检测流感病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域；具体地，涉及流感病毒的检测并分型。更具体地，涉及甲乙型流感病毒的检测并分型。

背景技术

急性上呼吸道感染是指鼻腔，咽或喉部急性炎症的概称。是呼吸道最常见的一种传染病。常见病因为病毒占80％，少数由细菌引起。患者不分年龄，性别，职业和地区。不仅具有较强的传染性，而且可引起严重并发症，应积极防治。流感首当其冲，每年有5％～10％的成年人、20％～30％的儿童罹患流感。造成流感的是流行性感冒病毒(influenzavirus)，简称流感病毒，是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒，人流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，是流行性感冒(流感)的病原体，其中，更为流行的是甲型流感和乙型流感。

流感与新冠感染者临床症状相似，存在较大鉴别困难，且临床上也经常与其他病原体引起的呼吸道感染混淆，因此在《流行性感冒诊疗方案》以及《新冠防控方案》中都明确提到要重视两种病毒的病原学鉴别，指导精准诊疗。

目前在实验室诊断手段中，更多仍然采用的是PCR检测法，但其原理均为针对核衣壳蛋白NP基因或者基质蛋白M基因分别设计检测甲型流感病毒的引物探针和乙型流感病毒的引物探针，设计复杂，试剂的配制繁琐，不利于大规模生产，并且，PCR扩增体系中每增加一对引物，形成引物二聚体的几率增加，不同引物探针之间的干扰会不同程度的增加，所有引物间相互影响就加大，这就势必影响到扩增的效果，从而影响整个检测体系的稳定性和准确性，引物的增加会导致成本的增加，与此同时，扩增体系引物探针较多，也有可能发生一个扩增片段抑制另一个扩增片段的情况，这就导致了扩增结果并不是均一的，从而也影响整个检测体系的稳定性和准确性。

因此，本领域需求一种引物对数少并能对甲乙型流感进行分型的组合物，并且其检测稳定性和准确性都较高，成本低。

发明内容

有鉴于此，第一方面，本发明提供了一种检测流感病毒并分型的组合物，其同时包括：

甲乙型流感病毒上游引物：5'-CCTGGRATGATGATGGG-3'(SEQ ID NO:1)；

甲乙型流感病毒下游引物：5'-GATTGSAGYCCATCCCA-3'(SEQ ID NO:2)；

甲型流感病毒探针：5'-TCGATACTGAATCTTGGACAAAAGAAAT-3'(SEQ ID NO:3)；以及

乙型流感病毒探针；5'-TGGGAGTAGCWGCACTAGGYATC-3'(SEQ ID NO:4)。

进一步地，所述组合物还包括：用于监控的内标上游引物、内标下游引物和内标探针。

使用本发明的组合物，无需多对引物分别扩增甲乙型流感，仅需一对引物即能同时检测甲乙型流感，成本低，其扩增更为均一，整个体系更为准确和稳定。

在一个具体的实施方案中，所述组合物还包括：如SEQ ID NO:5(5'-ATCCATGACAACTTTGGTATCGT-3')所示的人管家基因内标上游引物、如SEQ ID NO:6(5'-GGGCCATCCACAGTCTTCT-3')所示的人管家基因内标下游引物，和如SEQ ID NO:7(5'-AAGGACTCATGACCACAGTCCATGCC-3')所示的人管家基因内标探针。

进一步地，甲型流感、乙型流感以及内标的探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。

在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。

在一个具体的实施方案中，甲型流感探针标记为FAM通道，乙型流感探针标记为HEX通道。

在一个具体的实施方案中，内标探针标记为CY5通道。

进一步地，探针的3’末端还具有猝灭基团，例如BHQ1或BHQ2。

在一个具体的实施方案中，探针的3’末端为BHQ1。

进一步地，所述组合物中引物的用量为0.1～0.6μM，优选为0.4μM；所述组合物中探针的用量为0.05～0.5μM，优选为0.2μM。

在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分分别存在于单独包装中。

进一步地，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。

在一些具体的实施方案中，本发明组合物还可以包括检测其余病毒的引物和探针。

在一些具体的实施方案中，本发明组合物还可以包括检测鼻病毒的引物和探针。

在一个具体的实施方案中，本发明包括鼻病毒引物和探针序列，其上游引物SEQID NO:8：5'-TGACAAGGTGCGAAGAG-3'；下游引物SEQ ID NO:9：5'-CAAAGTAGTTGGTCCCATCC-3'，探针SEQ ID NO:10：5'-CTCCGGCTCCTGAATG TGGCTAAC-3'。

