一种超高效测定中药材中30种农药成分的方法及其应用

文献发布时间：2023-06-19 19:28:50

技术领域

本发明涉及G01N30/88，具体涉及一种超高效测定中药材中30种农药成分的方法及其应用。

背景技术

中药是我国悠长的历史长河中所沉淀出的重要文化遗产之一，中药的使用往往伴随着人体保健，疾病预防和治疗等效果。如今，随着中药理论与现代医学技术的结合，中医越来越多的成为了世界各国人民用于疾病的预防和治疗的选择之一，这种情况也侧面促进了中药材的种植。而通常在中药材的种植过程中，为了保证中药材的产量，也必须对植物病、虫害和杂草进行防治，而化学农药的方法是上述问题的最主要的综合防治措施。但是，同样的化学农药的使用也会产生一定的负面作用，而中药材中的农药成分的残留成为了上述方法对于人身健康最主要的危害。因此，在中药材的使用前，对于中药材中的农药残留成分的检测是十分有必要的。

现有技术(CN201910477757.2)提供了一种检测中药材中农药残留的方法。其主要经过待测物的三步提取，最终利用质谱法对于农药的残留进行测定。但是，此前处理方法其测定的农药残留种类较多，实际应用过程中，会相应的导致测试效率和测试精度较低，无法同时对大量种类的农药残留种类进行测定，降低了测定效率。

因此，研发一种单次测量农药残留种类适宜，且具有极高精准度和测试效率的中药材农药残留测量方法是十分有意义的。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的第一个方面提供了一种超高效测定中药材中30种农药成分的方法，步骤包含以下几步：(1)测谱条件设置；(2)对照品样品的制备；(3)待测样品预处理；(4)高效液相色谱-串联质谱法检测。

优选的，所述测谱条件设置为色谱条件设置与质谱条件设置。

优选的，所述30中农药成分如表2中所示。

优选的，所述色谱条件设置步骤为：以多孔硅胶为填充剂；以有机酸溶液为流动相A，以有机溶剂-有机酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；流速为每分钟0.2～0.5mL，柱温为30～50℃。

优选的，所述流动相B中有机溶剂和有机酸溶液的质量比为(90～98):(2～10)。

进一步优选的，所述有机溶剂和-有机酸溶液的质量比为95:5。

优选的，所述有机酸溶液还含有3～6mmol/L有机酸盐。

优选的，所述有机酸盐包括甲酸铵、乙酸铵、磷酸钾盐、磷酸钠盐的至少一种。

优选的，所述有机酸溶液的溶质包括甲酸、乙酸、磺酸类、三氟乙酸、三氯乙酸的至少一种。

优选的，所述对照品样品的制备包括混合对照品溶液，空白基质溶液，基质混合对照溶液的制备。

优选的，所述混合对照品溶液的制备步骤：精密量取禁用农药混合对照品溶液(已标示各相关农药品种的浓度)1mL，置20mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。

优选的，质谱条件为：以三重四极杆串联质谱仪检测；离子源为电喷雾(ESI)离子源，正离子扫描模式。监测模式为多反应监测(MRM)，各化合物监测离子对、碰撞电压(CE)见表1。

优选的，所述空白基质溶液的制备步骤：取空白基质样品，同供试品溶液的制备方法处理制成空白基质溶液。

优选的，所述基质混合对照溶液的制备步骤：分别精密量取空白基质溶液1.0mL(6份共6mL)，置氮吹仪上，30～50℃水浴浓缩至约0.5～0.8mL，分别加入混合对照品溶液10μL、20μL、50μL、100μL、150μL、200μL，加乙腈稀释至1mL，涡旋混匀，即得。

优选的，所述待测样品预处理步骤：取待测样品粉末3～8g，精密称定，加氯化钠0.5～2g，立即摇散，再加入乙腈40～60mL，匀浆处理1～3分钟，离心，分取上清液，沉淀再加乙腈40～60mL，匀浆处理1～2分钟，离心，合并两次提取的上清液，减压浓缩至约3～5mL，放冷，用乙腈稀释至8～12mL，摇匀，取3～5mL通过亲水亲油平衡材料(HLB SPE)固相萃取柱(200mg，6mL)净化，收集全部净化液，混匀，即得。

