一种紫苏醇提物复合可食性乳液的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及可食性乳液制备技术领域，尤其涉及一种Z/C-LEP的可食性乳液的制备方法及应用。

背景技术

主要的全球挑战，如饥荒、公共卫生紧急情况、快速的气候变化等，都与世界范围内严重的粮食浪费密切相关。这个问题在水果和蔬菜等新鲜产品中尤为突出，每年约有40-50％的田间生产的作物被浪费掉。而近年来随着发展，预制菜行业逐渐兴起。但是伴随着农业发展的同时，各种果蔬的储存成为限制行业发展的一大因素。影响新鲜食品腐烂的因素很多，主要是脱水、呼吸道代谢和微生物生长。适当地在水果和其他农产品上涂上一层薄薄的可食用涂层以延长其保质期，是缓解腐败挑战的一个有吸引力的选择。

近年来，多糖、蛋白质、脂类、壳聚糖和藻酸盐等天然材料已被越来越多地用于水果和蔬菜的采后保存。玉米醇溶蛋白是一种可食用的酒精蛋白，由于其良好的生物降解性和生物相容性，可以作为药物载体和膳食补充剂。然而，有研究表明，只用玉米醇溶蛋白制备的纳米颗粒没有任何修饰，容易聚集并呈现爆裂效应(嵌入的材料在短时间内迅速从颗粒中释放，表明其吸收能力低)。为了克服这些障碍，可以用多糖作为胶体稳定剂来包裹玉米蛋白颗粒，所得到的玉米蛋白颗粒在消化过程中对爆裂效应表现出积极作用。壳聚糖(CS)作为一种阳离子多糖，由于其在食品加工中的巨大潜力而引起了人们的极大兴趣。已有研究表明，CS是玉米醇溶蛋白纳米颗粒的优秀稳定剂，提供空间位点阻力和静电稳定，有效防止玉米醇溶蛋白在中性条件下和干燥后的聚集。因此，玉米醇溶蛋白与壳聚糖一起可以制备成纳米颗粒，并容易配制成用于水果和蔬菜保存的可食用乳液。

由于抗菌活性差或没有抗菌活性，天然聚合物的保存效果很差，而且当单独使用时，所有开发的材料都没有表现出独特的特性。因此，通常需要添加抗菌活性成分来提高天然聚合物材料的抗菌活性。化学防腐剂，如杀真菌剂、杀虫剂和无机盐，因其对微生物的高效抗菌活性而被广泛用于食品工业。然而，化学试剂的添加对人体有潜在的危害。因此，由于人们对食品安全和人类健康越来越关注，从天然产品中提取的防腐剂正变得越来越受欢迎。最近，研究人员广泛关注使用具有抗菌活性的天然产品来替代食品保鲜中的化学杀菌剂，如酚类、甲壳素和植物精油。

紫苏叶已被确定为具有高含量的挥发性物质，主要在亚洲国家种植。紫苏是一种可食用的蔬菜，用于沙拉、寿司和汤，以及腌制和装饰品。紫苏叶因其抗氧化、抗糖尿病、抗过敏、抗菌、抗肿瘤和抗癌的特点而被传统地使用，这是因为其酚类化合物、迷迭香酸、花青素、精油、维生素和矿物质。然而，单一的天然产品提取物的作用是有限的，与其他物质一起作用可以实现诱导增效作用。从山茶树(绿茶)叶片中分离出来的表没食子素-3-棓酸盐(EGG)被认为是这种植物中最丰富的多酚，并呈现出多种治疗特性，如强烈的螯合和抗氧化活性。然而，多酚在相对较高的温度、氧气浓度和pH值下容易被氧化。此外，多酚类物质对革兰氏阳性细菌的效果较差，因为它们的细胞壁多糖明显阻碍了渗透性。溶菌酶(Lys)，它是一种细胞酶和小型阳离子蛋白，可以通过催化水解细菌细胞壁中N-乙酰氨基甲酸和N-乙酰-D-氨基葡萄糖残基之间的β-1,4-链接来损害或杀死细菌。溶菌酶已证明对革兰氏阳性细菌有积极的抗菌作用。加入溶菌酶不仅可以提高抗菌性，而且还可以作为天然抗氧化剂的有效传递载体。

