一种新冠病毒试剂盒的检测卡及其制备方法

技术领域

本发明涉及新冠病毒检测技术领域，具体而言，涉及一种新冠病毒试剂盒的检测卡及其制备方法。

背景技术

新型冠状病毒不断进化和突变，至今已经演化出多种突变株，与原始株相比，突变株具有更高的传播能力和感染能力，并且将带来临床特征上不确定的变化，这些变化同时也给现行的诊断、治疗和疫苗带来了新的挑战，因此，对新型冠状病毒突变株的快速鉴定不仅有利于临床的诊断和治疗，更有利于对疫情的防控。

目前用于新冠突变株鉴定的方法主要是DNA测序技术，然而该方法具有明显的不足之处：DNA测序技术虽然准确，但是针对原始毒株以及德尔塔、奥密克戎等突变株检测灵敏度和特异性较弱。因此提供一种灵敏度和特异性高的新冠病毒试剂盒的检测卡非常有必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新冠病毒试剂盒的检测卡及其制备方法，以实现无论是针对新冠病毒原始株还是新冠病毒突变株，均具有高灵敏度和特异性的效果。

本发明通过以下技术方案实现：

一种新冠病毒试剂盒的检测卡，包括T线标记原料新冠病毒N蛋白抗体1#、T线包被原料新冠病毒N蛋白抗体2#、C线标记原料和C线包被原料，新冠病毒N蛋白抗体1#、新冠病毒N蛋白抗体2#的识别表位均选自序列NCBI 参考序列: YP_009724397.2。

本发明选择了更优的配对抗体，从而能够识别和检测原始株以及德尔塔、奥密克戎等突变株，达到了灵敏度高、特异性强的检测效果，有助于及时管理，并且适用于大规模生产。

为了更好的实现本发明，进一步的，所述T线标记原料新冠病毒N蛋白抗体1#表位选自序列NCBI Reference 参考序列: YP_009724397.2（Genomic Sequence: NC_045512.2）中195-230aa、74-105aa、25-48aa的任意一种。

为了更好的实现本发明，进一步的，所述T线包被原料新冠病毒N蛋白抗体2#表位选自序列NCBI 参考序列: YP_009724397.2（Genomic Sequence: NC_045512.2）中176-350aa、44-175aa、20-105aa的任意一种。

为了更好的实现本发明，进一步的，所述T线标记原料新冠病毒N蛋白抗体1#表位选自序列NCBI 参考序列: YP_009724397.2（Genomic Sequence: NC_045512.2）中的74-105aa，所述T线包被原料新冠病毒N蛋白抗体2#表位选自序列NCBI 参考序列: YP_009724397.2（Genomic Sequence: NC_045512.2）中的44-175aa。

为了更好的实现本发明，进一步的，所述C线标记原料为兔IgG、鸡IgY、DNP-BSA中的任意一种，C线包被原料为定性羊抗兔IgG、羊抗鸡IgY、DNP多克隆抗体中的任意一种。

一种新冠病毒试剂盒的检测卡的制备方法，其特征在于，包括样品垫的制备、金标垫的制备和硝酸纤维素膜的包被；

S1.样品垫的制备：

配制样品垫处理液,再将样品垫处理液按照30μL/cm

S2.金标垫的制备：

称取10%的胶体金4mL混于996mL超纯水，加热煮沸计时6min后，加入2%的柠檬酸三钠溶液23mL，待颜色转为酒红色至稳定开始计时，10min后关掉电源冷却配制得胶体金溶液；

按照质量体积比为0.6g:0.5g:1.0g:0.3mL:0.1mL:100mL称取Tris、BSA、蔗糖、Tween-20、Proclin300、超纯水，混匀后调pH值为8.0，配制得胶体金复溶液；

称取100mL胶体金溶液，添加0.1M碳酸钾30mL，混匀后向其中添加T线标记原料或C线标记原料使其终浓度为10~20μg/mL，室温偶联1.5小时，再向其中加入BSA使其终浓度为1%，混匀，室温封闭1.0个小时，8000rpm 4℃离心30min，弃上清，80mL胶体金复溶液复溶，得到T线标记溶液和C线标记溶液；

