用于治疗的异喹啉衍生物

技术领域

本发明提供了一种用于治疗的异喹啉衍生物，例如用于治疗癌症。本发明还提供了一种包含本发明的异喹啉衍生物的组合物，以及使用本发明的异喹啉衍生物治疗癌症的方法。

背景技术

前列腺癌是欧洲男性中确诊发病率最高的癌症，也是全世界第二高发的癌症。前列腺癌的诊断可基于前列腺特异性抗原(PSA)筛查、直肠指检、多参数磁共振成像(mpMRI)或基于基因的检测，如跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)蛋白，以及非编码RNA，前列腺癌基因3(PCA3)。

目前对前列腺癌的治疗，包括激素治疗、外科手术、放疗和化疗，已经减缓了疾病的发展。雄性激素阻断疗法(ADT)，包括给药和外科手术，一直是治疗前列腺癌的常规方法，患者最初对ADT敏感。然而，许多患者癌症复发并发展为更具侵略性的去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。

研究表明，大多数CRPC患者表现为高水平的雄性激素受体(AR)和AR靶基因，包括前列腺特异性抗原(PSA)。AR突变、构成性活跃的AR剪接变体和激活的增殖途径，如丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)与信号转导和转录激活因子3(STAT3)都在CRPC中很常见。

驱动CRPC发展的AR蛋白由几个不同的功能域组成：一个配体结合域(LBD)、一个短铰链区、一个DNA结合域(DBD)和一个氨基末端域(NTD)。一些AR抑制剂已应用于临床或正在进入临床阶段研究。例如，阿比特龙(Abi)作为CYP17A1抑制剂阻断雄性激素的合成，同时塞维罗内尔(VT-464)和加利特龙(TOK-001)作为裂解酶抑制剂。其他AR拮抗剂以AR配体结合域为靶点，如恩扎鲁胺(ENZ)和阿帕鲁胺(ARN-509)。然而，这些AR抑制剂主要由于LBD突变产生的耐药性而失效。

STAT3通路对于推动前列腺癌进展到转移性CRPC至关重要。STAT3与其他信号通路整合以重新激活AR通路，并调节肿瘤细胞与微环境之间的相互作用。据报道，构成性活跃的STAT3诱导了对ENZ的抗性，而JAK2抑制剂AG490可以逆转LNCaP细胞的ENZ抗性。所有这些观察表明，IL-6/STAT3通路促进了肿瘤的发生、发展和转移，并可能成为治疗前列腺癌的良好靶点。

1993年，STAT3最初被描述为来自IL-6激发的人类肝癌(HepG2)细胞的转录因子。全长的STAT3有六个不同的结构域：一个用于招募辅助因子的转录结构域(TAD)；一个用于受体结合和二聚体化的Src同源区2(SH2)结构域；一个连接域(LD)；一个DNA结合域(DBD)；一个卷曲-螺旋结构域(CDD)和一个保守的氨基末端结构域(NTD)。

细胞因子(IL-6、IL-10和IL-11)或生长因子(EGF、FGF、PDGF和VEGF)与它们相应的细胞表面受体结合。这些结合的受体形成一个二聚体复合物，导致糖蛋白130(gp130)的启动和二聚化。受体和gp130的复合物招募Janus激酶(JAKs)并通过磷酸化级联激活JAK/STAT信号。这些受体的细胞质磷酸化的酪氨酸残基为STAT3的SH2结构域创造了一个对接点。STAT3因此通过位于SH2结构域的酪氨酸705(Tyr705)的磷酸化而被激活。

一旦被激活，磷酸化的STAT3单体通过其SH2结构域相互作用，形成pSTAT3的同源二聚体，与相关受体解离，转移到细胞核并诱导基因转录。除了像JAKs这样与受体相关的途径外，STAT3的磷酸化也可以由非受体相关的酪氨酸激酶(如Src)触发。STAT3的DNA结合和转录活性取决于STAT3的TAD结构域内丝氨酸(Ser 727)的磷酸化。

STAT3的功能在很大程度上依赖于其SH2结构域，它能促进STAT3的同源或异源二聚体化、蛋白质-蛋白质相互作用和转录所需的STAT3二聚体的核转位。因此，由于STAT3单体与相关受体内的磷酸酪氨酸基团之间的联系，STAT3 SH2结构域介导了STAT3的磷酸化和二聚化。由于这一重要作用，STAT3 SH2结构域成为发现和开发小分子调节剂的主要治疗目标。

Hua等人(Pharmacology Research&Perspectives,2018,vol.6,issue 6)公开了一种小分子化合物(华蟾毒精-3-醋酸酯—在此也称为化合物154)，该化合物可抑制AR和STAT3的转录活性，降低STAT3(Y705)的磷酸化表达，下调AR靶基因的mRNA水平。

另一种已知的STAT3抑制剂是S3I-201，它的结构如下所示。

然而，人们希望能发现更多的STAT3抑制剂。特别是希望发现能作为STAT3 SH2结构域抑制剂的化合物。

发明内容

本发明提供了一种式(I)化合物或其溶剂化物、其互变异构体、其立体异构体或其盐，其用于治疗癌症，所述癌症(i)选自前列腺癌、胃癌、小肠癌、食道癌、黑色素瘤、头或颈癌、肾癌、膀胱癌、泌尿系统癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、胆管癌、胆囊癌、血管癌、阑尾癌和直肠癌的STAT3相关癌症；或(ii)选自慢性淋巴细胞白血病和急性淋巴细胞白血病的MCL-1相关癌症：