因此，本发明利用玉米醇溶蛋白和壳聚糖作为封装载体，制备了一种负载溶菌酶、EGCG和紫苏醇提物的多功能可食性乳液，用于果蔬的保鲜。溶菌酶的加入增强了紫苏醇提物对革兰氏阳性病原体的抗菌活性。进一步添加EGCG增强了紫苏醇提物的抗氧化性能。此外，这种可食性乳液在室温下的缓释性能够使所制备的多功能可食性乳液在水果和蔬菜储存中具有较好的保鲜潜在应用。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种Z/C-LEP的可食性乳液的制备方法及应用。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种Z/C-LEP的可食性乳液，以玉米醇溶蛋白(zein)和壳聚糖(CS)混合溶液(Z/C)为基底，将溶菌酶、EGCG、紫苏醇提物作为填料添加到玉米醇溶蛋白和壳聚糖混合液中。

一种Z/C-LEP可食性乳液的制备方法，包括以下步骤：

(1)将玉米醇溶蛋白分散于70％乙醇水溶液，磁力搅拌10min最后得到玉米醇溶蛋白分散液；

(2)将壳聚糖分散于1％的乙酸水溶液，磁力搅拌10min最后得到壳聚糖分散液；

(3)将步骤(1)和步骤(2)中得到的玉米醇溶蛋白分散液和壳聚糖分散液混合，450W超声处理5min，75℃水浴30min，最后4℃冷却结束反应，得到玉米醇溶蛋白和壳聚糖的混合溶液(Z/C)；

(4)将0.1g/L溶菌酶添加到步骤(3)得到的Z/C溶液中，磁力搅拌5min得到Z/C-L分散液；

(5)将1g/LEGCG添加到步骤(4)得到的Z/C-L分散液，磁力搅拌5min得到Z/C-LE分散液；

(6)将150mg/L紫苏醇提物添加到步骤(5)得到的Z/C-LE分散液，磁力搅拌5min得到Z/C-LEP分散液；

(7)将1g/L EGCG和150mg/L紫苏醇提物添加到步骤(3)得到的的Z/C溶液中，磁力搅拌5min得到Z/C-EP分散液；

(8)将步骤(3)——步骤(6)所述的溶液在60℃下搅拌，将加热后的溶液倒入特氟隆盒中，干燥，最终得到不同种类的可食性乳液抗菌膜材料以备后续试验。

优选地，步骤(3)中，玉米醇溶蛋白与壳聚糖的质量比例为(1-10:1)。

优选地，步骤(4)中，溶菌酶与Z/C的质量比例为(1-10:800)。

优选地，步骤(5)中，EGCG与Z/C-L的质量比例为(1-5:800)。

优选地，步骤(6)中，紫苏醇提物与Z/C-LE的质量比例为(1-10:800)。

上述的可食性乳液应用在包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌在内的病原菌的抗菌中。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明所述的可食性乳液，在室温下具备良好的缓释效果以及双向协同机制增强的抗菌和抗氧化性能。Z/C-LEP可食性乳液在对果蔬保鲜上具有较好的可洗性和广泛的保鲜性，具有在果蔬保鲜领域上的潜在应用；

2、本发明采用自组装制备的Z/C-LEP可食性乳液，操作简便，易于批量生产；

3、本发明制备Z/C-LEP可食性乳液对革兰氏阳性菌-金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌-大肠杆菌均有优异的抗菌效果，在对果蔬应用上对霉菌也有显著的抑制效果。显示该可食性乳液在抑制细菌感染、食品卫生安全等领域具有应用价值。

附图说明

为了更具体直观地说明本发明实施例或者现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简要介绍。

图1为Z/C、Z/C-L、Z/C-LE、Z/C-LEP(a)的可食性乳液SEM(电镜分析)照片，Z/C、Z/C-L、Z/C-EP、Z/C-LE、Z/C-LEP可食性乳液的粒径和PDI(b)及Zeta电位(c)，Z/C、Z/C-L、Z/C-LE、Z/C-LEP的FT-IR(d)，Z/C-EP、Z/C-LE、Z/C-LEP的UV-Vis(e)；

图2为Z/C-EP、Z/C-LE、Z/C-LEP放置一月后的多酚含量(a)，Z/C-EP、Z/C-LE、Z/C-LEP的多酚释放曲线(b)，Z/C、Z/C-L、Z/C-LE、Z/C-LEP的核酸泄露(c)、抗菌活性(d)及对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈(e-f)；

图3中为Z/C、Z/C-L、Z/C-LE、Z/C-LEP分别对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌产生LDH(a)和ROS(b)

图4为Z/C、Z/C-L、Z/C-LE、Z/C-LEP对DPPH自由基的清除率；

图5为Z/C、Z/C-L、Z/C-LE、Z/C-LEP对草莓的保鲜效果(a)，失重率(b)，可滴定酸含量(c)及Vc含量(d)；

图6为选取圣女果为模型，Z/C-LEP的可洗性(a)以及对果蔬的广泛保鲜应用(b)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