按照体积比为1:9称取T线标记溶液和C线标记溶液，混匀得到金标垫处理液，再将金标垫处理液按照30μL/cm

S3.硝酸纤维素膜的包被：

将硝酸纤维素膜和吸水滤纸粘贴于PVC胶板上；

按照质量体积比为2.0g:0.4g:8.0g:2.0g:0.5g:1mL:1000mL称取Na

将T线包被原料和C线包被原料通过包被缓冲液稀释至终浓度为0.5~1.0mg/mL，分别包被于硝酸纤维素膜作为检测线和质控线，37℃烘干3h后，密封常温保存。

本发明的有益效果是：

（1）本发明选择了更优的配对抗体，从而能够识别和检测原始株以及德尔塔、奥密克戎等突变株，达到了灵敏度高、特异性强的检测效果，有助于及时管理，并且适用于大规模生产。

（2）针对不易发生突变的抗原表位，本发明选择了抗体表位为74-105aa的标记原料和抗体表位为44-175aa的包被原料作配对，能够识别和检测原始株以及德尔塔、奥密克戎等突变株，达到了灵敏度高、特异性强的检测效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对本发明中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是本发明实施例的试剂条的构成示意图；

图2是本发明抗体表位配对示意图。

1-样品垫，2-金标垫，3-硝酸纤维素膜，4-检测线，5-质控线，6-吸水滤纸，7-PVC胶板。

具体实施方式

下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行描述。

正如背景技术部分所介绍的，采用核酸检测新冠突变株存在的问题是：耗时长、花费高，非目的蛋白干扰造成的结果不准确。

基于此，本发明设计了一种高灵敏度的新冠突变株检测试剂盒及其制备方法，为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

试剂盒，包括检测卡和样本处理液，检测卡包括样品垫、金标垫和包被的硝酸纤维素膜。

样品垫包括质量体积比为2.0g:1.0g:0.05~0.3mL:0.05~0.3mL:0.1mg:100mL的Tris、NaCl、Triton x-100、S9、清洁抗体C4、超纯水，将其混合均匀后得到样品垫处理液，然后涂抹至玻璃纤维素膜Ⅰ得到样品垫，作为优选的，Tris、NaCl、Triton x-100、S9、清洁抗体C4、超纯水的质量体积比为2.0g:1.0g:0.1mL:0.1mL:0.1mg:100mL。

金标垫包括胶体金溶液、胶体金复溶液、T线标记原料和C线标记原料，胶体金溶液由胶体金加水煮沸后，再加入柠檬酸三钠溶液得到，T线标记原料新冠病毒N蛋白抗体1#即T线标记原料，胶体金复溶液包括质量体积比为0.6g:0.5g:1.0g:0.3mL:0.1mL:100mL的Tris、BSA、蔗糖、Tween-20、Proclin300、超纯水，通过胶体金溶液、胶体金复溶液、T线标记原料和C线标记原料配制得到T线标记溶液和C线标记溶液，再将T线标记溶液和C线标记溶液按比例混匀得到金标垫处理液，然后涂抹至玻璃纤维素膜Ⅱ得到金标垫。

包被的硝酸纤维素膜包括硝酸纤维素膜、包被缓冲液、T线包被原料和C线包被原料，包被缓冲液采用Na

样本处理液中Tris、NaCl、Triton x-100、S9、MgSO

实施例2

本实施例抗体表位配对信息如下：

T线标记原料表位选自序列NCBI 参考序列: YP_009724397.2（GenomicSequence: NC_045512.2），选择195-230aa；

T线包被原料表位选自序列NCBI 参考序列: YP_009724397.2（GenomicSequence: NC_045512.2）；选择176-350aa；

本实施例提供了一种高灵敏度的新冠突变株检测试剂盒的制备方法包括检测卡的制备和样本处理液的配制，具体如下步骤：

检测卡的制备方法包括

（1）样品垫的制备：

按照质量体积比为2.0g:1.0g:0.3mL:0.3mL:0.1mg:100mL称取Tris、NaCl、Tritonx-100、S9、清洁抗体C4、超纯水，混匀后调pH值为7.2，配制样品垫处理液；再将样品垫处理液按照30μL/cm

