一种检测苯磺酸氨氯地平与阿托伐他汀钙复方制剂有关物质的方法

技术领域

本发明属于化学药物分析技术领域，具体涉及一种检测苯磺酸氨氯地平与阿托伐他汀钙复方制剂有关物质的方法。

背景技术

苯磺酸氨氯地平与阿托伐他汀钙复方制剂(以下简称复方制剂)属于可固定剂量组成的复方制剂，目前美国辉瑞公司的原研产品(商品名：多达一)共有5mg/10mg，5mg/20mg， 5mg/40mg(以氨氯地平/阿托伐他汀计)共三种规格。临床研究证实，复方制剂具有同时治疗高血压和心绞痛，以及治疗高血脂的作用。因此，进行该复方制剂有关物质研究对提供一种安全有效且副作用小的治疗高血压与高血脂的药物具有十分重要的意义。

通过查阅国内外文献资料及稳定性试验发现，苯磺酸氨氯地平的特定杂质为杂质A和杂质E，阿托伐他汀钙的特定杂质为杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质G和杂质H。而复方制剂中的苯磺酸氨氯地平与阿托伐他汀钙在一定条件下会发生加成反应生成杂质I，因此，复方制剂除了含有苯磺酸氨氯地平和阿托伐他汀钙的特定杂质，还含有其自有的特定杂质I。目前，《中国药典》2020年版二部中尚未收载复方制剂，仅有对苯磺酸氨氯地平或阿托伐他汀钙单一成分的质量控制方法。美国药典(USP43)也仅是采用两个单独的方法分别检测苯磺酸氨氯地平和阿托伐他汀钙的有关物质，并未有同时检测该复方制剂中的苯磺酸氨氯地平、阿托伐他汀钙及其特定杂质的方法，这也导致复方制剂的特定杂质I无法被检测出。

鉴于此，有必要对该复方制剂的有关物质检测方法进行研究，开发一种能同时检测该复方制剂中苯磺酸氨氯地平、阿托伐他汀钙及其特定杂质的方法，从而准确测定复方制剂中的各个特定杂质，进而制定严格的质量控制标准，保证药物质量的可控性，确保用药安全。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测苯磺酸氨氯地平与阿托伐他汀钙复方制剂有关物质的方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种检测苯磺酸氨氯地平与阿托伐他汀钙复方制剂有关物质的方法，使用高效液相色谱仪检测所述苯磺酸氨氯地平与阿托伐他汀钙复方制剂中的苯磺酸氨氯地平、阿托伐他汀钙及杂质，所述高效液相色谱仪的梯度洗脱程序包括：

所述流动相A和所述流动相B均为醋酸铵缓冲液与有机相的混合溶液，所述有机相包括乙腈和/或甲醇，所述流动相A中的醋酸铵缓冲液与有机相的体积比为(70～80)：(30～20)，所述流动相B中的醋酸铵缓冲液与有机相的体积比为(45～55)：(55～45)。

优选地，所述流动相A中的醋酸铵缓冲液与有机相的体积比为(75～80)：(25～20)。

优选地，所述流动相B中的醋酸铵缓冲液与有机相的体积比为(50～55)：(50～45)。

优选地，所述醋酸铵缓冲液中的醋酸铵的摩尔浓度为0.01～0.1mol/L。

进一步优选地，所述醋酸铵缓冲液中的醋酸铵的摩尔浓度为0.03～0.08mol/L。

优选地，所述醋酸铵缓冲液的pH为4.8～5.3。

进一步优选地，所述醋酸铵缓冲液的pH为4.9～5.2。

优选地，所述醋酸铵缓冲液还包括用于调节其pH的冰醋酸。

优选地，所述高效液相色谱仪中的色谱柱为氰基硅烷键合硅胶柱。

优选地，所述高效液相色谱仪的柱温为35～45℃。

进一步优选地，所述高效液相色谱仪的柱温为38～42℃。

优选地，所述高效液相色谱仪的检测器为紫外检测器，波长为235～245nm。

进一步优选地，所述波长为237～243nm。

优选地，所述高效液相色谱仪的流速为0.9～1.1ml/min。

进一步优选地，所述高效液相色谱仪的流速为0.95～1.05ml/min。

优选地，所述高效液相色谱仪的进样量为10～20μl。

优选地，所述杂质包括杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H以及杂质I中的一种或者多种；其中，

