一种检测重金属的磁微粒化学发光试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术免疫学检测技术领域，尤其涉及一种检测重金属的磁微粒化学发光试剂盒。

背景技术

在重金属快速检测方法中，以抗原抗体反应为基础的快速检测方法有诸多研究，包括酶联免疫吸附法、生物芯片法等，大多需要包被、封闭、反应、孵育、洗板等复杂操作，而且均以人工操作为主，容易对实验结果引入人为误差，过程条件控制无法保证，限制了其在市场上的广泛推广与应用。因此，在面临多指标、多样品快速自动化检测的需求下，开发一种新型、快速、高灵敏、可自动化的重金属检测方法尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测重金属的磁微粒化学发光试剂盒，人工操作步骤大大减少，抗原抗体用量大幅减少，成本大大降低，可用于基层实验室对于重金属食品及制品的大范围筛选和检测，配合POCT检测平台，可实现重金属检测自动化。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种检测重金属的磁微粒化学发光试剂盒，包括如下组分：重金属抗原、抗重金属抗体、链霉亲和素包被的磁微粒、发光标记物偶联的抗IgG抗体、与发光标记物相适用的底物液、重金属基体标准溶液、反应稀释液以及洗涤液。

作为优选，所述重金属抗原和抗重金属抗体为生物素化重金属抗原和抗重金属抗体或重金属抗原和生物素化抗重金属抗体。

作为优选，所述生物素化重金属抗原为生物素和重金属抗原形成的复合物；所述重金属抗原由重金属、重金属螯合剂、载体蛋白偶联形成；所述生物素化抗重金属抗体为生物素和抗重金属抗体偶联形成复合物；

所述重金属螯合剂为乙二胺四乙酸、二乙基三胺五乙酸、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四羧酸、2-(4-氨基苄基)-二亚乙基三胺五乙酸、1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N,N,N,N-四乙酸中的一种或多种；所述载体蛋白为卵清蛋白、血清白蛋白或锁钥蓝蛋白；所述生物素化抗重金属抗体为生物素、抗重金属抗体形成的复合物。

作为优选，所述抗重金属抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，所述单克隆抗体或多克隆抗体经辛酸-硫酸铵法纯化。

作为优选，所述链霉亲和素包被的磁微粒由链霉亲和素与磁微粒偶联制备，所述磁微粒以四氧化三铁或三氧化二铁超顺磁性材料为内核，外围包覆聚苯乙烯或葡聚糖，通过物理或化学的方法活化使磁微粒表面产生氨基、甲苯磺酰基、羧基或环氧基基团；所述磁微粒的粒径为1～2μm。

作为优选，所述发光标记物偶联的抗IgG抗体中的发光标记物为碱性磷酸酶、吖啶酯或鲁米诺；所述发光标记物偶联的抗IgG抗体中的抗IgG抗体为抗重金属抗体同源生产的可识别的抗体，所述抗IgG抗体的浓度为0.01～1mg/mL。

作为优选，所述重金属基体标准溶液是由0～0.5mg/kg不同浓度梯度的匹配粮食有证标准物质，采用稀酸提取的方式制得的工作标准曲线；所述稀酸提取液为2～6％硝酸溶液。水样标准溶液是由0～2ng/mL不同浓度绘制成工作标准曲线。

所述反应稀释液由0.01～1mMTris缓冲液、0.01～1mM重金属螯合剂、0.08～0.12％吐温、0.4～0.6％牛血清白蛋白、0.01-1MpH调节剂组成，所述重金属螯合剂为乙二胺四乙酸、二乙基三胺五乙酸、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四羧酸、2-(4-氨基苄基)-二亚乙基三胺五乙酸、1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N,N,N,N-四乙酸中的一种或多种；所述pH调节剂为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、三羟甲基氨基甲烷及其盐酸盐、盐酸、硝酸中的一种或多种。

作为优选，所述试剂盒还包括反应管；所述反应管的材料为透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。

本发明提供了一种检测重金属的磁微粒化学发光试剂盒，所述试剂盒包括如下组分：重金属抗原、抗重金属抗体、链霉亲和素包被的磁微粒、发光标记物偶联的抗IgG抗体、与发光标记物相适用的底物液、重金属基体标准溶液、反应稀释液以及洗涤液。本发明以抗体为识别元件，以生物链霉亲和素为信号方法手段，借助磁微粒载体，将抗体与磁微粒偶联，利用抗原抗体特异性结合的原理，在磁微粒表面反应、转移，形成磁微粒抗体-抗原-抗IgG抗体-碱性磷酸酶复合物，最终以碱性磷酸酶催化化学发光底物产生化学发光。