（2）金标垫的制备：

称取10%的胶体金4mL混于996mL超纯水，加热煮沸计时6min后，加入2%的柠檬酸三钠溶液23mL，待颜色转为酒红色至稳定开始计时，10min后关掉电源冷却配制得胶体金溶液；按照质量体积比为0.6g:0.5g:1.0g:0.3mL:0.1mL:100mL称取Tris、BSA、蔗糖、Tween-20、Proclin300、超纯水，混匀后调pH值为8.0，配制胶体金复溶液。

称取100mL胶体金溶液，添加0.1M碳酸钾30mL，混匀后向其中添加T线标记原料或C线标记原料使其终浓度为20μg/mL，室温偶联1.5小时，再向其中加入BSA使其终浓度为1%，混匀，室温封闭1.0个小时，8000rpm 4℃离心30min，弃上清，80mL胶体金复溶液复溶，得到T线标记溶液和C线标记溶液。

按照体积比为1:9称取T线标记溶液和C线标记溶液，混匀得到金标垫处理液；再将金标垫处理液按照30μL/cm

（3）硝酸纤维素膜的包被：

将硝酸纤维素膜和吸水滤纸粘贴于PVC胶板上；

按照质量体积比为2.0g:0.4g:8.0g:2.0g:0.5g:1mL:1000mL称取Na

将T线包被原料和C线包被原料通过包被缓冲液稀释至终浓度为1.0mg/mL，分别包被于硝酸纤维素膜作为检测线和质控线，37℃烘干3h后，密封常温保存。

（4）检测卡的组装过程：

先将金标垫盖住硝酸纤维素膜下部约2mm，再将样品垫沿PVC胶板下缘粘贴，盖住金标垫约2mm，组装成试剂板，最后裁切为试剂条装入卡壳的对应位置扣合，连同干燥剂装入铝箔袋，封口并粘贴对应标签。

样本处理液的配制：

按照质量体积比为1.5g:1.0g:0.1mL:0.1mL:0.3g:0.1mL:100mL称取Tris、NaCl、Triton x-100、S9、MgSO

实施例3

本实施例抗体表位配对信息如下：

T线标记原料表位选自序列NCBI 参考序列: YP_009724397.2（GenomicSequence: NC_045512.2），选择25-48aa；

T线包被原料表位选自序列NCBI 参考序列: YP_009724397.2（GenomicSequence: NC_045512.2），选择20-105aa；

本实施例提供了一种高灵敏度的新冠突变株检测试剂盒的制备方法包括检测卡的制备和样本处理液的配制，具体如下步骤：

检测卡的制备方法包括

（1）样品垫的制备：

按照质量体积比为2.0g:1.0g: 0.05mL:0.05mL:0.1mg:100mL称取Tris、NaCl、Triton x-100、S9、清洁抗体C4、超纯水，混匀后调pH值为7.2，配制得样品垫处理液；再将样品垫处理液按照30μL/cm

（2）金标垫的制备：

称取10%的胶体金4mL混于996mL超纯水，加热煮沸计时6min后，加入2%的柠檬酸三钠溶液23mL，待颜色转为酒红色至稳定开始计时，10min后关掉电源冷却配制得胶体金溶液；按照质量体积比为0.6g:0.5g:1.0g:0.3mL:0.1mL:100mL称取Tris、BSA、蔗糖、Tween-20、Proclin300、超纯水，混匀后调pH值为8.0，配制得胶体金复溶液。