所述杂质A为

所述杂质B为

所述杂质C为

所述杂质D为

所述杂质E为

所述杂质F为

所述杂质G为

所述杂质H为

所述杂质I为

根据一些优选的实施方式，所述方法包括如下步骤：

(1)配置所述流动相A以及所述流动相B；

(2)称取苯磺酸氨氯地平对照品及阿托伐他汀钙对照品，用所述流动相A溶解稀释成对照品溶液，使用所述高效液相色谱仪对所述对照品溶液进行检测；

(3)称取所述苯磺酸氨氯地平与阿托伐他汀钙复方制剂作为供试品，使用所述流动相A 与所述供试品混合配制成供试品溶液，使用所述液相色谱仪对所述供试品溶液进行检测；

(4)按加校正因子的主成分外标法计算所述供试品中的各个杂质的含量。

优选地，单个所述杂质含量的计算公式为：

其中，M

P

D为对照品换算因子，其中氨氯地平与苯磺酸氨氯地平的换算因子为0.721，阿托伐他汀与阿托伐他汀钙的换算因子为0.9671；

A

N为对照品稀释倍数；

f为单个杂质校正因子，未知杂质按1计算，已知杂质校正因子按下表计算；

已知杂质校正因子列表

积平均值，计算其他杂质时，所述

W为所述供试品的用量，单片用量按规格计算，计算杂质A和杂质E时，所述W为所述氨氯地平规格，计算其它杂质时，所述W为所述阿托伐他汀规格；所述W的单位与所述 M

n为所述供试品稀释倍数。

优选地，所述杂质的总杂含量为各个杂质含量的总和，其计算公式为：

总杂含量％＝Sum∑IMP(％)。

优选地，控制所述对照品溶液中的苯磺酸氨氯地平的质量浓度为0.05～1mg/ml。

进一步优选地，控制所述对照品溶液中的苯磺酸氨氯地平的质量浓度为0.25～1mg/ml。

优选地，控制所述对照品溶液中的阿托伐他汀钙的质量浓度为0.1～2mg/ml。

进一步优选地，控制所述对照品溶液中的阿托伐他汀钙的质量浓度为0.5～2mg/ml。

优选地，控制所述供试品溶液中的供试品的质量浓度为1～20mg/ml。

进一步优选地，控制所述供试品溶液中的供试品的质量浓度为5～15mg/ml。

优选地，所述供试品溶液的配制方法包括称取所述供试品，加入所述流动相A振摇使所述供试品完全崩解，然后超声并振摇溶解，静置，待大部分辅料沉淀后，取上清液过滤，续滤液即为所述供试品溶液。

进一步优选地，控制所述振摇的时间为15～25min以使所述供试品完全崩解。

进一步优选地，控制所述超声的时间为1～3min。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

本发明的方法能够有效分离苯磺酸氨氯地平与阿托伐他汀钙复方制剂中的苯磺酸氨氯地平、阿托伐他汀钙及各个杂质，并且能够同时检测该复方制剂中的各个杂质，具有检测灵敏度高、精密度好、专属性强的优点。