使用本发明的组合物，由于获得了更好的扩增均一性，因此，能够更好的兼容其余病毒检测体系。

第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测流感病毒并分型的试剂盒中的用途。

第三方面，本发明提供了一种检测流感病毒并分型的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。

进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。

在一个具体的实施方案中，阴性质控品是DEPC H2O、生理盐水、内参基因假病毒中的至少一种。阳性质控品是含流感病毒靶基因及内参基因目的片段质粒、片段RNA、假病毒中的至少一种。

进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放体系和核酸扩增体系。

进一步地，所述试剂盒还包括dNTP、PCR缓冲液以及Mg

更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、核酸提取试剂、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶以及DNA聚合酶中的至少一种。

更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dNTP、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg

进一步地，所述逆转录酶的浓度为5U/反应～15U/反应，例如逆转录酶可以是鼠白血病逆转录酶(MMLV)、Neoscript RT逆转录酶或者Tth酶；所述DNA聚合酶的浓度为3U/反应～15U/反应，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。

在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括：反/逆转录酶、Taq酶、尿嘧啶糖基化酶、Mg

常见的PCR缓冲液由Tris-HCl、MgCl

在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒可以兼容数字PCR扩增体系，即可以直接用于数字PCR仪上进行扩增。

第四方面，提供了一种用于检测流感病毒并分型的方法，所述方法包括以下步骤：

1)提取或释放待测样本的核酸；

2)使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR分析；

3)获得并分析结果。

在本发明中，用于检测的样本可以是咽拭子、口咽拭子、鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液等，但不限于此。

进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：

逆转录，温度为50℃～60℃，时间5～30分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间1～10分钟，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～30秒，退火，温度为55～60℃，时间为20～60秒，40～50次循环，采集荧光。

在一个具体的实施方案中，所述荧光定量PCR的反应条件为：逆转录，温度为50℃，时间10分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间1分钟，1次循环；变性，温度为95℃，时间为10秒，退火，温度为60℃，时间为30秒，45次循环，采集荧光。

在一个具体的实施方案中，提供了一种用于以非诊断目的检测流感病毒并分型的方法，所述方法包括以下步骤：

1)提取或释放待测样本的核酸；

2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR分析；

3)获得并分析结果。

进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：

逆转录，温度为50℃～60℃，时间5～30分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间1～10分钟，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～30秒，退火，温度为55～60℃，时间为20～60秒，40～50次循环，采集荧光。

在一个具体的实施方案中，所述荧光定量PCR的反应条件为：逆转录，温度为50℃，时间10分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间1分钟，1次循环；变性，温度为95℃，时间为10秒，退火，温度为60℃，时间为30秒，45次循环，采集荧光。

在本文中，术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染流感病毒并罹患流感的信息。例如，该方法可以在以科研为目的的实验中的检测培养物中检测是否有流感病毒。

附图说明

图1为本发明组合物检测结果图；

图2～3为本发明组合物灵敏度检测结果图；

图4为本发明组合物特异性检测结果图；

图5～6为本发明组合物兼容性检测结果对比图；

图7为本发明组合物检测结果图；

图8为对比方法1的组合物检测结果图；

图9为对比方法2的组合物检测结果图。

具体实施方式

下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

实施例1、本发明所使用的引物及探针

本发明所使用的引物及探针如下表1所示：

表1

实施例2、检测流感病毒并分型的方法

试剂准备：

根据待测样本、阳性对照、阴性对照的数量，按比例(PCR反应液36.0μL/人份+酶混合液4.0μL/人份)取相应量的PCR反应液和酶混合液，充分混匀成PCR混合液，2000rpm离心10s后备用。

样本处理与加样：

取200μL待测样本、阴性对照、阳性对照到1.5mL离心管中，进行核酸提取。

吸取上述处理好的样本、阴性对照及阳性对照各10μL分别加入对应的0.2mL PCR反应管中，每管加入40μL PCR混合液，盖上管盖。

PCR扩增：

在ABI 7500荧光定量PCR仪、Life Technologies Quant Studio

检验结果的解释：

如果该样本FAM、HEX通道有明显S型扩增曲线，且Ct值≤40，则判为阳性；如果该样本FAM、HEX通道无扩增曲线(No Ct)或Ct值＞40，且CY5内标通道为阳性(Ct值≤40)，则判为阴性。具体如下：