此外，使用本发明试剂盒检测方法还具有以下优点：(1)检测速度快、稳定、无放射性污染，在没有磁微粒场存在的情况下，磁微粒悬浮在液体中，使得抗原-抗体反应类似于均相反应；磁微粒在外加磁微粒场的作用下可方便地分离、洗涤快速，可在20分钟内对至少8个样本进行检测结果的判断。(2)灵敏度高(方法检出限为0.04ng/mL)。(3)特异性强(与其他元素无交叉反应)。(4)精密度良好(回收率为88％～112％，RSD％<10％)。(5)本发明试剂盒及使用方法搭配POCT平台，可实现多通量自动化操作，大大提高了检测效率，简化了操作，减轻人员负担。(6)本发明试剂盒的有效期，经37℃加速稳定性及2-8℃真实稳定性试验证实，本产品在37℃可存放7天以上，在2-8℃至少可存放14个月。(6)成本低，与市场上基于免疫方法的同类产品比较，本试剂盒性能良好，成本低，具有实际应用价值。

附图说明

图1为本发明的原理图；

图2为水中镉元素的标准曲线；

图3为粮食基体中铅元素的标准曲线；

图4为试剂盒的结构示意图；

图5为试剂盒的成品图。

具体实施方式

本发明提供了一种检测重金属的磁微粒化学发光试剂盒，包括如下组分：重金属抗原、抗重金属抗体、链霉亲和素包被的磁微粒、发光标记物偶联的抗IgG抗体、与发光标记物相适用的底物液、重金属基体标准溶液、反应稀释液以及洗涤液。

在本发明中，所述重金属抗原和抗重金属抗体为生物素化重金属抗原和抗重金属抗体或重金属抗原和生物素化抗重金属抗体。

在本发明中，所述生物素化重金属抗原为生物素和重金属抗原形成的复合物。

在本发明中，所述重金属抗原由重金属、重金属螯合剂、载体蛋白偶联形成。

在本发明中，所述生物素化抗重金属抗体为生物素和抗重金属抗体偶联形成复合物。

在本发明中，所述重金属螯合剂为乙二胺四乙酸、二乙基三胺五乙酸、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四羧酸、2-(4-氨基苄基)-二亚乙基三胺五乙酸、1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N,N,N,N-四乙酸中的一种或多种。

在本发明中，所述载体蛋白为卵清蛋白、血清白蛋白或锁钥蓝蛋白。

在本发明中，所述生物素化抗重金属抗体为生物素、抗重金属抗体形成的复合物。

在本发明中，所述抗重金属抗体优选为单克隆抗体或多克隆抗体，进一步优选为单克隆抗体。

在本发明中，所述单克隆抗体或多克隆抗体的浓度优选为0.01～0.2μg/mL，进一步优选为0.05～0.15μg/mL，再进一步优选为0.1μg/mL。

在本发明中，所述单克隆抗体或多克隆抗体优选经辛酸-硫酸铵法纯化。

在本发明中，所述链霉亲和素包被的磁微粒由链霉亲和素与磁微粒偶联制备。

在本发明中，所述磁微粒以四氧化三铁或三氧化二铁超顺磁性材料为内核，外围包覆聚苯乙烯或葡聚糖，通过物理或化学的方法活化使磁微粒表面产生氨基、甲苯磺酰基、羧基或环氧基基团。

在本发明中，所述磁微粒的粒径优选为1～2μm。

在本发明中，所述发光标记物偶联的抗IgG抗体中的发光标记物优选为碱性磷酸酶、吖啶酯或鲁米诺，进一步优选为碱性磷酸酶。

在本发明中，所述发光标记物偶联的抗IgG抗体中的抗IgG抗体优选为抗重金属抗体同源生产的可识别的抗体。

在本发明中，所述抗IgG抗体的浓度优选为0.01～1mg/mL，进一步优选为0.5mg/mL。

在本发明中，所述重金属基体标准溶液是由不同浓度梯度的匹配粮食有证标准物质，采用稀酸提取的方式制得的工作标准曲线。

在本发明中，所述重金属基体标准溶液是由0，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mg/kg不同浓度梯度的匹配粮食有证标准物质。

