生物组织形成装置及生物组织的形成方法

技术领域

本发明涉及一种细胞培养技术，尤其涉及通过培养细胞来形成生物组织的装置及生物组织的形成方法。

背景技术

以往，在医药品的开发等中，对于研发新药候选物质，如果在临床前研究之前无法预测人体药代动力学而在临床研究中判明其毒性，中止开发，则存在到目前为止的研究开发费用被浪费的问题。

即，在临床前研究中，进行了细胞测定和动物实验等，但细胞测定中不能再现体内的血流等，细胞特异性功能的表达不充分，存在无法评价药代动力学的问题。

另外，在动物实验中，由于种属差异，人体药代动力学与动物药代动力学的结果未必一致，因此，存在难以预测人体药代动力学的问题。

在这种情况下，近年来，期待器官芯片能够消除这些问题，并提高人体药代动力学的预测精度。

器官芯片是在微流体设备中再现器官的组织结构，已经提出了，对肺的结构进行建模的肺芯片、结合小肠模型和肝脏模型对肝肠循环结构进行建模的芯片、以及对肾脏的结构，例如肾小球模型和近曲小管模型进行建模的芯片等。

这里，在使用培养皿等的传统体外(in vitro)培养系统中，培养环境是准静态的，没有血流的再现，并且氧气和营养物质的提供以及废物的清除仅依赖于扩散，所以很难进行考虑细胞特异性功能和器官间相互作用的试验。

与此相对，根据器官芯片，通过泵送液来进行血流的再现，并且可以通过流速来改变氧气和营养物质的提供等，这使得以适当的方式进行包括细胞特异性功能和器官间相互作用的试验成为可能。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2017-504320号公报

发明内容

发明要解决的技术问题

在这样的器官芯片中，具备被膜划分为两个的流路，在膜的两表面进行细胞的培养，夹着膜形成两个细胞层。膜使用半透膜，通过半透膜的孔在两个细胞层间进行营养物质和盐类等液体成分的交换。

然而，当半透膜的孔径为细胞无法通过的大小时，存在妨碍细胞层间的细胞之间的接触、细胞层间相互作用降低的问题，以及随着通过细胞培养形成细胞层，存在孔容易被堵塞、液体成分的交换效率降低的问题。

因此，本发明的发明人进行了深入研究并开发了一种器官芯片(生物组织形成装置)，能够高效率地进行所形成的生物组织的细胞层间的细胞间相互作用和液体成分的交换。

具体而言，首先使用易溶性材料作为器官芯片的膜，在该膜的两表面形成细胞层后，通过溶解膜，可以防止两个细胞层间的细胞间相互作用和液体成分交换效率的降低。

但是，由易溶性材料构成的膜在其两表面形成细胞层时作为细胞的支架材料发挥作用，在溶解易溶性材料后，由于该支架消失，有时所形成的细胞层容易损伤。

因此，本发明的发明人进一步使膜由易溶性材料和难溶性材料构成，在溶解易溶性材料后，使难溶性材料作为细胞层的支撑体发挥作用，从而使易溶性材料溶解后也难以损坏细胞层。

这里，专利文献1公开了一种肺芯片，记载了可以使用生物相容性聚合物作为该肺芯片中的膜(权利要求53)。还记载了，生物相容性聚合物是，当植入目标生物组织中或置于其附近时，不会明显劣化，不会随着时间的推移诱发显著的免疫应答或不良组织反应(例如，毒性反应或显著的疼痛)，或与血液接触时，不会诱发血栓或凝血的任意材料(第0055段)，以及，生物相容性和生物降解性材料可用于本设备以促进本设备的体内植入(第0316段)。

但是，在这种肺芯片中，关于溶解膜的构成没有记载也没有启示。另外，对于膜溶解后难以损坏细胞层的构成也没有任何公开。

本发明是鉴于上述情况而完成的，其目的在于提供一种生物组织形成装置及生物组织的形成方法，能够高效率地进行所形成的生物组织的细胞层间的细胞间相互作用和液体成分的交换，并且能够使细胞层难以被损坏。

解决课题的技术手段

为了实现上述目的，本发明的生物组织形成装置是形成具有由黏附细胞构成的多个细胞层的生物组织的生物组织形成装置，构成为具备：培养膜，在两面具备所述黏附细胞的培养区域，培养所述黏附细胞后置于所述多个细胞层之间，多个流路，由所述培养膜划分；所述培养膜由易溶性材料构成。