一种Z/C-LEP的可食性乳液，以玉米醇溶蛋白(zein)和壳聚糖(CS)混合溶液(Z/C)为基底，将溶菌酶、EGCG、紫苏醇提物作为填料添加到玉米醇溶蛋白和壳聚糖混合液中。

一种Z/C-LEP的可食性乳液的制备方法，包括以下步骤：

(1)玉米醇溶蛋白和壳聚糖基底溶液的制备：

25mL的70％乙醇溶液溶解0.5g玉米醇溶蛋白，制备出20g/L玉米醇溶素溶液。用25mL的1％乙酸溶液溶解0.5g玉米醇溶蛋白，制备出20g/L壳聚糖溶液。将它们1:1(m:m)混合。450W超声处理5min，75℃水浴30min，在4℃下冷却结束反应，获得玉米醇溶蛋白和壳聚糖的混合溶液(Z/C)；

(2)可食性乳液的制备：

将0.1g/L的溶菌酶，添加到Z/C中，磁力搅拌5min，获得玉米醇溶蛋白、壳聚糖和溶菌酶的混合物(Z/C-L)。将1g/L的EGCG和150mg/L的紫苏醇提取物以相同的方式添加以获得Z/C-LE和Z/C-LEP。没有溶菌酶的混合体系被命名为Z/C-EP；

(3)可食性乳液膜材料的制备：

根据所谓的流延技术制备薄膜。将(2)所得的可食用乳液涂料浇铸在10×10cm的塑料板上，在60℃下干燥，从塑料板上去除薄膜，在25℃和50％相对湿度(RH)下调节，备用。

Z/C-LEP的可食性乳液的表征与性能研究及食品保鲜测试：

1.电镜分析(SEM)、粒径、电位分析(附图1)：

采用扫描电子显微镜(TM300,Japan)对本实例制备得到的Z/C(Ⅰ)、Z/C-L(Ⅱ)、Z/C-LE(Ⅲ)、Z/C-LEP(Ⅳ)进行形貌观察分析，结果见附图1(a)：

图1(a)为本实例中Z/C、Z/C-L、Z/C-LE、Z/C-LEP形貌的扫描电镜照片，通过图1(a)可以观察到Z/C、Z/C-L、Z/C-LE、Z/C-LEP褶皱结构，呈层状。

采用Zeta电位仪(Nano ZS 3690,U.K.)对本实例中的乳液进行粒径，PDI及电位分析。液滴的大小分布的电位是评价乳化效果和乳液稳定性的一个关键因素结果见附图1(b-c)：。

图1(b)为本实施例中所制备的Z/C、Z/C-L、Z/C-EP、Z/C-LE、Z/C-LEP的粒径和多分散性指数。

图1(c)为本实施例中所制备的Z/C、Z/C-L、Z/C-EP、Z/C-LE、Z/C-LEP的电位。

2.FT-IR和UV-Vis分析(附图1)

采傅里叶红外光谱仪(Thermo Scientific Nicolet Is5,USA)和UV-Vis(UV1200,China)对本实例所制备的Z/C、Z/C-L、Z/C-LE、Z/C-LEP进行官能团和最大波长吸收峰的表征，结果见附图1(d-e)：

Z/C、Z/C-L、Z-C-LE和Z/C-LEP的代表性光谱如图1d所示。波数峰值约为2934cm

3.多酚含量和缓释性实验(附图2)：

图2(a)给出了可食用乳液放置一个月后的总酚含量。与添加溶菌酶的Z/C-LEP相比，放置一个月后，未添加溶菌酶的可食性乳液的多酚含量显著降低。这可能是因为多酚与食物成分(如蛋白质)的相互作用可能导致显著的聚集和沉淀，导致多酚的功能或数量损失。我们推测，溶菌酶的添加对总酚稳定性有显著影响，EGCG和紫苏醇提物的联合应用显示出抗氧化协同作用，这受溶菌酶包封的影响。有人建议，添加溶菌酶可以延长浸渍和微氧化时间，以提高红葡萄酒的颜色稳定性和多酚提取。天然活性成分与溶菌酶的组合会影响溶菌酶活性和稳定性，以及活性成分的生物活性，如抗氧化活性。因此，溶菌酶可以用作天然抗氧化剂的有效递送载体。