实施例3、本发明组合物测试阳性对照的检测结果

使用本发明表1的组合物，按照实施例2所述的方法，对各个靶标阳性质粒进行检测，以模拟临床样本，在宏石荧光定量PCR仪器上进行多重PCR检测，结果如图1所示。各通道均能检测到良好的扩增曲线，表明本发明的组合物能对引起呼吸道感染的病毒进行检测并分型。

实施例4、本发明组合物的灵敏度

用不同浓度的质粒模板进行实验，检测本发明组合物的灵敏度

使用本发明表1的组合物，按照实施例2所述的方法，对各个靶标LOD(灵敏度)阳性质粒进行检测，以模拟临床样本，在ABI7500荧光定量PCR仪器上进行多重PCR检测，各通道检测灵敏度为200拷贝/ml，结果表明在浓度为200拷贝/ml，本发明的组合物仍能够检测出病毒，结果如图2～3所示，说明本发明的组合物的灵敏度能够达到200拷贝/ml。

实施例5、本发明组合物的特异性

采用一些相似的其它病毒进行实验，表明本发明的组合物不会检测出其它病毒而出现假阳性，结果如图4所示，本发明组合物对常见呼吸道病原体(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、偏肺病毒、鼻病毒、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A型、冠状病毒229E、呼吸道合胞病毒、腺病毒、人副流感1型、人副流感2型、人副流感3型病毒、百日咳杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、流感嗜血杆菌、唾液链球菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌、肺炎克雷伯菌等)，均无非特异扩增，表明本发明组合物有良好的特异性。

实施例6、本发明组合物兼容其余病毒的实验

本发明中的组合物由于引物探针少，除本身具有干扰性小的优势外，还具有一定的兼容性和扩展性。将检测鼻病毒的引物探针(其中引物和探针的浓度分别为0.4μM和0.2μM，其序列分别如SEQ ID NO:8～10所示)加入到本发明组合物中来，对比发现无明显干扰。同样浓度的检测鼻病毒的引物探针加入到常规、非本发明的，分别以甲乙型流感病毒基因保守序列为检测靶标的扩增体系中，对比发现存在明显的干扰，结果如图5～6所示。

对比例1

对比方法1(一对引物扩增)：

设计的如下引物探针：

FluA+B-F2：5'-GGGAATAAACATGAGCAAAAAGA-3'(SEQ ID NO:11)

FluA+B-R2：5'-CATTGTTWATCATRTTGTTCTTTA-3'(SEQ ID NO:12)

FluA-P2：5'-ATGGATTTGTGGCTAATTTTAGCATGGAGC-3'(SEQ ID NO:13)

FluB-P2：5'-ATGGATTTGTATCTAACTTTGCAATGGAAATTC-3'(SEQ ID NO:14)

对比方法2(两对引物分别扩增)：

针对核衣壳蛋白NP基因或者基质蛋白M基因分别设计检测甲型流感病毒的引物探针和乙型流感病毒的引物探针(如下所示)：

检测甲型流感病毒引物：

A-F1：5'-GGTTATAAGAATGATGGAAAGTGC-3'(SEQ ID NO:15)；

A-R1：5'-TCTGCATTGTCTCCGAAGAAAT-3'(SEQ ID NO:16)；

A-P1：5'-AGTTTTCGAGCTCTCAGACGAGA-3'(SEQ ID NO:17)；

检测乙型流感病毒引物：

B-F3：5'-ATGGCTCTTTACAATATGGCAA-3'(SEQ ID NO:18)；

B-R3：5'-CTCTCAGGTCTTCATAGGCA-3'(SEQ ID NO:19)；

B-P3：5'-CCGAAGCAAGACATGAAGAATAAT-3'(SEQ ID NO:20)；

上述引物探针配制成同时检测甲乙型流感病毒的PCR反应液，与本发明提供的检测组合物，测试同一份核酸，进行对比测试，结果如下(如下表2和图7至图9显示)：

表2

结果表明，本发明组合物检测的效果优于对比组合物。进一步说明本发明采用同样的引物对甲型流感病毒或乙型流感病毒进行扩增，保证了对两种病毒检测的均一性；无过多引物加入，减少了引物之间的干扰，保证了检测的灵敏度。