一种人工湿地生物膜健康状况和堵塞程度的监测方法

技术领域

本发明涉及污水处理技术领域，具体涉及一种人工湿地生物膜健康状况和堵塞程度的监测方法。

背景技术

生物膜广泛存在于人工湿地系统中。湿地基质的表面为生物膜的发育形成提供了巨大的附着表面，而生物膜的发育程度与湿地系统的处理效率也密切相关。进入人工湿地中的污染物的吸附、降解和转化都是由生物膜来完成的。因此，生物膜的健康状态决定着人工湿地污染物处理效能。此外，人工湿地生物堵塞是指由于生物膜中微生物代谢过程中分泌大量胞外聚合物与水体中的有机物形成高含水量、低密度的胶状淤泥而堵塞基质床的现象。因此，基质堵塞形成根本原因是生物膜的过度生长。及时观测湿地系统堵塞程度，以采取防止措施、保证湿地水处理效能稳定及降低能耗，保证下游水体生态健康具有重要意义。

目前，常用的判断湿地系统生物膜健康状态的方法主要是检测其内部微生物群落结构及活性；检测堵塞的技术有渗透系数法、示踪法、数值模型法等。这些方法均可有效判断人工湿地生物膜健康状态及堵塞程度，但并没有很好的将生物膜健康状态和湿地堵塞有机结合在一起进行人工湿地系统效能诊断的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人工湿地生物膜健康状况和堵塞程度的监测方法，以准确判断人工湿地生物膜健康状况和人工湿地的堵塞程度，及时发现人工湿地运行问题。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种人工湿地生物膜健康状况和堵塞程度的监测方法，包括以下步骤：

采用磷酸盐缓冲液剥离人工湿地基质表面的生物膜，获得第一生物膜剥离液；

将第一生物膜剥离液进行冷冻离心，去除上清液，再次加入磷酸盐缓冲液，获得第二生物膜剥离液；

向第二生物膜剥离液中加入甲醛溶液和氢氧化钠溶液，振荡静置，冷冻离心，获得上清液；

将获得的上清液过滤，获得滤液；

测定滤液中的总蛋白含量和多糖含量，滤液中的总蛋白含量即生物膜胞外聚合物中的总蛋白含量，滤液中的多糖含量即生物膜胞外聚合物中的多糖含量；

对人工湿地基质表面的生物膜进行染色，然后进行荧光扫描，获得生物膜中蛋白质、多糖和脂类的荧光信号强度，根据荧光信号强度获得生物膜厚度；

根据总蛋白含量、多糖含量和生物膜厚度，判断人工湿地生物膜健康状况和堵塞程度。

优选的，采用磷酸盐缓冲液剥离人工湿地基质表面的生物膜，获得第一生物膜剥离液，具体包括：

将人工湿地基质置于磷酸盐缓冲液中，在18～22℃的水浴条件下振荡，使得人工湿地基质表面的生物膜被剥离至磷酸盐缓冲液中，获得第一生物膜剥离液，所述人工湿地基质与磷酸盐缓冲液按g:mL计为1:3。

优选的，将第一生物膜剥离液进行冷冻离心，去除上清液，再次加入磷酸盐缓冲液，获得第二生物膜剥离液，具体包括：

将第一生物膜剥离液在3～5℃的条件下进行冷冻离心，并去除上清液，再次加入磷酸盐缓冲液，获得第二生物膜剥离液。

优选的，向第二生物膜剥离液中加入甲醛溶液和氢氧化钠溶液，振荡静置，冷冻离心，获得上清液，具体包括：

向第二生物膜剥离液中加入体积分数为37％的甲醛溶液，振荡后，在3～5℃的条件下静置；然后加入1mol/L的氢氧化钠溶液，振荡后，在3～5℃的条件下静置；再在3～5℃的条件下进行冷冻离心，获得上清液。

优选的，采用0.22μm的滤膜对获得的上清液进行过滤，获得滤液。

优选的，采用蛋白试剂盒法测定所述滤液中的总蛋白含量，滤液中的总蛋白含量即生物膜胞外聚合物中的总蛋白含量，采用总有机碳法测定所述滤液中的多糖含量，滤液中的多糖含量即生物膜胞外聚合物中的多糖含量。

优选的，对人工湿地基质表面的生物膜进行染色，然后进行荧光扫描，获得生物膜中蛋白质、多糖和脂类的荧光信号强度，根据荧光信号强度获得生物膜厚度，具体包括：

用磷酸盐缓冲液清洗表面附有生物膜的人工湿地基质，加入碳酸氢钠溶液，然后依次对生物膜中的蛋白质、α多糖(α-PS)、β多糖(β-PS)和脂类(Lipid)进行染色，再采用激光共聚焦显微镜CLSM(LeicaTCSSP2，德国)进行荧光分析，获得生物膜中蛋白质、多糖和脂类的荧光信号强度，并对荧光强度沿半径方向从外部到内部进行扫描，获得生物膜厚度。