选择Z/C-LE、Z/C-EP和Z/C-LEP可食性乳液来测试室温下多酚的释放。在12h内，Z/C-EP和Z/C-LEP的缓释趋势接近相同，达到23.84％如图2(b)，而Z/C-LE达到15.23％。12h后，Z/C-EP和Z/C-LEP的多酚释放趋势逐渐分离。122h时，三种可食性乳液的释放达到平衡，其中Z/C-LEP中多酚的释放量可达84.72％，Z/C-EP和Z/C-LE中多酚释放量分别达到68.98％和55.07％。显然，在室温下，Z/C-LEP中多酚的控制释放可以达到很长时间，具有高效和持续的抑菌效果。

4.抗菌实验(附图2)：

(1)一级种子液的制备：分别取实验室中保藏的革兰氏阳性菌—金黄色葡萄球菌以及革兰氏阴性菌—大肠杆菌各100μL，放置于100mL LB液体培养基(包含5g/L酵母粉，5g/L氯化钠，10g/L蛋白胨)中，恒温振荡培养14h(37℃，220rpm)，得到一级种子液。

(2)二级种子液的制备：从(1)得到的两种一级种子液中各取100μL分别转接于新的100mL LB液体培养基中，得到二级种子液。

(3)核酸泄露的测定：使用微孔板阅读器(51119500C，USA)在260nm的吸光度下测试核酸的损失。将可食用乳液加入含有大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的试管中，并在磷酸盐缓冲溶液中孵育4h(37℃)。以8000rpm离心10min并除去沉淀物。测量并记录上清液在260nm处的吸光度。没有可食性乳液的样品用作对照。260nm处光密度的变化揭示了细胞内物质的核酸。如图2(c)所示，在可食用乳液处理后，260nm处的值均增加，其中Z/C-LEP增加最多。在样品处理后，260nm处的值对于金黄色葡萄球菌增加了12.68％，对于大肠杆菌增加了7.77％。这表明，Z/C-LEP处理后，金黄色葡萄球菌的DNA和RNA更多地泄漏出细胞，类似于图2(d)中的抗菌活性趋势。表明Z/C-LEP对金黄色葡萄球菌有较好的抗菌作用。

(4)抗菌母液的制备及细菌活性测定：称取Z/C、Z/C-L、Z/C-LE、Z/C-LEP各0.1g加入(2)中所得到的二级种子液中，与细菌共同培养，恒温振荡培养12h(37℃，220rpm)，得到抗菌母液，并设置空白对照。在600nm处测量混合溶液的吸光度。所有实验都进行了三次。参考等式1计算细菌活性。

细菌活性＝Abs/Absc×100％ (1)

其中Abs是样品的吸光度值，Absc是含有细菌悬浮液和LB培养基且未添加样品的对照组的吸光度。

如图2(d)所示，Z/C的细菌活性最高(约86％)，Z/C-LEP的细菌活性最低(约40％和28％)，而Z/C-L和Z/C-LE的细菌活性均为50％-80％。这表明紫苏醇提物的抗菌活性相对较强。添加溶菌酶对抑制金黄色葡萄球菌有显著效果。

(5)抑菌圈测定：通过抑菌圈试验进一步的评估Z/C-LEP的抗菌活性。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌被用作试验的模型细菌。首先，将(2)中所得到的大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的细菌悬浮液(200μL，10

5.抗菌活性机理实验(附图3)：

从图(3)LDH和ROS的柱状图可以看出，本实施例中制备的Z/C、Z/C-L、Z/C-LE和Z/C-LEP，如图3(a)所示，暴露于不同材料会按以下顺序增加大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细胞中LDH的释放：Z/C-LEP>Z/C-LE>Z/C/L>Z/C。此外，暴露于不同材料诱导两种细菌产生ROS的顺序如下如图3(b)所示：Z/C-LEP>Z/C-LE>Z/C/L>Z/C。不仅如此，LDH和ROS的释放在金黄色葡萄球菌中比在大肠杆菌中更多。这些结果清楚地表明，与其他组分可食性乳液相比，Z/C-LEP对细菌细胞的毒性更大，诱导更强烈的ROS产生，并降低细菌活力，而其他组分的可食用乳液对金黄色葡萄球菌更有效。这与现有研究一致，即酚类化合物与细菌细胞壁相互作用，导致细胞壁破裂和细胞内容物释放，并且还可以通过诱导ROS的形成诱导细菌细胞中的内源性氧化应激。

