一种固定化酶薄膜电极、其制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及薄膜电极制备技术领域，尤其涉及一种固定化酶薄膜电极、其制备方法及其应用。

背景技术

大量温室气体，特别是CO

在自然界中，甲酸脱氢酶(FDH)是一种在辅酶因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)协同下可以催化甲酸脱氢生成CO

紫精类衍生物是一种常见具有氧化还原性物质，由于其具有良好的显色效率、循环寿命、对比度等优点，被广泛应用于信息加密、防伪等领域。研究者们发现，当使用紫精类衍生物的自由基阳离子形态(V

在这方面，Jayathilake等(Acc.Chem.Res.2019,52,676，以下简称文献1)公开了使用人工辅酶因子甲基紫精(MV)催化甲酸脱氢酶(FDH)电化学还原CO

Szczesny等(ACS Energy Lett.2020,5,321-327，以下简称文献2)公开了一种能够进行CO

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于CO

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案。

本发明首先提供了一种固定化酶薄膜电极，包括：

电极，及

覆盖于所述电极表面的固定化酶薄膜，其中，所述固定化酶薄膜包括：N-芴甲氧基羰基二苯丙氨酸薄膜及分散固定于所述N-芴甲氧基羰基二苯丙氨酸薄膜中的甲酸脱氢酶和二烯丙基紫精。

在本发明的一些实施方式中，所述二烯丙基紫精和甲酸脱氢酶的质量比为1：(0.5-1.5)，优选为1：(1-1.2)。

在本发明的一些实施方式中，在所述固定化酶薄膜中，所述二烯丙基紫精的负载量为5×10

所述甲酸脱氢酶的负载量为0.1-0.4mg/cm

在本发明的一些实施方式中，所述电极选自ITO电极、FTO电极、玻碳电极、金电极、碳电极或碳布电极。

本发明还提供了前述的固定化酶薄膜电极的制备方法，包括：

获得含有N-芴甲氧基羰基二苯丙氨酸的第一准备液，

获得含有甲酸脱氢酶和二烯丙基紫精的第二准备液，

将第一准备液与第二准备液混合，静置后得到预凝胶，

将所述预凝胶涂覆在所述电极上，静置后得到所述固定化酶薄膜电极。

在本发明的一些实施方式中，在所述预凝胶中，所述二烯丙基紫精与甲酸脱氢酶的质量比为1：(1-1.5)，优选为1：(1-1.2)。

在本发明的一些实施方式中，在所述预凝胶中，N-芴甲氧基羰基二苯丙氨酸与甲酸脱氢酶的质量比为1：(2-3)。

在本发明的一些实施方式中，所述第二准备液由以下方法制得：

在pH 7-8的第一缓冲溶液中加入甲酸脱氢酶和二硫苏糖醇混合孵育，之后加入DAV二烯丙基紫精得到第二准备液，优选地，所述第一缓冲溶液选自磷酸缓冲溶液(PBS)、HEPES缓冲溶液、Tris缓冲溶液、Britton-Robinson缓冲溶液。

本发明还提供了前述的固定化酶薄膜电极在还原CO

在本发明的一些实施方式中，将所述固定化酶薄膜电极置于第二缓冲溶液中在相对于SCE为-0.8V的工作电压下还原CO

优选地，所述第二缓冲溶液为含有NaHCO

有益效果

本发明提供的固定化酶薄膜电极，以N-芴甲氧基羰基二苯丙氨酸(Fmoc-FF)作为凝胶因子形成凝胶薄膜，将人工辅酶因子二烯丙基紫精(DAV)和甲酸脱氢酶(FDH)分散固定在薄膜中，在电极表面一步自组装得到具有固定化酶的分子凝胶薄膜。本发明提供的固定化酶薄膜电极不仅能够高效地电催化还原CO

此外，本发明将天然FDH酶和二烯丙基紫精共同固定在薄膜相中，通过固定化酶提高催化剂稳定性，同时实现了产品的重复利用，有利地降低了CO

附图说明

图1示出了各材料的傅里叶变换红外光谱图，其中，(a)代表Fmoc-FF粉末,(b)代表Fmoc-FF薄膜，(c)代表FDH粉末,(d)代表Fmoc-FF/FDH薄膜,(e)代表DAV粉末，(f)代表Fmoc-FF/DAV薄膜，(g)代表实施例1制备的Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜ITO电极；

图2示出了在pH 6.0缓冲溶液中进行的循环伏安曲线(扫速0.1V/s)，其中，(a)代表Fmoc-FF/FDH薄膜电极，(b)代表裸电极(存在于含有20mM DAV的溶液中)，(c)代表实施例1制备的Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜ITO电极；

图3示出了DAV在不同氧化还原状态之间转换的示意图；

图4示出了对比例4制备的Fmoc-FF/MV/FDH薄膜玻碳电极(a)和实施例2制备的Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜玻碳电极(b)在pH 6.0缓冲溶液中的循环伏安曲线(扫速5mV/s)；