另外，本发明的生物组织形成装置的其他实施方式是形成具有由黏附细胞构成的多个细胞层的生物组织的生物组织形成装置，构成为具备：培养膜，在两面具备黏附细胞的培养区域，培养所述黏附细胞后置于所述多个细胞层之间，多个流路，由所述培养膜划分；所述培养膜由易溶性材料和难溶性材料构成。

还优选将本发明的生物组织形成装置构成为，通过溶解所述培养膜中的所述易溶性材料，形成贯通所述培养膜的孔。

另外，还优选将本发明的生物组织形成装置构成为，由所述难溶性材料构成的多孔膜的孔径为直径10微米以上。

进一步，还优选将本发明的生物组织形成装置构成为，所述易溶性材料和所述难溶性材料在培养所述黏附细胞时被用作支架。

另外，还优选将本发明的生物组织形成装置构成为，所述难溶性材料在所述培养膜中的所述易溶性材料溶解后被用作所述细胞层的支撑体。

进一步，还优选将本发明的生物组织形成装置构成为，所述难溶性材料由聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乳酸、或紫外线固化树脂中的任一种构成。

另外，还优选将本发明的生物组织形成装置构成为，所述培养膜为多孔膜。

另外，还优选将本发明的生物组织形成装置构成为，具备一个所述培养膜，同时具备由该培养膜划分的两个流路，从而形成具有两个细胞层的生物组织。

进一步，还优选将本发明的生物组织形成装置构成为，所述两个流路由具备流路的两张板的流路侧的每一面分别黏附在所述培养膜的两面而形成。

另外，还优选将本发明的生物组织形成装置构成为，在所述两个流路中分别形成由不同种类的黏附细胞构成的细胞层。

进一步，还优选将本发明的生物组织形成装置构成为，所述易溶性材料由水溶性聚合物构成。

另外，还优选将本发明的生物组织形成装置构成为，所述水溶性聚合物为聚乙烯醇、海藻酸或甲基纤维素。

另外，本发明的生物组织的形成方法是具有由黏附细胞构成的多个细胞层的生物组织的形成方法，具有：向生物组织形成装置中的所述两个流路提供黏附细胞和培养液的工序，所述生物组织形成装置具备：培养膜，在两面具备黏附细胞的培养区域，培养所述黏附细胞后置于所述多个细胞层之间，两个流路，由所述培养膜划分，所述培养膜由易溶性材料构成；在所述两个流路中培养所述黏附细胞，在所述培养膜的两面形成细胞层的工序；以及溶解所述培养膜的工序。

另外，本发明的生物组织的形成方法的其他实施方式是具有由黏附细胞构成的多个细胞层的生物组织的形成方法，具有：向生物组织形成装置中的所述两个流路提供黏附细胞和培养液的工序，所述生物组织形成装置具备：培养膜，在两面具备黏附细胞的培养区域，培养所述黏附细胞后置于所述多个细胞层之间，两个流路，由所述培养膜划分，所述培养膜由易溶性材料和难溶性材料构成；在所述两个流路中培养所述黏附细胞，在所述培养膜的两面形成细胞层的工序；以及溶解所述培养膜中的易溶性材料的工序。

另外，还优选使本发明的生物组织的形成方法构成为：所述易溶性材料为海藻酸，在所述溶解工序中，向所述两个流路中的至少任一个提供海藻酸降解酶，以溶解所述培养膜中的易溶性材料的方法。

进一步，还优选使本发明的生物组织的形成方法构成为：所述易溶性材料为聚乙烯醇，在所述溶解工序中，对生物组织形成装置进行加热，以溶解所述培养膜中的易溶性材料的方法。

另外，还优选使本发明的生物组织的形成方法构成为：所述易溶性材料为甲基纤维素，在所述溶解工序中，冷却生物组织形成装置，以溶解所述培养膜中的易溶性材料的方法。

发明效果

根据本发明，能够提供一种生物组织形成装置及生物组织的形成方法，能够高效率地进行所形成的生物组织的细胞层间的细胞间相互作用和液体成分的交换，并且能够使细胞层难以被损坏。