6.抗氧化性研究(附图4)：

如图5所示，即使在不含EGCG和玉米醇溶蛋白的可食用乳液中也观察到一些抗氧化活性；这可能是壳聚糖和玉米醇溶蛋白本身抗氧化活性的结果。而Z/C-LE和Z/C-LEP对DPPH自由基的清除能力较高。EGCG是茶中儿茶素的主要成分，具有很强的抗氧化活性。紫苏的加入增强了DPPH自由基的清除能力。紫苏的抗氧化活性可能与酚类和花青素含量有关。紫苏提取物被认为是一种出色的自由基清除剂，也是营养药物和功能性食品成分的天然来源，具有一些医疗用途。这些结果表明EGCG和紫苏醇提物具有协同抗氧化活性。同时，我们观察到Z/C-LEP的抗氧化性高于其他组的可食用乳液，达到70.41％。然而，它没有很高的抗氧化能力。这主要是由于参与多酚和溶菌酶结合的羟基被屏蔽，这可能是其抗氧化活性降低的原因。

7.选取Z/C-LEP可食性乳液包裹草莓，放置21天的质量损失柱状图(a)以及总酸滴定柱状图(b)(附图5)

基于上述实验结果，我们评估了可食性乳液在草莓中的保鲜效果。在储存期间，仔细观察和监测草莓外观的变化。储存20天后，未涂层草莓的外观显示腐烂和发霉，而涂层样品的外观保持良好如图5(a)。此外，在4℃下，裸草莓的重量减少了约16％，而不同涂层草莓在保存期结束时的重量损失低于对照组，Z/C-LEP保持在原始重量的约90％以上如图5(b)。为了进一步了解不同涂层对草莓保鲜的影响，我们通过两个化学质量指标，可滴定酸度和Vc，进一步评估了可食性乳液的保鲜效果。

贮藏期间可滴定酸度的降低可能是由于代谢变化，例如在水果呼吸过程中产生的有机酸。保存期结束时草莓可滴定酸度的变化如图5(c)所示。与对照组相比，Z/C和Z/C-L之间的可滴定酸度差异不显著。相比之下，Z/C-LE和Z/C-LEP的可滴定酸度与对照组有显著差异，其中Z/C-LEP的可滴定酸度高于Z/C-LE。

水果在贮藏过程中Vc的损失是由于抗坏血酸与空气中的氧气结合时自发发生的自氧化。如图5(d)所示，对照的Vc含量小于8mg/100g，而包衣草莓的Vc浓度均高于对照组。Z/C、Z/C-L、Z-C-LE和Z/C-LEP的Vc含量分别为27.3、67.2、78.8和95mg/100g。结果表明，可食用乳液的涂层可以作为保护层来控制O

8.Z/C-LEP可食性乳液的可洗性和保鲜的广泛应用性(附图6)

因为消费者可能更喜欢没有涂层的水果的味道。为了证明膜的可洗性，将具有Z/C-LEP保护层的圣果浸入去离子水中。10s后，Z/C-LEP开始从圣果上脱落到去离子水中，这表明Z/C-LEP具有良好的可洗性如图6(a)。结果表明，作为一种水果保鲜膜，它可以通过用水冲洗很容易地从水果表面去除。这进一步说明，与目前使用的不可清洗蜡涂层相比，通过用水冲洗并在表面上轻轻摩擦，可以很容易地从水果皮上去除涂层。

为了探索Z/C-LEP对其他水果和蔬菜的新鲜度影响，我们选择了番茄和红椒、蘑菇、花椰菜和牛油果作为保存对象如图6(b)。在14天的保质期后，可以看到所有未涂覆的蔬菜都发霉和皱折了。涂有Z/C-LEP的蔬菜保持良好状态。类似地，在储存7天后，发现未涂覆的牛油果氧化并变黑，并发现在切割后失水并干燥。然而，有涂覆的牛油果仍然保持着良好的形状。切割后发现了发黑的部分，尽管有一层保护膜可以阻挡空气，但这种切割后不易保存的水果在7天的保存期后仍然会出现了质量问题。总的来说，Z/C-LEP乳液涂层的水果和蔬菜的保存期比对照组更好，这表明这种可食用乳液对水果和蔬菜具有更好的保存效果。

本发明采用玉米醇溶蛋白和壳聚糖为递送系统，溶菌酶、EGCG和紫苏醇提物通过氢键和静电结合被成功负载。构建了具有协同抗菌和协同抗氧化的双协同可食用乳液体系。结果表明，Z/C-LEP具有良好的缓释、抗菌和抗氧化性能。水洗性也会降低食品安全性，以及与可食性乳液会带来的相关潜在风味问题。对草莓进行了为期20天的水果新鲜度研究，证实该可食性乳液的配方保持了草莓的新鲜度和外观。为了进一步测试可食性乳液的应用，对不同的水果和蔬菜进行了保鲜实验，结果表明保鲜效果良好。由于用于制造乳液的材料是可食用的和丰富的，可食用乳液有望成为水果和蔬菜保鲜的有效策略。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。