称取100mL胶体金溶液，添加0.1M碳酸钾30mL，混匀后向其中添加T线标记原料或C线标记原料使其终浓度为15μg/mL，室温偶联1.5小时，再向其中加入BSA使其终浓度为1%，混匀，室温封闭1.0个小时，8000rpm 4℃离心30min，弃上清，80mL胶体金复溶液复溶，得到T线标记溶液和C线标记溶液。

按照体积比为1:9称取T线标记溶液和C线标记溶液，混匀得到金标垫处理液；再将金标垫处理液按照30μL/cm

（3）硝酸纤维素膜的包被：

将硝酸纤维素膜和吸水滤纸粘贴于PVC胶板上；

按照质量体积比为2.0g:0.4g:8.0g:2.0g:0.5g:1mL:1000mL称取Na

将T线包被原料和C线包被原料通过包被缓冲液稀释至终浓度为0.7mg/mL，分别包被于硝酸纤维素膜作为检测线和质控线，37℃烘干3h后，密封常温保存。

（4）检测卡的组装过程：

先将金标垫盖住硝酸纤维素膜下部约1mm，再将样品垫沿PVC胶板下缘粘贴，盖住金标垫约2mm，组装成试剂板，最后裁切为试剂条装入卡壳的对应位置扣合，连同干燥剂装入铝箔袋，封口并粘贴对应标签。

样本处理液的配制：

按照质量体积比为1.5g:1.0g:0.1mL:0.05mL:0.05g:0.1mL:100mL称取Tris、NaCl、Triton x-100、S9、MgSO

实施例4

本实施例抗体表位配对信息如下：

T线标记原料表位选自序列NCBI 参考序列: YP_009724397.2（GenomicSequence: NC_045512.2），选择74-105aa；

T线包被原料表位选自序列NCBI 参考序列: YP_009724397.2（GenomicSequence: NC_045512.2），选择44-175aa；

本实施例提供了一种高灵敏度的新冠突变株检测试剂盒的制备方法包括检测卡的制备和样本处理液的配制，具体如下步骤：

检测卡的制备方法包括

（1）样品垫的制备：

按照质量体积比为2.0g:1.0g:0.1mL:0.1mL:0.1mg:100mL称取Tris、NaCl、Tritonx-100、S9、清洁抗体C4、超纯水，混匀后调pH值为7.2，配制得样品垫处理液；再将样品垫处理液按照30μL/cm

（2）金标垫的制备：

称取10%的胶体金4mL混于996mL超纯水，加热煮沸计时6min后，加入2%的柠檬酸三钠溶液23mL，待颜色转为酒红色至稳定开始计时，10min后关掉电源冷却配制得胶体金溶液；按照质量体积比为0.6g:0.5g:1.0g:0.3mL:0.1mL:100mL称取Tris、BSA、蔗糖、Tween-20、Proclin300、超纯水，混匀后调pH值为8.0，配制得胶体金复溶液。

称取100mL胶体金溶液，添加0.1M碳酸钾30mL，混匀后向其中添加T线标记原料或C线标记原料使其终浓度为10μg/mL，室温偶联1.5小时，再向其中加入BSA使其终浓度为1%，混匀，室温封闭1.0个小时，8000rpm 4℃离心30min，弃上清，80mL胶体金复溶液复溶，得到T线标记溶液和C线标记溶液。

按照体积比为1:9称取T线标记溶液和C线标记溶液，混匀得到金标垫处理液；再将金标垫处理液按照30μL/cm

（3）硝酸纤维素膜的包被：

将硝酸纤维素膜和吸水滤纸粘贴于PVC胶板上；

按照质量体积比为2.0g:0.4g:8.0g:2.0g:0.5g:1mL:1000mL称取Na

将T线包被原料和C线包被原料通过包被缓冲液稀释至终浓度为0.5mg/mL，分别包被于硝酸纤维素膜作为检测线和质控线，37℃烘干3h后，密封常温保存。

（4）检测卡的组装过程：

先将金标垫盖住硝酸纤维素膜下部约1.5mm，再将样品垫沿PVC胶板下缘粘贴，盖住金标垫约2mm，组装成试剂板，最后裁切为试剂条装入卡壳的对应位置扣合，连同干燥剂装入铝箔袋，封口并粘贴对应标签。