图5A示出了实施例1制备的Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜ITO电极的CV曲线(5mV/s，pH6.0的PBS，100mM NaHCO

图5B为计时电流曲线：在-0.8V恒电压下以气体扩散模式检测(黑色箭头表示鼓入CO

图6A示出了实施例3制备的Fmoc-FF/DAV/FDH碳布电极的CV曲线(5mV/s，pH 6.0的PBS，100mM NaHCO

图6B为计时电流曲线：在-0.8V恒电压下以气体扩散模式检测(黑色箭头表示鼓入CO

图7示出了实施例3制备的Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极在pH 6.0的PBS中的线性扫描伏安(LSV)曲线(扫速50mV/s)，其中，(a)代表N

图8A示出了实施例3制备的Fmoc-FF/DAV/FDH碳布电极在不同电压下的安培法曲线(CO

图8B示出了实施例3制备的Fmoc-FF/DAV/FDH碳布电极的电流信号I的电压依赖性(CO

图9示出了以下物质的离子色谱图：(a)pH 6.0的PBS(CO

具体实施方式

为了对本发明的技术方案、目的和效果有更清楚的理解，现结合附图说明本发明的具体实施方式。

需要说明的是，以下实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜ITO电极的制备

本实施例在ITO电极(0.8×3.3cm

(1)首先，将ITO电极依次在含有3.95％ KOH的乙醇溶液、乙醇、水中超声清洗各5min，吹干备用。

(2)将Fmoc-FF粉末超声溶解在DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中，得到Fmoc-FF浓度为30mg/mL的第一储备液。

(3)在pH 7.4的HEPES缓冲溶液中加入FDH和二硫苏糖醇(DTT)混合孵育10min，之后加入DAV得到第二储备液，其中，FDH、DTT、DAV的终浓度分别为11.2mg/mL、100mM、10mg/mL。

(4)用移液枪吸取V

(5)将40μL预凝胶滴涂在ITO电极表面，在4℃放置过夜，在ITO电极表面形成Fmoc-FF薄膜，该薄膜中分散固定有FDH和DAV，从而得到固定化酶薄膜电极，称为Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜ITO电极。

实施例2Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜玻碳电极的制备

将实施例1中的ITO电极替换为玻碳电极(GCE，d＝3mm)，采用与实施例1相同的方法在玻碳电极表面形成分散固定有FDH和DAV的Fmoc-FF薄膜，从而得到固定化酶薄膜电极，称为Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜玻碳电极。

实施例3Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极的制备

将实施例1中的ITO电极替换为碳布(CC，几何面积为0.8×4.0cm

对于本实施例所制备的Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极，其中，DAV的负载量为9.1×10

在本文中，术语“DAV的负载量”是指在工作电极的单位面积上固定的DAV的物质的量；“FDH的负载量”指在工作电极的单位面积上固定的FDH的质量。

实施例4Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜ITO电极的制备

实施例4与实施例1的区别在于在步骤(3)所制备的第二储备液中，FDH、DTT、DAV的终浓度分别为5mg/mL、100mM、10mg/mL。

实施例5Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜ITO电极的制备

实施例5与实施例1的区别在于在步骤(3)所制备的第二储备液中，FDH、DTT、DAV的终浓度分别为15mg/mL、100mM、10mg/mL。

对比例1Fmoc-FF薄膜ITO电极的制备

首先，按照实施例1的步骤(1)和(2)准备ITO电极和第一储备液。

然后，用移液枪吸取V

将40μL预凝胶滴涂在ITO电极表面，在4℃放置过夜，在ITO电极表面形成Fmoc-FF薄膜，从而得到Fmoc-FF薄膜电极。

对比例2Fmoc-FF/FDH薄膜ITO电极的制备

首先，按照实施例1的步骤(1)和(2)准备ITO电极和第一储备液。

然后在pH 7.4的HEPES缓冲溶液中加入11.2mg/mL的FDH和100mM的二硫苏糖醇(DTT)混合孵育10min得到第二储备液。

按照实施例1的步骤(4)和(5)制备预凝胶并将其滴涂在ITO电极表面，在ITO电极表面形成分散固定有FDH的Fmoc-FF薄膜，从而得到Fmoc-FF/FDH薄膜电极。

对比例3Fmoc-FF/DAV薄膜ITO电极的制备

首先，按照实施例1的步骤(1)和(2)准备ITO电极和第一储备液。

然后在pH 7.4的HEPES缓冲溶液中加入DAV(10mg/mL)得到第二储备液。

按照实施例1的步骤(4)和(5)制备预凝胶并将其滴涂在ITO电极表面，在ITO电极表面形成分散固定有DAV的Fmoc-FF薄膜，从而得到Fmoc-FF/DAV薄膜电极。