优选的，所述待测样品预处理步骤前还可以包括待测样品粉末的前处理步骤。

优选的，所述待测样品粉末的前处理步骤为待测样品粉末的无机酸酸洗步骤。

优选的，所述待测样品粉末与无机酸酸洗液的质量比为1:(3～5)；所述酸洗时间为20～50秒。

优选的，所述无机酸为盐酸、氢氟酸和硝酸的混合酸溶液，所述混合酸溶液的浓度为0.3～0.5wt％；

优选的，所述盐酸、氢氟酸和硝酸的质量比为1：(1～2)：(3～4)。

本发明中在前处理过程中通过加入盐酸、氢氟酸和硝酸复配后的混合酸处理待测样品粉末，有效提高了测试方法对于30中特定农药残留成分测试准确性，并有效增强了测试效率。本申请人推测为：当盐酸、氢氟酸和硝酸的体积比为1：(1～2)：(3～4)时，盐酸和硝酸的配合能够在混合酸中形成比单一组分氧化性更强的氯化亚硝酰，能够有效使得待测粉末中的惰性金属等难除杂质产生失电子反应，且混合后的溶液中存在着适量的氯离子能够与其他金属离子形成稳定的络离子并与其他难溶性无机杂质形成洗脱液中的沉降，从而使得一些金属的标准电极电位减小，有利于向着金属杂质和无机质杂质溶解的方向进行；且盐酸和硝酸的强电离作用能够有效提高氢氟酸中氟离子的电离程度，使得混合酸表现出更强的金属配合性，并且能够优先的溶解待测粉末中的无机盐成分。

当盐酸、硝酸的含量过多时或处理溶液浓度过高或处理时间过长时，混合酸的氧化性过大，容易将想要去除的固体杂质氧化分解的同时，对待测农药成分形成氧化讲解作用，降低最后测定的数值准确性。当含量过低、浓度过低或处理时间较短时，无法形成有效的预处理杂质去除效果。

优选的，所述净化液收集后还经过了树脂微球的清洗步骤。

优选的，所述树脂微球为功能改性丙烯酸树脂微球。

优选的，所述功能改性丙烯酸树脂微球的制备方法，步骤包含以下几步：(1)取聚丙烯酸树脂微球，去离子水清洗10～20分钟3～4次，之后真空烘箱烘干；(2)将清洗后的聚丙烯酸树脂微球与有机胺按照比例混合，升温至140～180℃加热反应15～16小时；(3)反应完成后通过有机溶剂(甲醇或丙酮)提取，经过去离子水清洗、烘干，即得所述改性丙烯酸树脂微球。

优选的，所述有机胺为乙二胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺中的至少一种。

优选的，所述聚丙烯酸微球树脂与有机胺的质量比为1：(5～6)。

本申请人发现，采用功能改性丙烯酸型树脂微球能够进一步提高待测样品粉末中的多余杂质，尤其是当聚丙烯酸树脂微球与有机胺的质量比为1：5.5时，还能够保证所需测试的中药成分的成分含量不被破坏，从而保证测试的准确度。本申请人推测为：经过功能改性丙烯酸型树脂微球能够在微球表面形成接枝多胺基团，与净化液中的余出的金属离子进行络合固定，并且能够协同丙烯酸型树脂中的羧基对金属离子进行络合置换作用；并且当聚丙烯酸树脂微球与有机胺两者的质量比为1：5.5时，置换净化效果达到最佳。当有机胺的添加量较低，多胺化基团较少时，金属离子的去除效果不佳，但是当添加较多时，树脂柱容易对净化液中的活性成分产生过多消耗，从而降低净化液后的质谱测定效果。

优选的，所述功能改性丙烯酸树脂微球与净化液的体积比为(5～6):1。

本申请人进一步发现，使用改性的聚丙烯酸树脂微球对净化液进行进一步的除杂效果，虽然能够进一步的减少净化液中痕量金属杂质或无机固体杂质的含量，但是同样的容易造成净化液在后处理过程中的损失，降低最终产物含量，降低了检测方法的效果。而本申请人发现，当树脂微球与净化液的体积比为5.5:1时，能够在保准测试准确性的同时，提高检测效率。这主要是因为：当两者体积比为5.5:1时，本申请中使用的改性丙烯酸型树脂微球的多胺基团的数量已经能够适用于降低净化液中残留的痕量金属杂质以及无机固体杂质，且此时，适宜的体积比能够有效的避免因为树脂微球表面的微孔吸收作用对于净化液的微吸作用，保持微球的粗糙表面，避免微球表面净化液同相层的形成，提高两相的表面张力，从而有效的提高净化产物的产量。

优选的，所述高效液相色谱-串联质谱法：分别精密吸取基质混合对照溶液和供试品溶液各0.5～2mL，精密加入水0.1～0.5mL，混匀，滤过，取续滤液；分别精密吸取基质混合对照溶液和供试品溶液的续滤液各1～5μL，注入液相色谱-串联质谱仪，按外标标准曲线法计算，即得。

本发明第二方面提供了一种上述超高效测定中药材中30种农药成分的方法在中药材农药残留测试方法中的应用。

有益效果：

1)中药材中的农药成分的残留不仅会影响中药材的药效，甚至会对人身健康产生危害。本发明通过对检测样品的预处理，采用特定条件的高效液相色谱-串联质谱法进行检测，能够超高效测定中药材中30种农药成分，检测的准确度，精密度，回收率高，重现性好。