附图说明

图1是表示根据本发明的各实施方式的生物组织形成装置的构成部件的示意图。

图2是表示根据本发明的各实施方式的生物组织形成装置的构成的示意图。

图3是表示根据本发明的各实施方式的生物组织形成装置的A-A截面的示意图。

图4是表示利用根据本发明的第一实施方式的生物组织形成装置形成细胞层的工序的示意图。

图5是表示根据本发明的第二实施方式的生物组织形成装置中的培养膜的制造工序的示意图。

图6是表示利用根据本实施方式的第二实施方式的生物组织形成装置形成细胞层的工序的示意图。

图7是表示利用传统的生物组织形成装置形成细胞层的工序的示意图。

图8是表示为了确认在根据本发明的第一实施方式的生物组织形成装置中使用的易溶性材料的溶解而进行的实验的结果的图。

具体实施方式

下面，对本发明的生物组织形成装置及生物组织的形成方法的实施方式进行详细说明。但是，本发明不限于以下实施方式的具体内容。

[第一实施方式]

首先，对根据本发明的第一实施方式的生物组织形成装置进行说明。

本实施方式的生物组织形成装置是用于形成具有由黏附细胞构成的多个细胞层的生物组织的装置，可以构成为所谓的器官芯片等。

器官芯片是采用微流体设备在该设备内再现器官的组织结构，可以精确控制细胞的培养环境。因此，具有使细胞表达出接近体内的细胞功能的优点。

另外，本实施方式的生物组织形成装置，其特征在于，具备：培养膜，在两面具备黏附细胞的培养区域，培养黏附细胞后置于多个细胞层之间，多个流路，由培养膜划分；培养膜由易溶性材料构成。

例如，如图1～3所示，本实施方式的生物组织形成装置1可以通过将具有用于培养黏附细胞的表面的培养膜10置于流路板11和流路板13之间，并通过黏附层12、14将它们黏附成一体来制造。需要说明的是，在生物组织形成装置1中，通过进一步具备培养膜和黏附层，也可以构成为能够形成3层以上的细胞层。

在流路板11上具备流路110，同时在流路板13上具备流路130，这两张板的流路侧的每一面分别通过黏附层黏附在培养膜10的两面上，由此在生物组织形成装置1中，形成由培养膜10划分的两个流路。这些流路作为培养室使用。

并且，利用这些流路在培养膜10的两面分别形成细胞层，在生物组织形成装置1中形成具有两个细胞层的生物组织。

这两个细胞层可以由相同种类的黏附细胞构成，也可以分别由不同种类的黏附细胞构成，尤其是由不同种类的黏附细胞构成是有利的。

在本实施方式的生物组织形成装置1中，培养膜10由易溶性材料101构成。该培养膜10可以是多孔膜也可以是非多孔膜，但优选是具备在易溶性材料101溶解之前细胞不能通过的孔径的多孔膜。该孔径优选直径为0.4～8微米，更优选为3～6微米。

作为易溶性材料101，可以使用水溶性聚合物等，例如，可以适当使用聚乙烯醇(PVA)、海藻酸、甲基纤维素等。

在使用海藻酸作为易溶性材料101时，可以通过向流路110或流路130输送海藻酸降解酶来溶解生物组织形成装置1内的培养膜10。

另外，在使用聚乙烯醇作为易溶性材料101时，在细胞层形成后，可以通过将生物组织形成装置1加热至例如37～50℃来溶解生物组织形成装置1内的培养膜10中的易溶性材料101。需要说明的是，聚乙烯醇的溶解温度不限于此范围，也可以通过加热到37～80℃使其溶解。

进一步，在使用甲基纤维素作为易溶性材料101时，在细胞层形成后，可以通过将生物组织形成装置1冷却至例如5～10℃来溶解生物组织形成装置1内的培养膜10中的易溶性材料101。需要说明的是，甲基纤维素的溶解温度不限于该范围，也可以通过冷却到4～25℃使其溶解。

这里，甲基纤维素是一种在高温下凝胶化，冷却时液化的材料，通过低温状态可以使其溶解。另外，为了调节甲基纤维素的溶解温度，优选加入添加剂。通过在甲基纤维素中加入添加剂可以提高其溶解温度。作为该添加剂，例如可以适当使用苯乙烯磺酸钠(NaSS)。

