET数据用对照标准化(DMSO载体对照产生0％抑制，活性化合物的饱和浓度产生100％抑制)，通过用4-参数逻辑曲线拟合标准化数据得出IC50值。

实施例2

介绍

本工作的目的是开发Zα

本文报道了通过优化来自编码文库技术筛选的命中物获得的第一种Zα

材料和方法

按照Lomas等，Biochemistry.1993；32:500-8所述，从ZZ和MMα

“化合物1”是N-[(1S,2R)-1-(3-氟-2-甲基苯基)-1-羟基戊-2-基]-2-氧代-2,3-二氢-1H-吲哚-4-甲酰胺:

DNA-编码文库技术(ELT)筛选

使用大约10百万化合物的编码文库技术(ELT)筛选来鉴定在37和41℃下稳定单体Zα

基于抗体的Zα

基于抗体的时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)测定用于监测在37℃下与不同浓度的化合物孵育72小时后5nM Zα

Zα

化合物1的荧光衍生物通过用Alexa Fluor 488标记物经由短的有机连接基团在化合物1的环氮原子上衍生化来制备。

用测定缓冲液将试验化合物在DMSO中的系列稀释液稀释25倍，并将2.5μl的该中间稀释液转移到黑色的低体积384孔微量滴定板(Greiner BioOne；产品号784076)中。使用Thermo多点分配器(ThermoFisher)加入5μl测定缓冲液的预混合溶液，所述测定缓冲液含有2.3nM与抗胰蛋白酶结合的单克隆抗体3Cl 1、3nM将要与3C11抗体结合的LanthaScreen铽标记的抗小鼠IgG(Invitrogen)、以及2nM Z-alAT和10nM M-alAT之一。将板在室温下孵育30分钟，然后使用Thermo多点分配器加入2.5μl配体溶液，其含有40nM(对于Zα

将板密封并在室温下孵育过夜，或在4℃孵育3天，然后在室温下孵育6小时。在不存在竞争性化合物的情况下，能量转移可以发生在铽和Alexa488荧光团之间。与化合物1的荧光衍生物竞争的化合物抑制该信号。TR-FRET信号在Envision平板读数器上通过在337nm激发铽和在520nm和495nm检测发射来读取。

根据Cheng-Prusoff方程，考虑到所用荧光配体的浓度与在独立荧光偏振和TR-FRET实验中测定的其亲和力的关系，从pIC50值推导出化合物对Z-a1AT或M-a1AT蛋白的亲和力的解离常数(K

K

化合物缔合(association)试验

α

将停流实验中的动力学数据拟合到具有偏移和线性斜率的指数衰减曲线，以说明背景中的恒定漂移，从而产生观察到的伪一阶速率常数k(obs):

y＝A

其中t＝时间，Ao＝在t＝0时的振幅。然后当绘制k(obs)值对化合物浓度的曲线时，得到二级结合速率(on-rate)作为斜率。从结合速率和结合试验测定的K

细胞生物学

在6孔板中，用0.5μg/mL强力霉素(oxycycline)和各种浓度的化合物同时处理条件性表达Zα

免疫荧光显微术

将CHO-K1细胞与/不与强力霉素一起孵育以表达α

热稳定性实验

在5X浓度SYPRO Orange染料溶液(Life Technologies)存在下通过热变性研究了丝酶抑制蛋白在加入化合物时的天然状态稳定性。使用悬浮于PBS中的终蛋白浓度为0.1mg/ml和50μM的化合物(Nettleship等人，方法s Mol Biol。2008；426:299-318)。在Eppendorph Mastercycler Realplex4定量实时PCR仪上的三个独立实验中，以1℃/分钟的速率将样品从25℃加热到95℃，记录605±15nm箱内的荧光。变性的中点(Tm)是荧光强度对温度的一阶导数(first derivative)达到最大值时的温度。

还使用终点恒温试验测定了对热诱导聚合的抗性。将血浆纯化的M和Zα

平衡解折叠

Bis-ANS是一种染料，报道了α

快速重折叠

由于无定形聚集、聚合和错折叠造成的材料损失，α

晶体学

重组Cys232Serα

具体地，用于结晶实验的α

因此，所用蛋白质的全序列为:

MRGSHHHHHH

其中下划线部分对应于SEQ ID NO:1。

结果

通过编码文库技术筛选、结构指导的药物设计和细胞特性分析(profiling)鉴定化合物1。

Zα

从ELT筛选中鉴定了单一先导系列的手性羟基-羧酰胺，其在TR-FRET免疫测定中在阻断聚合方面显示出功能活性。初始命中的优化遵循基于结构的设计方法，利用来自与α

化合物1是体外和疾病细胞模型中聚合的有效抑制剂

通过使用荧光标记的衍生物的竞争结合试验测定，化合物1以1.5nM的高亲和力(K

曲线的形状和天然质谱与单一化合物结合位点一致。没有观察到荧光衍生物与Z变体的聚合物结合，表明聚合后结合袋的损失和所得的显著构象选择性。化合物与靶的相互作用速率可以通过内在色氨酸荧光的变化来监测；该性质用于测定化合物1与Z(4.1x10