2)本发明中通过前处理过程中通过加入盐酸、氢氟酸和硝酸复配后的混合酸处理待测样品粉末，促进待测样品粉末向着金属杂质和无机质杂质溶解的方向进行，有效提高了测试方法对于30中特定农药残留成分测试准确性，并有效增强了测试效率。

3)本发明通过采用功能改性丙烯酸型树脂微球并进一步限定聚丙烯酸树脂微球与有机胺的质量比为1：5.5，提高了置换净化效果，防止中药成分的成分含量被破坏，从而保证测试的准确度。

4)本发明进一步限定微球与净化液的体积比，有效的避免因为树脂微球表面的微孔吸收作用对于净化液的微吸作用，减少对检测结果的干扰，保证测试结果的准确性，提高检测效率。

5)本发明通过特定测谱条件的设置以及对照品样品的制备等过程，改善了流动相与农药分子的结合力，灵敏度高，提高检测结果的准确性，检测速度快，提升农残检测效率。

具体实施方式

实施例

若无特殊说明，下述0.1％甲酸溶液为体积分数为0.1％甲酸溶液。

实施例1

(1)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长7.5cm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm)；以0.1％甲酸溶液(含5mmol/L甲酸铵)为流动相A，以乙腈-0.1％甲酸溶液(含5mmol/L甲酸铵)(质量比95：5)为流动相B，按表1进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3mL，柱温为40℃。

质谱条件：以三重四极杆串联质谱仪检测；离子源为电喷雾(ESI)离子源，正离子扫描模式。监测模式为多反应监测(MRM)，各化合物监测离子对、碰撞电压(CE)见表2。

(2)混合对照品溶液的制备：精密量取禁用农药混合对照品溶液(已标示各相关农药品种的浓度)1mL，置20mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。

空白基质溶液的制备：取空白基质样品，同供试品溶液的制备方法处理制成空白基质溶液。

基质混合对照溶液的制备：分别精密量取空白基质溶液1.0mL(6份)，置氮吹仪上，40℃水浴浓缩至约0.6mL，分别加入混合对照品溶液10μL、20μL、50μL、100μL、150μL、200μL，加乙腈稀释至1mL，涡旋混匀，即得。

(3)酸洗步骤：待测样品粉末与无机酸酸洗液的质量比为1:3；所述酸洗时间为25秒；混合酸溶液的浓度为0.4wt％；盐酸、氢氟酸和硝酸的质量比为1：1.2：3.5。

所述样品待测预处理：取供试品粉末5g，精密称定，加氯化钠1g，立即摇散，再加入乙腈50mL，匀浆处理2分钟(转速为每分钟13000转)，离心(每分钟4000转)，分取上清液，沉淀再加乙腈50mL，匀浆处理1分钟，离心，合并两次提取的上清液，减压浓缩至约4mL，放冷，用乙腈稀释至10.0mL，摇匀，取4mL通过亲水亲油平衡材料(HLB SPE)固相萃取柱(200mg，6mL)净化，收集全部净化液，混匀，即得。所述亲水亲油平衡材料(HLB SPE)固相萃取柱(200mg，6mL)购自深圳市逗点生物科技有限公司。

所述净化液收集后还经过了树脂微球的清洗步骤：以500mg树脂微球填充SPE柱(6mL)，按照10mL/min速度将净化液过柱洗脱即得。

所述树脂微球为功能改性丙烯酸树脂微球。

所述功能改性丙烯酸树脂微球的制备方法，步骤包含以下几步：(1)取聚丙烯酸树脂微球，去离子水清洗15分钟3次，之后真空烘箱烘干；(2)将清洗后的聚丙烯酸树脂微球与有机胺按照比例混合，升温至160℃加热反应15小时；(3)反应完成后通过有机溶剂(丙酮)提取，经过去离子水清洗、烘干，既得所述功能改性丙烯酸树脂微球。

所述有机胺为二乙烯三胺。

所述聚丙烯酸树脂微球与有机胺的质量比为1：5.5。所述聚丙烯酸树脂微球购自中科雷鸣(北京)科技有限公司，型号：PMMA010000。

所述功能改性丙烯酸树脂微球与净化液的体积比为5.5:1。

(4)高效液相色谱-串联质谱法：分别精密吸取基质混合对照溶液和供试品溶液各1mL，精密加入水0.3mL，混匀，滤过，取续滤液；分别精密吸取基质混合对照溶液和供试品溶液的续滤液各3μL，注入液相色谱-串联质谱仪，按外标标准曲线法计算，即得。

实施例2

(1)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长7.5cm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm)；以0.1％甲酸溶液(含5mmol/L甲酸铵)为流动相A，以乙腈-0.1％甲酸溶液(含6mmol/L甲酸铵)(质量比95：5)为流动相B，按表1进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3mL，柱温为40℃。