附图说明

图1为实施例1中的混合对照溶液的液相色图谱；

图2为实施例1中的混合对照溶液与特定杂质A～杂质H定位叠加色图谱；

图3为实施例1中的混合对照溶液与特定杂质I定位叠加色图谱；

图4为实施例1中的供试品溶液的液相色谱图；

图5为实施例2中各破坏条件试验相关图谱叠加色谱图；

图6为实施例2中经高温破坏试验后的供试品溶液的液相色谱图。

具体实施方式

经研究，苯磺酸氨氯地平与阿托伐他汀钙复方制剂除了含有苯磺酸氨氯地平的特定杂质 (杂质A、杂质E)和阿托伐他汀钙的特定杂质(杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质G 和杂质H)，还含有其自身的特定杂质(杂质I)，共计9个杂质。各杂质的结构式如下表1 所示。

表1

而现有技术中的测定方法仅是分别对苯磺酸氨氯地平及其特定杂质或者阿托伐他汀钙及其特定杂质进行单独检测，并未有同时检测复方制剂中苯磺酸氨氯地平、阿托伐他汀钙及其特定杂质的方法，这也使复方制剂其自身的特定杂质I无法被检测出，不利于复方制剂的质量控制。

基于现有技术的不足，本申请人经过长期实验及大量研究，得到本申请的方案，下面针对本方案作进一步阐述。

一种检测苯磺酸氨氯地平与阿托伐他汀钙复方制剂有关物质的方法，使用高效液相色谱仪检测复方制剂中的苯磺酸氨氯地平、阿托伐他汀钙及杂质，高效液相色谱仪的梯度洗脱程序如下表2所示。

表2

根据本发明，流动相A和流动相B均为醋酸铵缓冲液与有机相的混合溶液，有机相包括乙腈和/或甲醇。流动相A中的醋酸铵缓冲液与有机相的体积比为(70～80)：(30～20)，例如可以为70:30、72:28、75:25、78:22、80:20等。流动相B中的醋酸铵缓冲液与有机相的体积比为(45～55)：(55～45)，例如可以为45:55、48:52、50:50、52:48、55:45等。

根据本发明，醋酸铵缓冲液中的醋酸铵的摩尔浓度为0.01～0.1mol/L，例如可以为 0.01mol/L、0.02mol/L、0.03mol/L、0.04mol/L、0.05mol/L、0.06mol/L、0.07mol/L、0.08mol/L、 0.09mol/L、0.1mol/L。

根据本发明，醋酸铵缓冲液的pH为4.8～5.3。醋酸铵缓冲液的pH可以通过添加冰醋酸来调节。

根据本发明，一种检测苯磺酸氨氯地平与阿托伐他汀钙复方制剂有关物质的方法包括如下步骤：

(1)配置流动相A以及流动相B；

(2)称取苯磺酸氨氯地平对照品及阿托伐他汀钙对照品，用流动相A溶解稀释成对照品溶液，使用高效液相色谱仪对对照品溶液进行检测；

(3)称取苯磺酸氨氯地平与阿托伐他汀钙复方制剂作为供试品，使用流动相A与供试品混合配制成供试品溶液，使用液相色谱仪对供试品溶液进行检测；

(4)按加校正因子的主成分外标法计算供试品中的各个杂质的含量。

根据本发明，上述方法还包括称取各个杂质分别置于不同的试剂瓶中，用甲醇或乙腈与各个杂质混合配置成不同的杂质贮备液，控制杂质贮备液中各个杂质的质量浓度为0.1～0.2mg/ml。

下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1

验证色谱条件的适用性，并确证苯磺酸氨氯地平与阿托伐他汀钙复方制剂中的特定杂质。

采用高效液相色谱法测定，其中，采用0.05mol/L醋酸铵缓冲液(用冰醋酸调节pH值至 5.0±0.05)-乙腈(醋酸铵缓冲液与乙腈的体积比为75∶25)为流动相A；0.05mol/L醋酸铵缓冲液(用冰醋酸调节pH值至5.0±0.05)-乙腈(醋酸铵缓冲液与乙腈的体积比为50∶50)为流动相B；洗脱程序如上表2所示；检测波长：240nm；流速：1.0ml/min；进样量： 20μl；柱温：40℃。