在本发明中，所述水样标准溶液是由0，0.03，0.06，0.12，0.25，0.5，1，2ng/mL不同浓度绘制成工作标准曲线。

在本发明中，所述稀酸提取液优选为2～6％硝酸溶液，进一步优选为5％硝酸溶液。

在本发明中，所述反应稀释液优选为：0.01～1mMTris缓冲液、0.01～1mM重金属螯合剂、0.08～0.12％吐温-20、0.4～0.6％牛血清白蛋白、0.01-1MpH调节剂。

在本发明中，所述重金属螯合剂优选为乙二胺四乙酸、二乙基三胺五乙酸、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四羧酸、2-(4-氨基苄基)-二亚乙基三胺五乙酸、1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N,N,N,N-四乙酸中的一种或多种，进一步优选为0.08～0.12mM1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N,N,N,N-四乙酸，进一步优选为0.1mM1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N,N,N,N-四乙酸。

在本发明中，所述pH调节剂优选为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、三羟甲基氨基甲烷及其盐酸盐、盐酸、硝酸中的一种或多种。

在本发明中，所述洗涤剂优选为0.01～0.02MTris-HCl缓冲液和0.1～0.2％吐温-20。

在本发明中，所述试剂盒优选还包括反应管。

在本发明中，所述反应管的材料优选为透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1定量检测重金属磁微粒化学发光试剂盒的组成

组建定量检测重金属的磁微粒化学发光试剂盒，使其包括下列组分：

(1)抗原；

(2)生物素标记的抗体；

(3)碱性磷酸酶标记的二抗；

(4)链霉亲和素标记的磁珠；

(5)洗涤液为含0.1％的吐温-20、0.01MTris-HCl缓冲液；

(6)反应稀释液为含0.1％的吐温-20、0.1MTris、0.1mMITCBE的缓冲液；

(7)碱性磷酸酶化学发光底物。

实施例2生物素标记抗体的制备

预先将生物素用二甲基亚砜溶解至1mg/mL，将生物素-二甲基亚砜溶液与重金属抗体按质量比1:10进行混合，控制体积在100μL以内，加入碳酸盐缓冲溶液将体积补足至150μL，37℃条件下孵育1h，反应完后将溶液使用50kDa超滤管超滤换液。最终所得抗体浓缩液收集在50mMpH7.34-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、0.5％月桂醇聚氧乙烯醚、50mM氯化钾、2％蔗糖、4％精氨酸、0.2％Proclin-300中，生物素标记的重金属抗体的终浓度为2μg/mL。

实施例3碱性磷酸酶标记二抗的制备

碱性磷酸酶在0.1M磷酸盐缓冲液中室温透析3小时，然后将碱性磷酸酶用0.1M磷酸盐缓冲液稀释成5mL；称取一定量的LV-SMCC，用DMF稀释成5mg/mL，混匀，每毫升碱性磷酸酶中加入100μL5mg/mLLC-SMCC溶液，室温反应30分钟。然后再含0.5M羟胺，25mMEDTA的0.1M磷酸盐缓冲液中透析4小时，反应结束后4℃保存备用。

将上述反应后的碱性磷酸酶与活化的二抗按照摩尔比1：1进行混合链接，4℃反应20小时后反应结束。

实施例4链霉亲和素标记磁珠的制备

羧基磁珠在0.01M磷酸盐缓冲液中磁分离2次，去掉保存液中组分，然后取1mL0.1M磷酸盐缓冲液重悬，加入现配现用的5mg/mL的EDC/HNS溶液37℃搅拌反应2小时，活化磁珠表面的羧基；再次用0.01M磷酸盐缓冲液洗涤2次，去除未反应的成分；将活化后的磁珠按1：1(v:v)的比例加入到链霉亲和素溶液中，室温搅拌孵育4小时，0.01M磷酸盐缓冲液洗涤3次后加入0.5mL0.01M磷酸盐缓冲液重悬磁珠即可得到链霉亲和素标记的磁珠。