(2)混合对照品溶液的制备：精密量取禁用农药混合对照品溶液(已标示各相关农药品种的浓度)1mL，置20mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。

空白基质溶液的制备：取空白基质样品，同供试品溶液的制备方法处理制成空白基质溶液。

所述样品待测预处理：取供试品粉末5g，精密称定，加氯化钠1g，立即摇散，再加入乙腈50mL，匀浆处理2分钟(转速每分钟13000转)，离心(每分钟4000转)，分取上清液，沉淀再加乙腈50mL，匀浆处理1分钟，离心，合并两次提取的上清液，减压浓缩至约4mL，放冷，用乙腈稀释至10.0mL，摇匀，取4mL通过亲水亲油平衡材料(HLB SPE)固相萃取柱(200mg，6mL)净化，收集全部净化液，混匀，即得。

所述净化液收集后还经过了树脂微球的清洗步骤：以500mg树脂微球填充SPE柱(6mL)，按照10mL/min速度将净化液过柱洗脱即得。

所述树脂微球为功能改性丙烯酸树脂微球。

所述有机胺为二乙烯三胺。

所述聚丙烯酸树脂微球与有机胺的质量比为1：5.5。

所述功能改性丙烯酸树脂微球与净化液的体积比为5.5:1。

实施例3

(2)混合对照品溶液的制备：精密量取禁用农药混合对照品溶液(已标示各相关农药品种的浓度)1mL，置20mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。

空白基质溶液的制备：取空白基质样品，同供试品溶液的制备方法处理制成空白基质溶液。

所述净化液收集后还经过了树脂微球的清洗步骤：以500mg树脂微球填充SPE柱(6mL)，按照10mL/min速度将净化液过柱洗脱即得。

所述树脂微球为功能改性丙烯酸酸树脂微球。

所述有机胺为二乙烯三胺。

所述聚丙烯酸酸树脂微球与有机胺的质量比为1：5.5。

所述功能改性丙烯酸树脂微球与净化液的体积比为6:1。

实施例4

(2)混合对照品溶液的制备：精密量取禁用农药混合对照品溶液(已标示各相关农药品种的浓度)1mL，置20mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。

空白基质溶液的制备：取空白基质样品，同供试品溶液的制备方法处理制成空白基质溶液。

(3)酸洗步骤：待测样品粉末与无机酸酸洗液的质量比为1:3；所述酸洗时间为25秒；混合酸溶液的浓度为0.4wt％；盐酸、氢氟酸和硝酸的质量比为0.5：1.2：3.5。

所述净化液收集后还经过了树脂微球的清洗步骤：以500mg树脂微球填充SPE柱(6mL)，按照10mL/min速度将净化液过柱洗脱即得。

所述树脂微球为功能改性丙烯酸树脂微球。

所述有机胺为二乙烯三胺。

所述功能改性丙烯酸树脂微球与有机胺的质量比为1：5.5。

所述功能改性丙烯酸树脂微球与净化液的体积比为5.5:1。

实施例5

(2)混合对照品溶液的制备：精密量取禁用农药混合对照品溶液(已标示各相关农药品种的浓度)1mL，置20mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。

空白基质溶液的制备：取空白基质样品，同供试品溶液的制备方法处理制成空白基质溶液。

所述净化液收集后还经过了树脂微球的清洗步骤：以500mg树脂微球填充SPE柱(6mL)，按照10mL/min速度将净化液过柱洗脱即得。

所述树脂微球为功能改性丙烯酸树脂微球。

所述有机胺为二乙烯三胺。

所述聚丙烯酸树脂微球与有机胺的质量比为1：4。

所述功能改性丙烯酸树脂微球与净化液的体积比为5.5:1。

性能测试

测试项目：首乌藤

1.回收率：根据测试结果计算回收率，回收率＝[(C待测液×稀释倍数)/C基质标样]×100％。所述C待测液根据峰面积和峰高在基质混合对照溶液测的标准曲线上直接查出注入色谱柱中样品组分的浓度；以各成份的浓度为横坐标X，各成份的峰面积为纵坐标Y，进行回归分析，可得到30种农药的线性回归方程，所述稀释倍数＝样品质量/定容的体积*移取测试的体积/稀释的体积。

2.精密度；以相对标准偏差(RSD)表示精密度，根精密度RSD＝标准偏差(SD)/算术平均值(X)*100％；根据药材及饮品(植物类)中禁用农药多残留测定法(《中华人民共和国药典》四部通则2341第五法)条件，平行测试6次。

表1

表2

表3

表4

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该技术已申请专利。仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
专利发明人：张晓蕾;魏安凯;张雪梅;赵赛楠;梁景辉;
专利申请人：安徽微谱检测技术有限公司;