这样，根据本实施方式的生物组织形成装置1，通过在细胞层形成后溶解培养膜10，可以在多个细胞层之间适当地进行液体成分的透过。

作为使用本实施方式的生物组织形成装置1培养的细胞，例如可以使用多能干细胞(iPS细胞等)和胚胎干细胞(ES细胞)等。

另外，在本实施方式的生物组织形成装置1中，为了使细胞适当地黏附在培养膜的表面，优选设置细胞的支架材料。在后述的第二实施方式中也同样。

具体而言，优选在培养膜的表面附加细胞的支架材料后，使细胞黏附进行培养。

作为细胞的支架材料，例如，可以适当使用胶原、基质胶、纤连蛋白、层粘连蛋白、壳聚糖，也可以使用这些材料中的两种以上。

作为在培养膜表面附加细胞支架材料的方法，例如可以举出：在培养膜表面进行涂层的方法、将易溶性材料和细胞支架材料混合的方法、使用偶联剂等试剂使细胞支架材料与易溶性材料化学结合的方法、以及预先将胶原和壳聚糖加工成纤维状的物质粘贴在培养膜表面的方法等。

另外，还优选使细胞与后述第二实施方式中使用的难溶性材料黏附，从而使细胞与培养膜表面黏附。

本实施方式的生物组织形成装置1中的培养膜10例如可以通过在基材上涂布易溶性材料101，将得到的培养膜10从基材上剥离并切割成所需形状来制造，并置于生物组织形成装置1内来使用。

需要说明的是，培养膜10的形状当然不限于图1所示的形状，例如，也可以是配置在流路板11和13的整个下面的形状。

另外，还优选对培养膜10的表面进行电晕处理、准分子处理或等离子处理等表面处理。

通过进行这样的表面处理，可以提高培养膜10表面的亲水性，可以提高黏附细胞对培养膜10表面的黏附性。

作为本实施方式的生物组织形成装置1中的流路板11和流路板13的材料，例如可以使用环烯烃聚合物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯，流路板11和流路板13可以通过注射成型等制造。

另外，作为本实施方式的生物组织形成装置1中的黏附层12和黏附层14的材料，例如可以使用黏附剂等，黏附层12和黏附层14例如可以通过冲压加工成图1所示的形状来制造。

进一步，作为本实施方式的生物组织形成装置1中的培养膜10的材料，如上所述，可以使用海藻酸或聚乙烯醇等，可以将得到的培养膜10切割成所需形状来使用。

而且，通过利用黏附层12、14将流路板11、13和培养膜10贴合在一起，可以制造本实施方式的生物组织形成装置1。

本实施方式的生物组织形成装置1可以是在培养膜10上形成细胞层之前的状态，也可以是在培养膜10上形成细胞层之后的状态。

另外，本实施方式的生物组织形成装置1，还包括在培养膜10上形成细胞层后溶解易溶性材料101的装置。

进一步，还优选将本实施方式的生物组织形成装置1构成为，培养膜10是含有黏附细胞而形成的。此时，可以是培养膜10的表面上固定有黏附细胞的构成，也可以是培养膜10中包含有黏附细胞的构成。当培养膜10由例如海藻酸制造时，黏附细胞可以在培养膜10内存活。

如果本实施方式的生物组织形成装置1为这样的构成，则在后述的本实施方式的生物组织的形成方法中，可以省略向流路提供黏附细胞。

本实施方式的生物组织的形成方法是具有由黏附细胞构成的多个细胞层的生物组织的形成方法，其特征在于，具有：向生物组织形成装置中的两个流路提供黏附细胞和培养液的工序，所述生物组织形成装置具备：培养膜，在两面具备黏附细胞的培养区域，培养黏附细胞后置于多个细胞层之间，两个流路，由培养膜划分，培养膜由易溶性材料构成；在两个流路中培养黏附细胞，在培养膜的两面形成细胞层的工序；以及溶解培养膜的工序。

这里，如图7所示，传统的生物组织形成装置20一般使用聚酯等半透膜作为培养膜210，通过该膜在两个流路间进行细胞间相互作用和液体成分的交换。

即，在传统的生物组织形成装置20中，在流路板211和半透膜210之间的流路中填充培养液40，在半透膜210的一个表面上培养细胞30，同时在流路板213和半透膜210之间的流路中填充培养液41，在半透膜210的另一个表面上培养细胞31，从而形成两个细胞层。

但是，在本实施方式中培养的细胞的尺寸一般为8～10μm，另一方面，传统的生物组织形成装置20中的半透膜210的孔径为3μm左右，因此，在使用传统的生物组织形成装置20时，存在妨碍细胞层间的细胞之间的接触、细胞层间相互作用降低的问题，以及随着细胞的增殖，存在半透膜210的孔被堵塞，液体成分的交换效率变低的问题。