样本处理液的配制：

按照质量体积比为1.5g:1.0g:0.1mL:0.3mL:0.1g:0.1mL:100mL称取Tris、NaCl、Triton x-100、S9、MgSO

本发明的检测原理为：将待检样本加入到检测卡加样孔中，若样本中含有新冠病毒抗原，则与胶体金标记的标记抗体结合，该免疫复合物在毛细作用下沿检测卡向前移动，会与包被在检测区的包被抗体结合，形成红色的条带T线，指示新冠病毒抗原阳性，若不出线，说明样本为阴性或含量低于最低检测限。

利用实施例1-4制备得到的检测卡验证最低检出限以及重复性，不同表位抗体配对进行的最低检测限和重复性验证结果如下表1所示：

表1不同表位抗体配对进行的最低检测限和重复性验证

注：表1中“L1、L2、L3”表示企业最低检出限参考品，最低检测限不低于L2，L1为阳性，L2为阳性，L3为阴性；“J1、J2”表示企业重复性参考品，J1和J2的10次检测结果应均为阳性。

利用实施例1-4制备得到的检测卡和试剂盒对不同病例中的新冠病毒抗原进行快速检测并和PCR结果匹配，以评估检测卡和试剂盒的灵敏度和特异性。

通过在4个不同机构共测定1689例病例，进行抗原检测结果与核酸检测结果的比较，将采集病例样本后拭子立即置于样本处理液中旋转混匀至少30秒，并于外壁挤压拭子头至少5次，确保充分洗脱后滴入加样孔3~4滴，15~20min内判读结果，结果如下表所示，根据相应计算公式得出灵敏度为92.62%、特异性为99.63%、总符合率为97.10%。（如表2）

表2 抗原检测与核酸检测的比对结果

计算公式如下：

灵敏度（TPR/True Positive Rate）：真阳性样本在实际阳性样本中的占比；计算公式为：TPR=TP/(TP+FN)

特异性（TNR/True Negative Rate）：真阴性样本在实际阴性样本中的占比；计算公式为：TNR=TN/(FP+TN)

利用实施例1-4制备得到的试剂盒和检测卡对不同新冠病毒培养物进行快速检测，以评估试剂盒和检测卡的最低检出限。

样本：包含新冠原始株和突变株的灭活病毒培养物，用阴性样本进行梯度稀释，每个梯度的病毒稀释液重复3~5份，每份稀释液重复检测不少于20次，将具有95%阳性检出率的病毒水平作为最低检出限。

结果：浓度为50TCID

利用实施例1-4制备得到的检测卡对加入不同干扰药物以及不同交叉反应物的新冠病毒阳性样本和阴性样本进行快速检测，以评估试剂盒的抗干扰能力。

方法：选用常用的干扰药物和病原微生物，通过新冠病毒阳性样本和阴性样本分别进行稀释，并以未加入上述干扰药物和病原微生物的样本作为对照，进行快速检测。

结果表明：当样本中每种干扰物质的“最差条件”条件下，检测结果均符合要求，当样本中的地方性冠状病毒HKU1、冠状病毒OC43、冠状病毒NL63、冠状病毒229E、甲型H1N1（2009）流感病毒、季节性H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、禽流感病毒H5N1、禽流感病毒H7N9、乙型流感病毒（Yamagata）、乙型流感病毒（Victoria）、呼吸道合胞病毒、腺病毒1、2、3、4、5、7、55型、肠病毒A、B、C、D组、EB病毒、麻疹病毒、人巨细胞病毒、轮状病毒、诺如病毒、腮腺炎病毒和水痘-带状疱疹病毒≤10

综上，本发明标记原料和包被原料的筛选，使得双抗体夹心反应时，有更好的识别特性；且工艺简单，适宜大批量生产，并且原料配对更优，检测新冠原始株和新冠突变株灵敏度更高，更具有市场应用价值。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。