FKBP5及has-miR-320a-3p在HIV感染人群中诊断结核病的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及FKBP5及has-miR-320a-3p在HIV感染人群中诊断结核病的应用。

背景技术

结核病(Tuberculosis,TB)由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起以慢性肉芽肿为特征的传染性疾病。2021 年WHO TB report报道，目前全球结核潜伏感染人群接近20亿，2020年新发TB患者987 万，140万人死于TB。

人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)是引起获得性免疫缺陷综合征 (Acquired immune deficiency syndrome,AIDS即艾滋病)的病原体。HIV分为两型，HIV-1 和HIV-2。HIV-1是导致AIDS的主要病原。

2019年，约有69万人死于AIDS，其中33％的死亡归因于HIV病毒相关结核病。由于HIV对宿主的免疫抑制作用，与HIV阴性者相比，HIV阳性者患活动性结核病的风险要高出26～31倍。活动性结核病也加速了HIV感染者免疫功能的恶化，促进了从HIV感染者到 AIDS的进程，死亡率增加。

由于HIV合并结核分枝杆菌感染造成巨大全球经济负担，需迫切对所有HIV阳性个体进行结核分枝杆菌感染的筛查，以利于及时抗结核治疗，延长患者生命。

目前应用最广泛的实验室结核病诊断是基于痰液检测，包括痰涂片和痰培养。但在HIV 合并结核分枝杆菌感染患者中，痰涂片阴性(培养阴性，有症状)和亚临床(培养阳性，无症状活动)结核病的发病率较高。这导致筛查试验的敏感性降低和随后的诊断延迟。此外，虽然肺结核是最常见的活动性结核病，但在HIV合并结核分枝杆菌感染人群中，更容易发展为独立或并发肺外结核，尤其是当CD4

因此，有必要筛选出敏感、方便的HIV合并结核分枝杆菌感染的生物标志物，用于HIV/AIDS人群中结核病的筛查，对合并感染者早诊断、早治疗、延长患者生命和提高其生活质量。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供FKBP5及has-miR-320a-3p在 HIV感染人群中诊断结核病的应用，用于解决现有技术中HIV感染人群中结核病诊断方法敏感性不高、特异性不高或耗时等问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供FKBP5作为生物标志物在制备用于HIV感染人群中诊断结核病、HIV合并结核分枝杆菌感染疾病疗效监测评估的检测试剂盒中的应用。

本发明中的HIV感染人群是指HIV/AIDS患者，包括HIV感染者和AIDS患者，其中HIV感染者是指感染HIV后尚未发展到艾滋病阶段的个体，AIDS患者是指感染HIV后发展到艾滋病阶段的患者(参见2019年7月1日起实施的国家卫生行业标准WS293-2019《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断》)。

可选地，所述检测试剂盒用于测定体液样品中FKBP5的表达水平。

可选地，所述检测试剂盒测定体液样品中FKBP5的表达水平的方法选自实时荧光定量 PCR(q-PCR)、免疫印迹试验(Western blot)、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法、酶联免疫吸附试验中的任意一种，优选为实时荧光定量PCR(q-PCR)。

可选地，所述体液样品选自全血有核细胞、血清、血浆、脑脊液中的至少一种。

本发明第二方面提供has-miR-320a-3p作为生物标志物在制备用于HIV感染人群中结核病诊断、HIV合并结核分枝杆菌感染疾病疗效监测评估的检测试剂盒中的应用。

可选地，所述检测试剂盒用于测定体液样品中has-miR-320a-3p的表达水平。

可选地，所述检测试剂盒通过实时荧光定量PCR(q-PCR)测定体液样品中 has-miR-320a-3p的表达水平。

可选地，所述体液样品选自全血有核细胞、血清、血浆、脑脊液中的至少一种。

本发明第三方面提供FKBP5与has-miR-320a-3p联合作为生物标志物在制备用于HIV 感染人群中结核病诊断、HIV合并结核分枝杆菌感染疾病疗效监测评估的检测试剂盒中的应用。

本发明第四方面提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒通过测定体液样品中FKBP5和/ 或has-miR-320a-3p的表达水平，用于HIV感染人群中结核病的诊断，以及HIV合并结核分枝杆菌感染疾病的疗效监测与评估。