与此相对，在本实施方式的生物组织形成装置1中，如图4所示，在流路板11和培养膜10之间的流路110中填充培养液40，在培养膜10的一个表面上培养细胞30，同时在流路板13和培养膜10之间的流路130中填充培养液41，在培养膜10的另一个表面上培养细胞31，从而可以形成两个细胞层。

而且，在形成两个细胞层后，通过溶解培养膜10中的易溶性材料101，在细胞层间细胞之间可以接触，可以消除细胞层间相互作用降低的问题。另外，能够高效率地进行液体成分的交换，能够消除两个细胞层间的液体成分交换效率变低的问题。

此时，当易溶性材料101为海藻酸时，在溶解培养膜10的工序中，可以向流路110和流路130的至少任一个提供海藻酸降解酶来溶解培养膜10。

另外，当易溶性材料101为聚乙烯醇时，在溶解培养膜10的工序中，可以通过加热生物组织形成装置1来溶解培养膜10。

溶解培养膜10的工序优选在整个培养区域形成细胞层时进行。

另外，在流路110和流路130中，优选分别形成由不同种类的黏附细胞构成的细胞层。

如果本实施方式的生物组织的形成方法为这样的方法，则能够适当形成具有由多个不同的细胞构成的细胞层的生物组织。

这里，在生物组织形成装置1的两个流路中培养黏附细胞时，需要使黏附细胞附着于培养膜10的两面。

作为其方法，向生物组织形成装置1的两个流路提供黏附细胞和培养液后，一边上下翻转生物组织形成装置1一边进行培养，由此可以使黏附细胞附着在培养膜10的两面。

另外，当向生物组织形成装置1的两个流路提供黏附细胞和培养液而不将生物组织形成装置1上下翻转时，通过向生物组织形成装置1的下方的流路130填充黏附细胞，不仅能够使黏附细胞附着在培养膜10的上面，还能够附着在培养膜10的下面。

在这种情况下，在培养膜10的下面附着黏附细胞后，可以通过用培养液等冲洗残留在流路130中的细胞，使培养膜10的下面的黏附细胞以附着状态残留。

该方法虽然会浪费细胞，但与前者的方法相比，具有能够在短时间内附着黏附细胞的优点。

在本实施方式的生物组织的形成方法中，作为黏附细胞，例如可以适当使用多能干细胞(iPS细胞等)和胚胎干细胞(ES细胞)等。

另外，制造的生物组织的种类没有特别限定，可以以具备由肾小管上皮细胞构成的组织和由血管内皮细胞构成的组织的近曲小管模型中的生物组织、肾小球模型、小肠模型、肝脏模型、肺模型中的生物组织等各种组织为对象。

进一步，对于所使用的培养液和其在流路中的流速等也没有特别限定，可以根据所培养的细胞和组织适当设定。

如以上说明，根据本实施方式的生物组织形成装置及生物组织的形成方法，在器官芯片等中，培养膜可以使用易溶性材料来构成，在该培养膜的两面形成细胞层后，通过溶解易溶性材料，可以高效率地进行所形成的生物组织的细胞层间的细胞间相互作用和液体成分的交换。

[第二实施方式]

其次，对根据本发明的第二实施方式的生物组织形成装置进行说明。

本实施方式的生物组织形成装置在培养膜由易溶性材料和难溶性材料构成这一点上与第一实施方式不同。关于其他构成，除了以下说明的点以外与第一实施方式相同。

即，本实施方式的生物组织形成装置，其特征在于，具备：培养膜，在两面具备黏附细胞的培养区域，培养黏附细胞后置于多个细胞层之间，多个流路，由培养膜划分；培养膜由易溶性材料和难溶性材料构成。

通过在与图1～3中的第一实施方式相同构成的附图标记上标注a来说明本实施方式的生物组织形成装置。

在本实施方式的生物组织形成装置1a中，培养膜10a由易溶性材料101a和难溶性材料102a构成。

而且，在形成细胞层之后，通过溶解培养膜10a中的易溶性材料101a，仅使培养膜10a中的难溶性材料102a作为细胞层的支撑体而残留下来。由此，形成贯通培养膜10a的孔。

即，在黏附细胞的培养工序中，培养膜10a中的易溶性材料101a和难溶性材料102a被用作黏附细胞的支架。另外，在易溶性材料101a溶解后，难溶性材料102a被用作细胞层的支撑体。