发现化合物1以剂量依赖性方式消除来自血浆的Zα

为了证实化合物1在CHO-TET-ON-Z-A1AT中的效力和功效是对在具有内源性表达水平的肝细胞中所能预期的合理估计，在具有ZZα

由于具有α

化合物1结合至更经常地被Z变体取样的新的隐蔽结合位点

通过将化合物浸泡在apoα

表1数据收集和精修统计

*括号中的值是高分辨壳层(highest-resolution shell)。

该结构揭示了与化合物的相互作用诱导了在apo结构中不明显的隐蔽结合位点在链5后β-折叠-A的顶部形成。该区域被称为“缺口(breach’)”，因为它是蛋白酶抑制期间反应性中心环首先插入的点(Whisstock等人，J Mol Biol.2000；295(3):651-65)，并且包括E342K Z突变的位点。

图1-3显示了所鉴定的结合位点的代表性图像，图1显示了与化合物1结合的蛋白质的概况(残基342-356是无序的，因此在图示中缺失)。图2提供了包括一些邻近残基的结合位点的更详细的视图，其中氢键以虚线显示。图3是化合物1在蛋白质的结合位点的二维可视化示意图，突出了包含结合位点的一些氨基酸残基以及蛋白质内与化合物1形成显著分子间相互作用(例如氢键)的部分化学结构(以虚线显示)。

更详细地，与化合物1复合的α

因此，具体地，发现化合物1能够在本文别处定义的隐蔽结合位点处结合α

化合物1通过稳定化β-折叠A而干扰向易于聚合的中间体M*的转变

α

干扰β-折叠A的打开或干扰其与反应性中心环的N-末端部分的相互作用的突变改变丝酶抑制蛋白抑制靶蛋白酶的能力。在针对模型靶蛋白酶-胰凝乳蛋白酶的不连续实验中，测定M和Zα

为了研究该活性是否与作为化学陪伴分子的作用一致，将M和Zα

化合物1的药物样性质的表征

为了研究化合物1对于进展到体内研究的适合性和作为用于在人体中测试的临床候选者的潜力，针对一组被认为预测潜在安全倾向(safety liabilities)的脱靶体外测试中测定化合物1的特性。化合物1对这些靶大多数无活性，活性水平低至接近16个测试中的灵敏度下限。这些边缘活性的测定的效力比化合物1在阻断Zα

抑制活性的丧失代表了一种手段，通过该手段可以评估与其它丝酶抑制蛋白的可能的脱靶结合。然而，与α

由于化合物1表现出优于脱靶组和其它丝酶抑制蛋白的优良水平的选择性，因此为了探索体内靶接合，探索了该分子的体外和体内PK性质。化合物1具有3.8的ChromLogD(pH7.4)测量值，84.2％的低的与人血清白蛋白的结合，及无定形药物在FaSSIF中良好的溶解度。

化合物1具有适于体内评价该分子的临床前和临床药理学的体外ADME性质。渗透性高，且在低温保存的肝细胞中的体外清除率在人和狗中是低的(分别为0.3±0.05和＜0.65mL/min/g)，在小鼠和大鼠中是中等到高的(分别为4.6和7.4±0.7mL/min/kg)。在以10、30或100mg/kg单次PO施用后，化合物1在雄性CD-1小鼠血液中的平均暴露量随剂量增加(平均剂量标准化的C

化合物1在α

为了研究化合物1在Zα

为了研究化合物1的PK-PD关系，将100、30或10mg/kg化合物1每天三次施用于Zα

最近的工作已经表明，循环中总Zα

综合这些结果，证实了化合物1口服施用后在肝脏中的靶结合，并证明了在α

由于化合物1阻断细胞中聚合物的形成，因此研究了化合物1的施用对肝聚合物水平的影响。最近已经表明，在CHO-TET-ON-Z-A1AT和ZZ-iPSC-肝细胞中形成的Zα

为了研究在实验的时间范围内，在肝脏中是否存在对化合物响应的聚合物亚群，将染色区域分成低、中和高强度区域，并分别对化合物的响应评分。在这些细分的区域中没有观察到化合物的作用。鉴于聚合物形成在体外被化合物1完全阻断，得出结论，需要长期施用以影响Zα

讨论

与α

当化合物1在缺口区域内结合时，显著稳定了α

在下呼吸道缺乏丝酶抑制蛋白活性，导致通过局部释放的中性粒细胞弹性蛋白酶消化肺实质，这有助于在α

由于化合物1在与蛋白质结合的同时抑制α

化合物1阻断无细胞培养基中和细胞ER中的Zα

通过计算机PK模型很好地预测了在转基因Zα

治疗构象性疾病的新机制

本发明的化合物被认为通过在β-折叠A的链5的头部结合从而消除Z突变的局部效应来稳定单体Zα