可选地，所述检测试剂盒测定体液样品中FKBP5的表达水平的方法选自实时荧光定量 PCR(q-PCR)、免疫印迹试验(Western blot)、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法、酶联免疫吸附试验中的任意一种，优选为实时荧光定量PCR(q-PCR)。

可选地，所述体液样品选自全血有核细胞、血清、血浆、脑脊液中的至少一种。

如上所述，本发明的FKBP5及has-miR-320a-3p在HIV感染人群中诊断结核病的应用，具有以下有益效果：

本发明为HIV合并结核分枝杆菌感染的诊断提供了两种新的灵敏度高、特异性好、检测速度快的生物标志物，根据检测受试者体内FKBP5及has-miR-320a-3p的表达水平，能够评估在HIV感染群体中是否存在结核分枝杆菌感染，还可以监测、评估HIV合并结核分枝杆菌感染疾病的疗效。

本发明提供的技术手段有利于HIV合并结核分枝杆菌感染者的早诊断、早治疗，延长患者生命，提高其生活质量。

附图说明

图1显示为本发明实施例中HIV/AIDS患者和HIV/TB患者血液有核细胞中FKBP5的表达水平散点图。

图2显示为本发明实施例中HIV/AIDS患者和HIV/TB患者血液有核细胞中 has-miR-320a-3p的表达水平散点图。

图3显示为本发明实施例中根据HIV/AIDS患者和HIV/TB患者血液有核细胞中FKBP5 的表达水平绘制的受试者特征曲线(ROC)图。

图4显示为本发明实施例中根据HIV/AIDS患者和HIV/TB患者血液有核细胞中has-miR-320a-3p的表达水平绘制的受试者特征曲线(ROC)图。

图5显示为本发明实施例中根据HIV/AIDS患者和HIV/TB患者血液有核细胞中FKBP5 及has-miR-320a-3p的表达水平绘制的受试者特征曲线(ROC)图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

根据世界卫生组织(WHO)指南，活动性结核病是指存在临床症状和体征，以及当前病理、细菌学和/或放射学发现的结核病证据。它由以下一种或多种诊断方法定义：

(1)从任何临床标本中如支气管肺泡灌洗、痰液、气管内抽吸物、胸腔积液的培养中鉴定或检测出抗酸杆菌；

(2)标本组织学检查为干酪性肉芽肿；

(3)使用PCR检测出结核分枝杆菌DNA；

(4)胸部X线检查结合临床症状。

非活动性结核病为TST试验或IGRA检测阳性的曾经患过结核病的或稳定的影像学异常结果的个体，没有细菌学依据，没有临床症状和/或放射学证据。

HIV的实验室诊断包含抗体检测、病原学检测、核酸检测。

(1)抗体检测：主要包括酶联免疫吸附试验、化学发光或免疫荧光试验、简单试验(明胶颗粒凝集试验)、快速试验(斑点-ELISA和斑点免疫胶体金或胶体硒)、HIV自行检测等。 HIV抗体确认试验方法有免疫印迹法(Western blotting,WB)，条带免疫印迹法(stripimmunoblot assay,SIA；linear immunoblot assay,LIA)，免疫荧光法(immunofluorescence assay,IFA)和放射免疫沉淀法(radio-immuno-precitationassay,RIPA)。

(2)病原学检测：包含HIV p24抗原检测、病毒培养。

(3)核酸检测：包含定量检测和定性检测。

在HIV合并结核分枝杆菌感染人群中，更容易发展为独立或并发肺外结核，而目前针对活动性肺结核的检测手段并不适用于HIV合并结核分枝杆菌感染人群中检测肺外结核，或诊断比较困难。

基于此，本发明提供了两种高灵敏、高特异性、快速方便的HIV合并结核分枝杆菌感染的生物标志物，分别为FKBP5、has-miR-320a-3p。

FKBP5基因，编码FKBP5蛋白，其也被称为FKBP51蛋白，属于亲免疫蛋白家族，由FKBP和四肽重复结构域(TPR)组成。FKBP5的主要功能之一是通过与热休克蛋白 Hsp90/Hsp70形成复合物，参与调节甾体受体(包括孕酮、雄激素和糖皮质激素受体)的功能。

has-miR-320a-3p是靶向调节FKBP5基因的microRNA，可以靶向基因3'UTR区域，其通过识别同源序列并干扰转录、翻译或表观遗传过程，在转录后水平调控基因表达。