作为易溶性材料101a，可以使用水溶性聚合物等，例如，可以适当使用聚乙烯醇(PVA)、海藻酸、甲基纤维素等。

在使用海藻酸作为易溶性材料101a时，可以通过将海藻酸降解酶输送到流路110a或流路130a来溶解生物组织形成装置1内的培养膜10a中的易溶性材料101a。

另外，在使用聚乙烯醇作为易溶性材料101a时，在细胞层形成后，可以通过将生物组织形成装置1a加热至例如37～50℃来溶解生物组织形成装置1a内的培养膜10a中的易溶性材料101a。

进一步，在使用甲基纤维素作为易溶性材料101a时，在细胞层形成后，可以通过将生物组织形成装置1a冷却至例如5～10℃来溶解生物组织形成装置1a内的培养膜10a中的易溶性材料101a。

作为难溶性材料102a，可以使用聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚乳酸(PLA)、紫外线(UV)固化树脂等。

由难溶性材料构成的多孔膜的孔径优选为直径10微米以上。如果将该孔径设为这样，就可以使两个细胞层间的细胞间相互作用和液体成分的交换变得高效。

这样，根据本实施方式的生物组织形成装置1a，在细胞层形成后，通过溶解培养膜10a中的易溶性材料101a，可以在多个细胞层之间适当地进行细胞间相互作用和液体成分的透过。

另外，培养膜10a中的难溶性材料102a可以残留在多个细胞层之间，以难溶性材料102a为支撑体可以使细胞层不易被损坏。

本实施方式的生物组织形成装置1a中的培养膜10a例如可以通过以下方法制造并使用。

即，如图5所示，首先在基材50上涂布易溶性材料101a。接着，层叠难溶性材料102a，再涂布易溶性材料101a。然后，将得到的培养膜10a从基材50上剥离，切断成所需的形状，并置于生物组织形成装置1内。

另外，作为本实施方式的生物组织形成装置1a中的培养膜10a中的易溶性材料101a，如上所述，可以使用海藻酸和聚乙烯醇等。另外，作为培养膜10a中的难溶性材料102a，可以使用聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚乳酸(PLA)、紫外线(UV)固化树脂等。进一步，如上所述，可以将得到的培养膜10a切割成所需的形状来使用。

而且，通过利用黏附层12a、14a将流路板11a、13a和培养膜10a贴合在一起，可以制造本实施方式的生物组织形成装置1a。

本实施方式的生物组织形成装置1a可以是在培养膜10a上形成细胞层之前的状态，也可以是在培养膜10a上形成细胞层之后的状态。

另外，在本实施方式的生物组织形成装置1a中，还包括在培养膜10a上形成细胞层后，易溶性材料101a被溶解，残留难溶性材料102a，形成贯通培养膜10a的孔的装置。

进一步，还优选将本实施方式的生物组织形成装置1a构成为，培养膜10a是含有黏附细胞而形成的。此时，可以是培养膜10a的表面固定有黏附细胞的构成，也可以是培养膜10a中的易溶性材料101a中包含有黏附细胞的构成。

本实施方式的生物组织的形成方法是具有由黏附细胞构成的多个细胞层的生物组织的形成方法，其特征在于，具有：向生物组织形成装置中的两个流路提供黏附细胞和培养液的工序，所述生物组织形成装置具备：培养膜，在两面具备黏附细胞的培养区域，培养黏附细胞后置于多个细胞层之间，两个流路，由培养膜划分，培养膜由易溶性材料和难溶性材料构成；在两个流路中培养黏附细胞，在培养膜的两面形成细胞层的工序；以及溶解培养膜的工序。

在本实施方式的生物组织形成装置1a中，如图6所示，在流路板11a和培养膜10a之间的流路110a中填充培养液40，在培养膜10a的一个表面上培养细胞30，同时在流路板13a和培养膜10a之间的流路130a中填充培养液41，在培养膜10a的另一个表面上培养细胞31，从而可以形成两个细胞层。

而且，在形成两个细胞层后，通过溶解培养膜10a中的易溶性材料101a，在细胞层间细胞之间可以接触，可以消除细胞层间相互作用降低的问题。另外，能够高效率地进行液体成分的交换，能够消除两个细胞层间的液体成分交换效率变低的问题。

另外，由于培养膜10a中的难溶性材料102a不溶解，因此可以使其残留在两个细胞层之间，以难溶性材料102a为支撑体可以使细胞层不易被损坏。

此时，当易溶性材料101a为海藻酸时，在溶解培养膜10a中的易溶性材料的工序中，可以向流路110a和流路130a中的至少任一个提供海藻酸降解酶来溶解培养膜10a。