分别取各杂质(杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H以及杂质I)对照品及苯磺酸氨氯地平、阿托伐他汀钙适量，加流动相A配制成每1ml中约含氨氯地平0.5mg、阿托伐他汀1.0mg以及各杂质分别为8～20μg的混合溶液作为混合对照溶液。

分别取各杂质对照品适量，置不同量瓶中，加甲醇或乙腈(其中杂质A、杂质C、杂质E、杂质I对照品加甲醇，杂质B、杂质D、杂质F、杂质G、杂质H对照品加乙腈)配制成每 1ml中约含各杂质0.1～0.2mg的溶液，作为各杂质对照品贮备液，分别取适量各杂质对照品贮备液稀释，作为各杂质定位溶液。

精密称取苯磺酸氨氯地平与阿托伐他汀钙复方制剂5片，置于50ml量瓶中，加流动相A 振摇20min使供试品完全崩解，然后超声2min并振摇。冷却至室温，用流动相A定容。剧烈振摇，放置，待大部分辅料沉淀后，取上清液过滤，取续滤液(即为供试品溶液)测定。取苯磺酸氨氯地平原料、阿托伐他汀钙原料、辅料按上述方法配制溶液并同条件测定。

精密量取混合对照溶液、各杂质定位溶液以及供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见下表3，测定得到的色谱图见图1～4所示。

表3

结果显示，氨氯地平、阿托伐他汀与相邻杂质峰、各已知杂质峰之间均能有效分离。辅料样品在主峰及杂质峰位置均没有吸收峰出现，表明辅料对杂质含量的测定不会有影响。

实施例2

为验证色谱条件的可行性，对苯磺酸氨氯地平与阿托伐他汀钙复方制剂进行了酸破坏、碱破坏、氧化破坏、高温破坏及光照破坏试验。

(a)碱破坏：取苯磺酸氨氯地平与阿托伐他汀钙复方制剂5片，置于50ml量瓶中，加流动相A振摇约20min使供试品完全崩解，然后超声2min并振摇。冷却，向其中加1mol/L 氢氧化钠溶液5ml，放置6h后，加1mol/L盐酸中和，用流动相A定容。剧烈振摇，放置，待大部分辅料沉淀后，取上清液过滤，取续滤液，作为碱破坏供试品溶液。

(b)酸破坏：取苯磺酸氨氯地平与阿托伐他汀钙复方制剂5片，置于50ml量瓶中，加流动相A振摇约20min使供试品完全崩解，然后超声2min并振摇。冷却，向其中加1mol/L 盐酸溶液5ml，放置60min后，加1mol/L氢氧化钠中和，用流动相A定容。剧烈振摇，放置，待大部分辅料沉淀后，取上清液过滤，取续滤液，作为酸破坏供试品溶液。

(c)氧化破坏：取苯磺酸氨氯地平与阿托伐他汀钙复方制剂5片，置于50ml量瓶中，加流动相A振摇约20min使供试品完全崩解，然后超声2min并振摇。冷却，向其中加3％过氧化氢溶液5ml，放置5h后，用流动相A定容。振摇，放置，待大部分辅料沉淀后，取上清液过滤，取续滤液，作为氧化破坏供试品溶液。

(d)高温破坏(60℃)

(1)湿品：取苯磺酸氨氯地平与阿托伐他汀钙复方制剂5片，置于50ml量瓶中，加流动相A振摇约20min使供试品完全崩解，然后超声2min并振摇，放置60℃烘箱中24h后冷却至室温，用流动相A定容。振摇，放置，待大部分辅料沉淀后，取上清液过滤，取续滤液，作为高温破坏湿品供试品溶液。

(2)干品：取苯磺酸氨氯地平与阿托伐他汀钙复方制剂5片，置于50ml量瓶中，密封，放置60℃烘箱中24h后取出，按上述供试品溶液配制法配制溶液，作为高温破坏干品供试品溶液。