本发明实施例的研究包含两组参与者，对照组为HIV阳性成人(18岁以上)，18人；实验组为HIV阳性成人(18岁以上)合并活动性结核病，17人，依据《肺结核诊断标准(WS288-2017)》来确诊活动性结核病。收集的样本为患者检查的剩余血，由重庆公共卫生医疗救治中心提供(符合重庆公共卫生医疗救治中心伦理委员会要求)。

研究者特征见表1。

表1.研究者特征

本实施例的研究过程如下：

一、艾滋感染相关结核病患者血细胞FKBP5及has-miR-320a-p表达量检测。

将收集18例HIV/AIDS患者及17例HIV/TB患者(即HIV合并结核分枝杆菌感染患者)的全血，离心后将血清弃去，加入Beyotime红细胞裂解液(红细胞裂解液与红细胞比为10：1)，混匀后裂解10min，400g离心5min，弃去上清液后，再重复上述步骤裂解1次。第二次裂解完毕，用PBS重悬有核细胞，400g离心5min，弃去上清液，最后得到血液有核细胞。采用Invitrogen TRIzol从每个样品中提取总RNA，用IMPLEN分光光度计测定其浓度和纯度。mRNA采用Takara逆转录试剂盒，反应条件为37℃15min，85℃5s，4℃结束。MicroRNA 采用Accurate Biotechnology miRNA 1st strand cDNA synthesis kit进行A加尾法逆转录，逆转录条件为37℃60min，85℃5min，4℃结束。

接下来，基于

表2.引物序列

图1显示为HIV/AIDS患者和HIV/TB患者血液有核细胞中FKBP5的表达水平散点图。

由1可知，当HIV/AIDS患者合并活动性结核后，FKBP5表达水平是显著提高的，且差异具有统计学意义，Mann-Whitney test p＝0.0055。

图2显示为HIV/AIDS患者和HIV/TB患者血液有核细胞中has-miR-320a-3p的表达水平散点图。

由2可知，当HIV/AIDS患者合并活动性结核后，has-miR-320a-3p表达水平是显著下降的，且差异具有统计学意义，Mann-Whitney test p<0.0001。

二、ROC曲线分析FKBP5及has-miR-320a-3p对艾滋感染相关结核病的诊断效能

将上述步骤一得出的表达量数据进行ROC曲线绘制。采用R(3.6.3版本)软件，统计分析与可视化方法为：logistics模型采用glm函数构建，ROC分析采用pROC包，可视化采用ggplot2包。

图3显示为根据HIV/AIDS患者和HIV/TB患者血液有核细胞中FKBP5的表达水平绘制的受试者特征曲线(ROC)图。

由图3可知，曲线下面积为0.770，证明使用FKBP5诊断HIV/TB患者是有较好的诊断效能。

图4显示为根据HIV/AIDS患者和HIV/TB患者血液有核细胞中has-miR-320a-3p的表达水平绘制的受试者特征曲线(ROC)图。

由图4可知，曲线下面积为0.889，证明使用has-miR-320a-3p诊断HIV/TB患者是有较好的诊断效能。

图5显示为根据HIV/AIDS患者和HIV/TB患者血液有核细胞中FKBP5及 has-miR-320a-3p的表达水平绘制的受试者特征曲线(ROC)图。

由图5可知，曲线下面积为0.886，证明使用FKBP5及has-miR-320a-3p联合诊断HIV/TB 患者是有较好的诊断效能。

综上所述，本发明通过实验验证了FKBP5及has-miR-320a-3p可以作为诊断HIV/AIDS 人群感染结核病的生物标志物，且具有敏感性高、特异性高、检测速度快等优点，适用于 HIV/AIDS人群中结核病的筛查，有利于HIV合并结核分枝杆菌感染者的早诊断、早治疗，延长患者生命，提高其生活质量。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。