实施例5定量检测重金属磁微粒化学发光试剂盒的形式

将有关试剂预装至预制试剂盒中，以简化实验操作，实现自动化检测，降低人工干扰，提高工作效率。

其中，试剂盒的1号孔为样品孔，2号孔为洗涤液孔，3号孔为酶标二抗孔，4号孔为链霉亲和素磁珠孔，5号孔为生物素标记的抗体孔，6号孔为抗原孔，7号孔稀释液孔，8号孔为底物液孔，9号孔为反应孔，10-12号孔为洗涤孔，13孔为读数孔。

实施例6重金属磁微粒化学发光试剂盒的定量检测步骤

试剂转移和反应步骤为：

(1)将底物液转移至底物孔；(2)将样品、生物素标记抗原、稀释液、抗重金属抗体转移至反应孔，反应一定时间；(3)将酶标二抗、链霉亲和素磁珠转移至反应孔，反应一定时间；(4)将洗涤液等分至洗涤孔，在磁力作用下将反应孔的反应复合物依次转移至洗涤孔中洗涤3次；(5)最后转移至底物孔进行读数。

实施例7液体样品中重金属残留的检测(无需样品前处理)

(1)试剂盒检测

向样品孔中加入50μL液体样品(含镉元素)，在反应孔中将样品、生物素标记抗原、抗体、酶标二抗、链霉亲和素磁珠混匀，反应10分钟，在洗涤孔洗涤后，加入到读数孔中，与150μL底物液反应，直接在化学发光平台上测定发光强度。

(2)结果分析

绘制标准曲线，相对应的样品中重金属的浓度可以从标准曲线上读出。

实施例8粮食中重金属残留的检测

(1)样品的制备

准确称取1g样品，加入30mL5％硝酸，振荡提取10分钟后，静置3分钟，取上清液备用。

(2)试剂盒检测

向样品孔中加入50μL样品上清液，在反应孔中将样品、生物素标记抗体、抗原、酶标二抗、链霉亲和素磁珠混匀，反应10分钟，在洗涤孔洗涤后，加入到读数孔中，与150μL底物液反应，直接在化学发光平台上测定发光强度。

(3)结果分析：绘制标准曲线，相对应的样品中重金属的浓度可以从标准曲线上读出。

实施例9试剂盒稳定性、灵敏度、特异性实验

(1)试剂盒稳定性实验

试剂盒37℃下保存，进行加速破坏稳定性试验测试，连续测试7天10ng/mL的标准溶液，测试结果稳定性结果见表1，根据经验在37℃下保存1天相当于4℃下保存2个月，即本试剂盒在4℃下保存时间至少为12个月，不影响使用。

表1试剂盒加速稳定实验

(2)试剂盒灵敏度分析

采用零点算法，以大米中的铅元素为例，做20个空白零点，求其平均值和标准差，得出灵敏度，20个空白所得含量如表2。计算其检出限为3.9μg/kg，定量限为9.2μg/kg。

表2粮食基体检出限与定量限分析

/>

采用标准曲线算法，以水中镉元素为例，绘制0，0.03，0.06，0.12，0.25，0.5，1，2ng/mL不同浓度下的标准曲线，以IC

表3水溶液标准曲线及检出限与定量限计算

(3)试剂盒特异性分析

使用标准溶液测试试剂盒的特异性，分别与其他离子进行交叉反应，反应结果如表4。与其他非目标离子均无交叉反应。

表4交叉反应分析

实施例10试剂盒所用其他方法比较

与传统酶联免疫法、胶体金免疫层析试纸条法在反应步骤、反应时间、抗原抗体用量上的比较，表5说明本发明的试剂盒方法步骤简单、检测时间短、抗原抗体用量少，成本低，可实现自动化检测。

表5本发明与酶联免疫法和胶体金免疫层析试纸条法的比较

由以上实施例可知，本发明提供了一种检测重金属的磁微粒化学发光试剂盒及其使用方法，所述试剂盒包括如下组分：重金属抗原、生物素化抗重金属抗体、链霉亲和素包被的磁微粒、发光标记物偶联的抗IgG抗体、与发光标记物相适用的底物液、重金属基体标准溶液、反应稀释液以及洗涤液。本发明的试剂盒采用磁微粒化学发光检测方法，具有高灵敏、高特异性、高准确度的特点，与传统ELISA方法和胶体金免疫层析试纸条方法相比，可实现自动化检测，人工操作步骤大大减少，抗原抗体用量大幅减少，成本大大降低，可用于基层实验室对于重金属食品及制品的大范围筛选和检测。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。