(f)光照破坏

(1)湿品：取苯磺酸氨氯地平与阿托伐他汀钙复方制剂5片，置于50ml量瓶中，加流动相A振摇约20min使供试品完全崩解，然后超声2min并振摇，密封，放置在照度4500lx±500lx 光照箱下24h后取出，用流动相A定容。振摇，放置，待大部分辅料沉淀后，取上清液过滤，取续滤液，作为光照破坏湿品供试品溶液。

(2)干品：取苯磺酸氨氯地平与阿托伐他汀钙复方制剂5片，置于50ml量瓶中，密封，放置在照度4500lx±500lx光照箱下24h后取出，按上述供试品溶液配制法配制溶液，作为光照破坏干品供试品溶液。

按照实施例1的测定方法精密量取上述各溶液进行测定。测定结果显示，苯磺酸氨氯地平与阿托伐他汀钙复方制剂经酸破坏、碱破坏、氧化破坏、及光照破坏试验后，杂质略增加 (各破坏条件试验相关图谱叠加见图5)；在高温(干品)破坏试验下(检测图谱见图6)，杂质I峰明显增加。各破坏产物峰与主峰完全分离，该色谱条件具有良好的选择性。

实施例3

标准曲线、定量限、检测限及回收率

(1)线性与范围

精密称取苯磺酸氨氯地平14mg、阿托伐他汀钙27.2mg、各特定杂质对照品5mg分别置于 25ml量瓶中，加流动相A溶解，稀释定容，摇匀，分别制成氨氯地平、阿托伐他汀以及各特定杂质贮备液。

分别精密量取上述各贮备液适量，用流动相A稀释成浓度范围为定量限～200％限度的不同浓度梯度的氨氯地平、阿托伐他汀、及各特定杂质溶液，分别用高效液相色谱仪检测(测试方法同实施例1)，以线性溶液浓度(μg/ml)为X轴，峰面积A为Y轴，作线性回归。

结果显示，线性回归方程的相关系数(r)均大于0.990，Y轴截距均在100％响应值的10％以内，响应因子(A/C)的相对标准差均小于10％线性良好，结果见表4。

表4

(2)杂质定量限与检测限

取各特定杂质标准品贮备液逐级稀释，以信噪比S/N≈10时的质量浓度为定量限(LOQ)，以S/N≈3时的质量浓度为检测限(LOD)。LOQ溶液连续进6针，LOD溶液连续进3针，结果见下表5。

表5

(3)杂质的回收率

分别称取12份苯磺酸氨氯地平与阿托伐他汀钙复方制剂于50ml量瓶中，精密移取各单杂贮备液(按各杂质的LOQ、各杂质拟定质量含量限度的50％、100％、150％四个浓度配制样品)，各平行三份，结果如表6～表9所示。因杂质H会转换成杂质G，所以该2个杂质的准确度按照两个杂质量的总和来计算。

表6回收率结果(杂质A、杂质B)

表7回收率结果(杂质C、杂质D)

表8回收率结果(杂质E、杂质F)

表9回收率结果(杂质G+杂质H、杂质I)

结果表明，该方法测得的各特定杂质均得到良好的回收率。

实施例4

为进一步验证色谱条件的适用性，并确证苯磺酸氨氯地平与阿托伐他汀钙复方制剂中的特定杂质的共有性，分别取不同规格的苯磺酸氨氯地平与阿托伐他汀钙复方制剂(按氨氯地平/阿托伐他汀计)，于60℃烘箱中放置30天，按照实施例1的测定方法进行测定。

杂质C、杂质D等各个杂质的含量均按照上述方法计算，总杂为各个杂质的总和，测定结果如表10所示。

表10不同规格苯磺酸氨氯地平与阿托伐他汀钙复方制剂杂质测定结果

结果显示，在氨氯地平与阿托伐他汀钙不同规格复方片均能检测出特定杂质，而且在高温破坏条件下，杂质量增加，进一步验证了色谱条件的适用性，该测试方法可有效控制复方制剂的质量。

以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。