优选的，所述碳酸氢钠溶液中碳酸氢钠的浓度为0.1mol/L。

优选的，采用异硫氰酸荧光素(FITC)溶液对所述生物膜中的蛋白质进行染色；采用刀豆蛋白(Con A)溶液对所述生物膜中的α多糖(α-PS)进行染色；采用卡尔科弗卢尔荧光增白剂(Calcofluor White，CW)溶液对所述生物膜中的β多糖(β-PS)进行染色；采用尼罗红(Nile Red)溶液对所述生物膜中的脂类(Lipid)进行染色。

优选的，所述异硫氰酸荧光素(FITC)溶液中异硫氰酸荧光素(FITC)的浓度为10mg/mL；所述刀豆蛋白(Con A)溶液中刀豆蛋白(Con A)的浓度为0.25mg/mL；所述卡尔科弗卢尔荧光增白剂(Calcofluor White，CW)溶液中卡尔科弗卢尔荧光增白剂(CalcofluorWhite，CW)的浓度为0.3mg/mL；所述尼罗红(Nile Red)溶液中尼罗红(Nile Red)的浓度为0.01mg/m。

本发明的有益效果：

本发明的人工湿地生物膜健康状况和堵塞程度的监测方法，通过采用甲醛—氢氧化钠提取法将基质表面的生物膜洗脱下来，采用蛋白试剂盒法和总有机碳法测定生物膜中的总蛋白含量和多糖含量，并采用生物膜胞外物质染色成像方法，通过对生物膜胞外物质进行染色，利用不同物质与不同染色剂结合后会有不同的激发荧光信号，量化不同生物膜厚度的荧光信号的强度来计算生物膜各类胞外物质含量及膜厚度，通过总蛋白含量、多糖含量和生物膜胞外物质含量及膜厚度的综合分析，从而同时且准确的判断人工湿地生物膜健康状况和人工堵塞程度，该方法可有效靶向定位人工湿地系统问题部位，可准确判断人工湿地系统生物膜健康及人工湿地堵塞情况，对于及时发现人工湿地运行问题及保证其长期稳定运行具有重要意义，且具有操作简单、成本低和绿色无污染的优点，在污水处理技术领域，具有推广应用价值。

附图说明

图1为砾石表面生物膜各组分荧光信号强度及生物膜整体厚度结果图。

其中，图1A代表蛋白质，图1B代表α多糖，图1C代表β脱氮，图1D代表酯类物质，图1E是四种物质合成后的整体生物膜形貌。四种物质对应的荧光强度与物质本身的量成正比，同时四种物质及合成的生物膜形貌的厚度可以通过坐标轴进行读取。

具体实施方式

以下将参照附图和优选实施例来说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书中所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。

实施例

一种人工湿地生物膜健康状况和堵塞程度的监测方法，其特征在于，包括采用甲醛—氢氧化钠提取法获得人工湿地生物膜胞外聚合物中总蛋白含量和多糖含量，以及采用共聚焦荧光显微镜对生物膜进行荧光分析，获得生物膜整体厚度；

1)采用甲醛—氢氧化钠提取法获得人工湿地生物膜胞外聚合物中总蛋白含量和多糖含量，包括以下步骤：

S1、采用磷酸盐缓冲液剥离取自运行1年的人工湿地中部25cm深的砾石表面的生物膜，获得第一生物膜剥离液，具体包括：

S11、在人工湿地系统中取基质(砾石或塑料颗粒)10g置于50mL锥形瓶中，并加入30mL磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.2)溶液；

S12、将锥形瓶置于20℃水浴条件下振荡20min，获得第一生物膜剥离液，并称量砾石重量，通过起始重量减去剥离生物膜后的砾石重量，得到剥离的生物膜重量；

S2、将第一生物膜剥离液进行冷冻离心，去除上清液，再次加入磷酸盐缓冲液，获得第二生物膜剥离液，具体包括：

S21、将第一生物膜剥离液倒入50mL离心管中，在4℃，4000×g的条件下，冷冻离心20min；

S22、去除离心管中的上清液，然后向离心管中加入PBS至20mL，获得第二生物膜剥离液；

S3、向第二生物膜剥离液中加入甲醛溶液和氢氧化钠溶液，振荡静置，冷冻离心，获得上清液，具体包括：

S31、向装有20mL第二生物膜剥离液的离心管中加入0.12mL体积分数为37％的甲醛溶液，充分振荡5min，然后在4℃的条件下静置1h；

S32、向离心管中中加入8mL浓度为1mol/L的NaOH溶液，充分振荡5min，然后在4℃的条件下静置3h；

S33、将离心管在4℃，4000×g的条件下，冷冻离心20min，吸取上清液；

S4、将获得的上清液过滤，获得滤液，具体包括：

采用0.22μm的滤膜将上清液进行过滤，获得滤液；

S5、采用蛋白试剂盒法测定滤液中的总蛋白含量，采用总有机碳法测定滤液中的多糖含量，具体包括：

S51、采用BCA法微量蛋白检测试剂盒通过酶标仪测定滤液中的总蛋白含量，测定结果通过使用如下公式换算成单位质量生物膜所含的总蛋白质质量(μg PN/g biofilm)，单位质量生物膜所含的总蛋白质质量即单位质量生物膜胞外聚合物中的总蛋白质质量；

