一种金花三叶降糖茶三种活性成分含量同时测定的方法

技术领域

本发明涉及一种中药新药(壮药)金花三叶降糖茶中活性成分的检测方法，具体的说是一种同时测定金花三叶降糖茶中三种活性成分的方法，属于医药技术领域。

背景技术

随着人们生活水平的不断提高和社会人口老龄化，糖尿病的发病率呈明显上升和年轻化的趋势。糖尿病又是诱发冠心病、动脉硬化、脂肪肝、糖尿病、肥胖症等的重要因素，严重危害人类身体健康。近年来，随着人们生活习惯特别是饮食习惯的改变等多种因素的影响，糖尿病的发病率有明显增高的趋势，而且本病引起的心脑血管疾病等往往发病率高，危害大，病情进展凶险，其死亡率约占人类总死亡率的半数左右。因此，寻求研发高效低毒的降血糖新药物、新技术是极为重要而紧迫的任务，而祖国传统医药及少数民族医药，特别是广西壮医药在防治糖尿病方面具有较大的潜力优势与鲜明特色。

金花三叶降糖茶由金花茶叶、藤茶、荷叶、桑叶等传统药食两用的壮族特色药组方，方中金花茶叶为主药，有清热毒，除湿毒，利水道之功；桑叶能祛风毒，清热毒；木姜叶柯能清热利尿、滋润肝肾；荷叶能清热毒，利水道；藤茶能清热毒，祛湿毒，通龙路，“三叶”合用，共为帮药，主帮配伍，可清湿、热之毒，通龙路，调水道，针对糖尿病患者起到“未病先防，既病防变”的作用。

藤茶含有丰富的黄酮类物质，是藤茶降糖保健作用的重要物质基础，主要有杨梅素、二氢杨梅素、洋芹素、槲皮素等。现在药理研究发现杨梅素可以激活GLP-1受体，增加胰岛素瘤细胞(INS-1)内cAMP 水平，是葡萄糖依赖型胰岛素促分泌剂；杨梅素可以上调编码葡萄糖跨膜转运蛋白的基因Glut-2，调控细胞的糖转运能力，发挥降血糖的作用。杨梅素能增加线粒体的氧化代谢，降低脂肪细胞的脂质含量，改善葡萄糖耐量。二氢杨梅素100、150mg/kg能降低四氧嘧啶致病小鼠血糖，提高糖耐量，减少四氧嘧啶对胰岛的损害，促进糖尿病小鼠肝糖原的合成和胰岛素的分泌；提高糖尿病小鼠的抗氧化能力。木姜叶柯的主要含有黄酮类和三萜类成分，具有降糖、抗过敏、抗氧化、抗菌和改善记忆等作用。刘布鸣等采用遗传性高血糖小鼠、四氧嘧啶诱发高血糖小鼠模型、链脲菌素诱发大鼠高血糖模型，观察木姜叶柯总黄酮对大小鼠血糖和糖耐量的影响，发现木姜叶柯总黄酮能明显降低遗传性高血糖小鼠的空腹血糖；降低四氧嘧啶诱发高血糖小鼠的空腹血糖，并改善其糖耐量；木姜叶柯总黄酮能降低链脲菌素诱发高血糖大鼠的空腹血糖，改善高血糖大鼠糖耐量，可用于糖尿病的治疗。冉军舰等分析根皮苷在分子层面的降糖机制发现其参与组蛋白乙酰化、血糖稳态、乙酰胆碱分解、戊糖降解、嘌呤核苷酸阴离子转运、钙离子稳态等生物过程发挥降糖作用。根皮苷能竞争性的抑制钠葡萄糖协同转运蛋白对根皮苷的重吸收，减少葡萄糖再次进入体循环。因此选择二氢杨梅素、杨梅素、根皮苷为金花三叶降糖茶的质量评价指标，为控制金花三叶降糖茶质量提供科学依据。

本发明建立了同时测定金花三叶降糖茶制剂中二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素三种成分含量的检测方法，实验结果表明，本法建立的HPLC同时测定制剂中多个不同指标成分的含量测定方法，简单快速、准确可靠，重复性及稳定性均较好，可作为该制剂的质量控制方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种同时测定中药(壮药)新药金花三叶降糖茶中二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素三种活性成分含量的方法，该方法简单、稳定、重现性好，可用于该药品的质量控制。

本发明的目的是这样实现的：利用高效液相色谱检测的方法，同时测定制剂中处方药材主要成分二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素的含量，具体步骤如下：

(1)对照品溶液的制备：取二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素适量，加甲醇制成每1mL分别含二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素0.4068、0.0854、0.0987mg/ml的对照品溶液。

(2)供试品溶液的制备：精密称定金花三叶降糖茶0.2g(过65目筛)，置具塞锥形瓶中(3份)，分别精密加入甲醇25mL，超声30min，放冷，补重，过0.22μm微孔滤膜，注入液相小瓶，即得供试品溶液。

(3)色谱条件及样品检测：将混合对照品溶液和供试品溶液分别注入高效液相色谱仪，采用如下色谱条件检测：色谱柱：Dimensions C18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相为乙腈(A)-0.4％磷酸水(B),梯度洗脱：0-20min，14％A→26％A；20-25min，26％→40％；25-30min,40％。波长285nm；进样量5μl，柱温30℃。

本发明具有以下优点和积极效果：

1、本发明所述方法简单、准确、重现性和稳定性好，可为全面评价和控制金花三叶降糖茶质量提供理论基础和科学依据。

2、本发明方法采用高效液相色谱法及梯度洗脱检测的方法，实现了同时测定金花三叶降糖茶中3种有效成分的含量，本发明建立的色谱法能够较好的分离、测定金花三叶降糖茶中二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素有效成分的含量，色谱峰峰形好，分离度较高，在此色谱条件下二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素的浓度与峰面积呈现良好的线性关系，各种成分回收率均在95％以上。