对比例4Fmoc-FF/MV/FDH薄膜玻碳电极的制备

如前所述，Jayathilake等使用甲基紫精(MV)作为人工辅因子(媒介体)辅助FDH进行CO

本对比例在此采用实施例1的制备方法，仅将ITO电极替换为玻碳电极，并将DAV等物质的量浓度替换为MV，制备出Fmoc-FF/MV/FDH薄膜玻碳电极。

对比例5Fmoc-FF/FDH薄膜碳布电极的制备

将实对比例2中的ITO电极替换为碳布(CC，几何面积为0.8×4.0cm2)电极，采用与对比例2相同的方法制备出Fmoc-FF/FDH薄膜碳布电极。

上述实施例及对比例所制备的电极在使用之前均先用去离子水洗去表面可溶的试剂。

固定化酶薄膜电极的表征与分析

使用傅里叶变换红外光谱(FTIR)表征实施例1中的Fmoc-FF/DAV/FDH分子凝胶薄膜的成功制备。如图1所示，在DAV粉末样品的红外吸收光谱(图1中的曲线e)中，可以观察到DAV的吡啶环在1600-1430cm

采用CH Instruments公司CHI 660A型电化学工作站进行循环伏安(CV)实验，进一步证明固定化酶薄膜电极的成功制备。测试均在在典型的三电极体系进行，其中实施例或对比例制备的薄膜电极、裸ITO电极和Fmoc-FF薄膜电极分别用作工作电极，将饱和甘汞电极(SCE)用作参比电极，铂片电极用作对电极。检测结果如下。

将实施例1制备的Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜ITO电极放入pH 6.0的磷酸缓冲溶液PBS中，可以在-0.6V附近看到一对可逆的CV峰(图2中曲线c)，与裸ITO电极在含有20mM DAV的pH 6.0溶液中的峰位置非常接近(图2中曲线b)，符合DAV

此外，将实施例2和对比例4制备的薄膜玻碳电极进行对比，结果如图4所示。从图4中可以看出，实施例2制备的Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜玻碳电极的还原电位为-0.62V，对比例4制备的Fmoc-FF/MV/FDH薄膜玻碳电极的还原电位-0.70V，相比于后者，前者的还原电位更正。换言之，含有DAV的电极可以在相比于含有MV的电极更高的电位下进行CO

为了使CO

2DAV

FDH(Ox)+2DAV

FDH(Red)+H

首先，薄膜中的DAV

之后在恒电压-0.8V条件下进行了计时电流测试，当向含有100mMNaHCO

进一步地，对实施例3制备的Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极的催化还原效率进行考察。具体地，将ITO电极更换为碳布电极(浸入面积为0.8×2cm

用线性扫描伏安法(LSV)评估实施例3制备的Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极的电催化还原CO

首先，在N

在不同电压下对实施例3制备的Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极进行安培法测试，Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极的还原电位为-0.65V，将其设置为起始电压，之后逐渐增加电压到-1.2V，还原电流随着电压的增加逐渐增加。可以观察到在-0.8V恒电压下，Fmoc-FF/DAV/FDH碳布电极的还原电流相较于-0.65V恒电压下产生了显著提升(图8A、图8B)，这意味着在-0.8V条件下电催化CO

之后，在CO

表1

可见，本发明将人工辅酶因子(DAV)和酶(FDH)共同固定到Fmoc-FF薄膜内，可以获得很高的CO

在前述的文献1中，其公开的使用MV在液相中作为人工辅酶因子时的法拉第效率61％，略高于本法的薄膜电极。

但是，需要说明的是，在实施例3中，Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极上的DAV负载量为9.1×10

而对于文献1公开的技术方案中，液相体系中MV的浓度4.0×10

由此可见，本发明提供的Fmoc-FF/DAV/FDH薄膜碳布电极在DAV和FDH的使用量基本上比文献1中的MV和FDH的使用量低两个数量级的情况下，还能取得仅比文献1略少的法拉第效率，这实际上表明本发明将人工辅酶因子DAV和酶FDH共同固定到薄膜内的实际催化效率要远高于文献1的催化效率。

在文献2中，如前所述，其合成紫精聚合物：1-(3-氨丙基)-1'-甲基-4,4'联吡啶(vio)修饰聚(4-苯乙烯磺酸酯-共-甲基丙烯酸缩水甘油酯-共-丙烯酸丁酯)(P(SS-GMA-BA)-vio)，并与钨依赖的甲酸脱氢酶(DvH-W-FDH)共同固定到碳布电极表面，进行CO

表2.不同时间下电流密度对比

虽然文献2经过进一步改性后，其催化电流密度有了显著的提升(参见文献2的Figure.3(b))，但其工艺中涉及多种材料的合成和改性、在具有气体扩散层的碳布电极大孔侧和微孔侧分别修饰了三层功能性材料，即共修饰了4层含有vio人工辅酶的聚合物和两层含有酶FDH的聚合物薄膜，不仅合成繁琐，薄膜修饰操作步骤也复杂且时间冗长。

此外，文献2中紫精类物质的负载量为1.3×10

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域中的技术人员来说，本发明可以有各种修改和变化。凡在本发明的主旨和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。