S52、采用总有机碳(TOC)湿法氧化法测定滤液中的多糖含量，滤液中的多糖含量即生物膜胞外聚合物中的多糖含量。具体检测方法如下：首先将提取到的生物膜滤液进行稀释，保证稀释后的TOC浓度范围在0-1.0mg/L，然后将样品进行磷酸酸化处理(如果使用TOC仪，该仪器会自动对每个样品进行注酸处理)去除无机碳，最后上机进行检测。得到数据通过以下公式进行多糖计算：

多糖浓度(mg C/g biofilm)＝检测浓度×滤液体积÷生物膜质量(g)

2)采用共聚焦荧光显微镜对生物膜进行荧光分析，获得生物膜整体厚度，包括以下步骤：

S1、对人工湿地基质表面的生物膜进行染色，然后进行荧光扫描，获得生物膜中蛋白质、多糖和脂类的荧光信号强度，根据荧光信号强度获得生物膜厚度；

S11、在人工湿地系统中取一部分基质(此处的基质与测定总蛋白含量和多糖含量所取基质属于同一批次)，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗三次，每次浸泡5min；

S12、随机选取10g形状、大小接近的基质(砾石或砂砾)至5mL离心管中，加入100μL0.1mol/L的NaHCO

S13、加入10μL浓度为10mg/mL的异硫氰酸荧光素(FITC)溶液，用于对基质表面生物膜中的蛋白质进行染色，染色作用时间为60min，染色完毕后用PBS清洗3次，以清除多余染色剂，避免染色剂与染色剂之间交叉影响；

S14、加入100μL浓度为0.25mg/mL的刀豆蛋白(Con A)溶液，用于对基质表面生物膜中的α多糖(α-PS)进行染色，染色作用时间为30min，染色完毕后用PBS清洗3次，以清除多余染色剂，避免染色剂与染色剂之间交叉影响；

S15、加入100μL浓度为0.3mg/mL的卡尔科弗卢尔荧光增白剂(Calcofluor White，CW)溶液，用于对基质表面生物膜中的β多糖(β-PS)进行染色，染色作用时间为30min，染色完毕后用PBS清洗3次，以清除多余染色剂，避免染色剂与染色剂之间交叉影响；

S16、加入60μL浓度为0.01mg/mL的尼罗红(Nile Red)溶液，用于对基质表面生物膜中的脂类(Lipid)进行染色，染色作用时间为10min，染色完毕后用PBS清洗3次，以清除多余染色剂，避免染色剂与染色剂之间交叉影响；

其中，染色过程全程在25℃的暗室中进行，防止荧光猝灭；

S17、所有染色结束后，立即将基质置于载玻片上，使用激光共聚焦显微镜CLSM(LeicaTCSSP2，德国)在对应的激发波长和发射波长条件下进行荧光分析，分别获得基质表面生物膜中的蛋白质、α多糖(α-PS)、β多糖(β-PS)和脂类的荧光强度，并对荧光强度生物膜表层到生物膜内部进行扫描，将扫描后的图像进行图像拟合，得到生物膜三维图像。该图像具有纵向刻度，即可得到生物膜厚度，结果如图1所示；

其中，染色步骤中染色剂用量、浓度，CLSM观察所用激发波长和发射波长详见表1所示。为了防止荧光淬灭，染色与观察应该连贯快速进行，不宜中途保存样品再观察；

根据总蛋白含量、多糖含量和生物膜厚度，通过对比相同湿地类型和水质的未堵塞的基质系统各项参数，来判断人工湿地生物膜健康状况和堵塞程度。

表1生物膜胞外聚合物原位荧光染色参数一览表

注：每一步染色之后均使用PBS清洗3次，以清除过多染色剂，保证不同染色剂之间无交叉影响。染色过程全程在25℃暗室中进行，防止荧光淬灭。

本发明的人工湿地生物膜健康状况和堵塞程度的监测方法，通过采用甲醛—氢氧化钠提取法将基质表面的生物膜洗脱下来，采用蛋白试剂盒法和总有机碳法测定生物膜中的总蛋白含量和多糖含量，并采用生物膜胞外物质染色成像方法，通过对生物膜胞外物质进行染色，利用不同物质与不同染色剂结合后会有不同的激发荧光信号，量化不同生物膜厚度的荧光信号的强度来计算生物膜各类胞外物质含量及膜厚度，通过总蛋白含量、多糖含量和生物膜胞外物质含量及膜厚度的综合分析，从而同时且准确的判断人工湿地生物膜健康状况和人工堵塞程度，该方法可有效靶向定位人工湿地系统问题部位，可准确判断人工湿地系统生物膜健康及人工湿地堵塞情况，对于及时发现人工湿地运行问题及保证其长期稳定运行具有重要意义，且具有操作简单、成本低和绿色无污染的优点，在污水处理技术领域，具有推广应用价值。

以上实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。