另外，当易溶性材料101a为聚乙烯醇时，在溶解培养膜10a中的易溶性材料的工序中，可以通过加热生物组织形成装置1a来溶解培养膜10a。

如以上说明，根据本实施方式的生物组织形成装置及生物组织的形成方法，在器官芯片等中，培养膜可以使用易溶性材料和难溶性材料来构成，在该培养膜的两面形成细胞层后，通过溶解易溶性材料，可以高效率地进行所形成的生物组织的细胞层间的细胞间相互作用和液体成分的交换，并且可以使细胞层不易被损坏。

实施例

下面，对为了确认在根据本发明的实施方式的生物组织形成装置中使用的易溶性材料的溶解而进行的实验进行说明。易溶性材料被用作在生物组织形成装置中培养黏附细胞后置于多个细胞层之间的培养膜，在细胞层形成后被溶解，但在各实施例中，省略细胞层的形成，只评价了易溶性材料的溶解性。

另外，在使用生物组织形成装置形成细胞层时使用培养液，在各实施例及参考例中，使用磷酸缓冲液代替培养液评价了溶解性。其结果如图8所示。

[实施例1]

在本实施例中，进行了将海藻酸用作生物组织形成装置中的易溶性材料并用柠檬酸钠对其溶解的实验。

具体而言，将海藻酸钠(富士胶片和光纯药株式会社，194-13321)溶解于纯水中，制备1％海藻酸钠水溶液。将该海藻酸钠水溶液流延到PET薄膜上，在室温(25℃)下干燥一夜。

接着，在0.5M氯化钙水溶液中浸泡10分钟，使海藻酸交联后，用纯水冲洗。在室温(25℃)下干燥一夜，制备海藻酸钙薄膜(膜厚约10μm)，作为易溶性材料。将切成10mm见方的易溶性材料浸泡于20mL磷酸缓冲液(赛默飞世尔科技(サーモフィッシャーサイエンティフィック)株式会社，10010023)中，在温度37℃下保存1周后，确认易溶性材料的状态和透明性。

这里，将易溶性材料在溶解前保存1周并确认其状态的原因是，为了形成细胞层，一般需要1周左右的培养时间，在此期间最好不溶解。另外，确认易溶性材料的透明性的原因是，由于在易溶性材料的表面形成了细胞层，所以在观察细胞层时最好易溶性材料为透明的，以便于识别。

上述确认的结果是，磷酸缓冲液中所含的氯化钠使易溶性材料的表面稍微溶解，透明性降低。

另外，为了溶解易溶性材料，向磷酸缓冲液中添加柠檬酸钠至1％，在温度37℃下浸泡在磷酸缓冲液中6小时。其结果，易溶性材料在磷酸缓冲液中完全溶解。

[实施例2]

在本实施例中，进行了将海藻酸用作生物组织形成装置中的易溶性材料并用海藻酸降解酶对其溶解的实验。

具体而言，与实施例1相同，制备海藻酸钙薄膜，将其作为易溶性材料，在磷酸缓冲液中浸泡保存，然后确认易溶性材料的状态和透明性。其结果，易溶性材料的状态和透明性与浸泡于磷酸缓冲液之前相比毫不逊色。

另外，为了溶解该易溶性材料，在磷酸缓冲液中加入100μg海藻酸降解酶(株式会社日本基因，319-08261)，在温度37℃下浸泡在磷酸缓冲液6小时。其结果，易溶性材料在磷酸缓冲液中完全溶解。

[实施例3]

在本实施例中，进行了将聚乙烯醇用作生物组织形成装置中的易溶性材料并通过加热使其溶解的实验。

具体而言，将聚乙烯醇(富士胶片和光纯药株式会社，160-11485)溶解于纯水中，制备5％聚乙烯醇水溶液。将该聚乙烯醇水溶液流延到PET薄膜上，在室温(25℃)下干燥一夜，制备聚乙烯醇薄膜(膜厚约7μm)，作为易溶性材料。

接着，将切成10mm见方的易溶性材料浸泡在20mL磷酸缓冲液(赛默飞世尔科技(サーモフィッシャーサイエンティフィック)株式会社，10010023)中，在温度37℃下保存1周后，确认易溶性材料的状态和透明性。其结果，易溶性材料的状态和透明性与浸泡于磷酸缓冲液之前相比毫不逊色。

另外，为了溶解该易溶性材料，在温度50℃下在磷酸缓冲液中浸泡3小时。其结果，易溶性材料在磷酸缓冲液中完全溶解。

[实施例4]