3、本发明方法操作简单、精密度、重现性和稳定性良好，为金花三叶降糖茶有效成分质量控制和药效评价的进一步研究奠定了理论基础和科学依据。

附图说明

图1是本发明二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素混合对照品溶液(A)、供试品溶液(B)、缺藤茶阴性对照(C)、缺木姜叶柯阴性对照(D)

附图标记说明：1-二氢杨梅素、2-根皮苷、3-杨梅素

A-二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素混合对照品溶液HPLC图

B-供试品溶液HPLC图

C-缺藤茶阴性对照HPLC图

D-缺木姜叶柯阴性对照HPLC图

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式对本发明作以进一步的阐述，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。

1.1实验仪器

Agilent1260Ⅱ高效液相色谱仪(Agilent technology)；色谱柱；Cary8453紫外可见分光光度计(Agilent technology)；WFH-203B型暗箱式自动紫外分析仪(昆山市顺诺仪器有限公司)；KQ500DA型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；ME204型分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；硅胶G板(批号：081007，青岛海洋化工厂)；硅胶GF254板(批号：080107，青岛海洋化工厂)

1.2实验试药

荷叶对照药材(批号：121322201504，中国食品药品检定研究院)；二氢杨梅素(MUST-19031501 HPLC≥99.57％(经面积归一化法测定)；成都曼思特有限公司)；芦丁(批号：T7880050，中国食品药品检定研究院)；荷叶碱；上海融禾科技发展有限公司)；杨梅素(MUST-19022504HPLC≥99.5％(经面积归一化法测定)，成都曼思特有限公司)；三氯化铝(批号：20180108，天津市大茂化学试剂厂)；金花三叶降糖茶(批号：20190801、20190802、20190901、20190902、201901002、20191003，均由广西中医药大学提供)

2.实验方法与结果

2.3二氢杨梅素、杨梅素、根皮苷含量测定

2.3.1色谱条件

色谱柱：Dimensions C18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相为乙腈(A)-0.4％磷酸水(B),梯度洗脱：0-20min，14％A→26％A；20-25min，26％→40％；25-30min,40％。波长285nm；进样量5μl，柱温 30℃。

2.3.2供试品溶液制备

精密称定金花三叶降糖茶0.2g(过65目筛)，置具塞锥形瓶中(3份)，分别精密加入甲醇25mL，超声30min，放冷，补重，过0.22μm微孔滤膜，注入液相小瓶，即得供试品溶液。

2.3.3对照品溶液制备

取二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素适量，加甲醇制成每1mL分别含二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素0.4068、 0.0854、0.0987mg/ml的对照品溶液。

2.3.6专属性考察

分别取混合对照品溶液、供试品溶液、缺藤茶阴性样品溶液、缺木姜叶柯阴性样品溶液，按“2.3.1”色谱条件进样测定。阴性样品在目标成分的色谱峰位置的峰面积(A)比供试品目标成分的A的比值<5％，表明阴性样品对检测无干扰，该方法的专属性良好(详见附图1)。

2.3.7标准曲线绘制

精密吸取对照品溶液2、4、6、8、10、12μl，按“2.3.1”色谱条件进样测定，记录峰面积。以含量为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归。其线性范围、标准曲线和相关系数结果见表1。

表1标准曲线

2.3.8稳定性试验

取0.2g金花三叶降糖茶(批号：20190801；过65目筛)，精密称定，按“2.3.2”项下方法制备成供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件操作，分别于2、4、6、8、10、12、24h进行测定，记录峰面积，计算RSD。结果二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素峰面积RSD分别为0.657％、0.880％、0.611％，表明供试品24h 内稳定性良好。

2.3.9精密度试验

取混合对照品溶液，按“2.3.1”色谱条件进样测定，连续进样6次，记录峰面积，计算RSD。结果二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素峰面积RSD为0.089％、0.137％、0.693％，表明仪器精密度良好。

2.3.10重复性试验

取样品0.2g(批号：20190801；过65目筛)，共6份，精密称定，按“2.3.2”项下方法制备成供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件操作，记录峰面积，计算二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素的含量，计算 RSD。结果二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素含量的RSD分别为3.782％、3.238％、1.791％，表明方法重现性良好。

2.3.11加样回收试验

取金花三叶降糖茶(批号：20190801；过65目筛)0.1g，精密称定，以二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素含量分别为0.1332、0.0382、0.0536mg/ml混合对照品溶液代替甲醇，按“2.3.2”项下方法制备成供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件操作，记录峰面积，计算加样回收率，计算RSD。结果二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素的平均回收率分别为98.37％、99.698％、99.02％，RSD分别为1.24％、0.73％、1.49％，该方法回收率符合要求。

表2-9加样回收试验(n＝6)

2.3.12含量测定

取6批金花三叶降糖茶各0.2g，精密称定，按“2.3.2”项下方法制备成供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件操作，记录峰面积。结果见表3，6批产品中，二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素的平均含量分别为32.90、9.56、12.27mg/g。考虑到药材的复杂性，限度按平均值下调20％，暂定金花三叶降糖茶中二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素含量不得少于26.32、7.65、9.82mg/g。

表3 6批样品测定结果

综上所述，本方法的专属性、重现性、准确度均良好，可以作为金花三叶降糖茶含量测定的方法，通过6批样品含量测定结果拟定金花三叶降糖茶中二氢杨梅素、根皮苷、杨梅素含量不得少于26.32、7.65、9.82mg/g。