在本实施例中，进行了将甲基纤维素用作生物组织形成装置中的易溶性材料并通过冷却使其溶解的实验。

具体而言，将甲基纤维素(信越化学工业株式会社制造，MCE-4000)溶解于纯水中，制备1％甲基纤维素水溶液。将该甲基纤维素水溶液流延到PET薄膜上，在室温(25℃)下干燥一夜，制备甲基纤维素薄膜(膜厚约20μm)，作为易溶性材料。

接着，将切成10mm见方的易溶性材料浸泡在20mL磷酸缓冲液(赛默飞世尔科技(サーモフィッシャーサイエンティフィック)株式会社，10010023)中，在温度37℃下保存1周后，确认易溶性材料的状态和透明性。其结果，易溶性材料的状态和透明性与浸泡于磷酸缓冲液之前相比毫不逊色。

另外，为了溶解该易溶性材料，在温度10℃下在磷酸缓冲液中浸泡10分钟。其结果，易溶性材料在磷酸缓冲液中部分溶解。

需要说明的是，为了溶解该易溶性材料，在温度5℃下保存时，易溶性材料更多地溶解于磷酸缓冲液中。因此，为了在温度10℃下使易溶性材料在磷酸缓冲液中更好地溶解，接下来进行了调整甲基纤维素水溶液的溶解温度的实验。

[实施例5]

在本实施例中，进行了使用甲基纤维素作为生物组织形成装置中的易溶性材料，同时加入苯乙烯磺酸钠作为添加剂，通过冷却使其溶解的实验。

具体而言，为了调整溶解温度，向与实施例4同样制备的甲基纤维素水溶液中添加苯乙烯磺酸钠(富士胶片和光纯药株式会社，192-03292)至0.1M。将该甲基纤维素水溶液流延到PET薄膜上，在室温(25℃)下干燥一夜，制备甲基纤维素薄膜(膜厚约20μm)，作为易溶性材料。

接着，将切成10mm见方的易溶性材料浸泡在20mL磷酸缓冲液(赛默飞世尔科技(サーモフィッシャーサイエンティフィック)株式会社，10010023)中，在温度37℃下保存1周后，确认易溶性材料的状态和透明性。其结果，易溶性材料的状态和透明性与浸泡于磷酸缓冲液之前相比毫不逊色。

另外，为了溶解该易溶性材料，在温度10℃下在磷酸缓冲液中浸泡10分钟。其结果，易溶性材料在磷酸缓冲液中完全溶解。

[参考例1]

本参考例中，使用市售的半透膜PET膜(康宁(コーニング)公司，353091)代替生物组织形成装置中的易溶性材料，进行了对其溶解的实验。

具体而言，将切成10mm见方的PET膜浸入20mL磷酸缓冲液(赛默飞世尔科技(サーモフィッシャーサイエンティフィック)株式会社，10010023)中，在温度37℃下保存1周后，确认易溶性材料的状态和透明性。其结果，易溶性材料的状态和透明性与浸泡于磷酸缓冲液之前相比毫不逊色。

另外，将该PET膜在温度90℃下在磷酸缓冲液中浸泡24小时。其结果，PET膜没有溶解，没有发现变化。

进一步，为了用酶分解该PET膜，加入洒维奈斯(Savinase)(诺维信(Novozymes)公司，16L)至0.5％，在温度37℃下保存24小时。其结果，PET膜没有溶解，没有发现变化。

从参考例1的结果可知，不能使用PET膜代替生物组织形成装置中的易溶性材料。另一方面，作为生物组织形成装置中的难溶性材料，可以适当使用PET膜。

本发明不限于以上的实施方式和实施例，在本发明的范围内，当然可以进行各种变更。

例如，生物组织制造装置中的流路的形状和培养膜的形状等不限于图1等所示的形状，也可以适当变更为其他各种形状。

工业实用性

本发明可以适当应用于使用器官芯片等形成生物组织的情况等。

本说明书中记载的文献以及作为本申请的巴黎优先权基础的日本申请说明书的内容均被引用于此。

附图标记说明

1、1a生物组织形成装置

10、10a培养膜

101、101a易溶性材料

102a难溶性材料

11、11a、13、13a流路板

110、110a、130、130a流路

12、12a、14、14a黏附层

20生物组织形成装置

210半透膜

211、213流路板

30、31细胞

40、41培养液

50基材