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其中,

W选自-CH

R

R

R

R

R

本发明还提供了用于治疗前列腺癌的本发明化合物。

本发明还提供了一种式(I)化合物或其溶剂化物、其互变异构体、其立体异构体或其盐，

其中,

W选自-CH

R

R

R

R

R

条件是所述化合物不为：

本发明还提供了一种包含本发明化合物和药学上可接受的载体的组合物。

本发明还提供了一种本发明化合物作为STAT3抑制剂的体外应用，优选STAT3 SH2结构域抑制剂。

本发明还提供了一种治疗(i)STAT3相关癌症的方法，所述STAT3相关癌症选自前列腺癌、胃癌、小肠癌、食道癌、黑色素瘤、头或颈癌、肾癌、膀胱癌、泌尿系统癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、胆管癌、胆囊癌、血管癌、阑尾癌和直肠癌；或者(ii)MCL-1相关癌症的方法，所述MCL-1相关癌症选自慢性淋巴细胞白血病和急性淋巴细胞白血病，其中，所述方法包括向所需病人施用治疗有效量的本发明的化合物或组合物。

本发明还提供一种治疗前列腺癌的方法，其中，所述方法包括向所需患者施用治疗有效量的本发明的化合物或组合物。

附图说明

图1-4和6-8表明本发明的化合物可以抑制不同的细胞增殖。

图5表明本发明对STAT3活性的抑制作用。

图9-11和13表明本发明的化合物靶向IL-6/STAT3通路。

图12表明本发明的化合物通过直接靶向STAT3而非STAT1来降低Tyr705处的磷酸化STAT3。

图14表明本发明的化合物不影响STAT1、STAT3、STAT5A、STAT5B的DNA结合域。

图15-18表明本发明的化合物直接靶向STAT3。

图19表明本发明的化合物可以通过靶向STAT3 SH2结构域来阻断STAT3二聚化。

图20-22表明本发明的化合物可以作为STAT3 SH2结构域的直接抑制剂。

图23表明本发明化合物对克隆形成的抑制。

图24表明用流式细胞述对本发明化合物或隐丹参酮处理DU145细胞72小时后诱导的细胞凋亡的分析

图25-29表明本发明化合物对各种激酶的酶抑制活性。

图30-32表明本发明化合物的计算机模拟对接分析。

图33表明本发明的化合物可以作为STAT3 SH2结构域的直接抑制剂。

图34表明治疗后收获的LNCaP肿瘤的照片。

图35表明死亡当天的个体动物肿瘤的体积和重量。

图36表明收获的代表性LNCaP肿瘤的H&E染色。

图37表明本发明化合物和对比化合物S31201对分泌的白细胞介素的抑制作用。

图38是报告本发明化合物和对比化合物S31201和154对各种LPS诱导的树突状标记物的抑制作用的表格。

定义

本发明所用的术语“卤素”是指卤素基团，即氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)。优选的卤素或卤素基团包括F、Cl和Br，其中最优选的为Cl。

本发明所用的术语“烷基”是指直链和支链饱和脂肪烃链。烷基的实例包括但不限于甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(例如，正丙基和异丙基)、丁基(例如，正丁基、异丁基、叔丁基)和戊基(例如，正戊基、异戊基、新戊基)。

本发明所用的术语“环烷基”是指环化的烷基。因此，术语“C

此类环烷基的实例包括但不限于环戊基、环己基和降冰片基，其中特别优选的是环戊基。

本发明所用的术语“环烯基”是指环化的链烯基。因此，术语“C

此类环烯基的实例包括但不限于环戊烯基和环己烯基，其中特别优选的为环戊烯基。

本发明所用的术语“烷氧基”是指-O-烷基。因此，术语“C

本发明所用的术语“醛”是指包含醛(-CHO)官能团的任何基团。因此，术语“C

本发明所用的术语“醇”是指包含醇(-OH)官能团的任何基团。因此，术语“C

本发明所用的术语“醚”是指含有醚(-R-O-R)官能团的任何基团。因此，术语“C

本发明所用的术语“羧酸”是指含有羧酸(-COOH)官能团的任何基团。因此，术语“C

本发明所用的术语“酯”是指含有酯(-COOR)官能团的任何基团。因此，术语“C

本发明所用的术语“胺”是指含有胺(-NR

本发明所用的术语“酰胺”是指含有酰胺(-CONR

本发明所用的术语“半缩醛”是指含有半缩醛(-C(OH)OR)官能团的任何基团。因此，术语“C

本发明所用的术语“缩醛”是指含有缩醛(-C(OR)OR')官能团的任何基团。因此，术语“C

本发明所用的术语“环缩醛”是指任何缩醛，其中缩醛碳和其上的一个或两个氧原子是环的成员。术语“C

本发明所用的术语“盐”是指药学上可接受的盐。合适的盐包括有机或无机盐。优选的盐包括柠檬酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、甲酸盐、乙酸盐、马来酸盐、氯化物、溴化物、亚硫酸盐和硫酸盐。

本发明所用的术语“立体异构体”是指非对映异构体或对映异构体。更优选地，所述立体异构体是对映体。本发明通常包括本发明化合物的立体异构体，除非定义了具体的立体化学。

详细说明

本发明提供了一种式(I)化合物或其溶剂化物、其互变异构体、其立体异构体或其盐，其用于治疗癌症，所述癌症(i)选自前列腺癌、胃癌、小肠癌、食道癌、黑色素瘤、头或颈癌、肾癌、膀胱癌、泌尿系统癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、胆管癌、胆囊癌、血管癌、阑尾癌和直肠癌的STAT3相关癌症；或(ii)选自慢性淋巴细胞白血病和急性淋巴细胞白血病的MCL-1相关癌症:

其中,

W选自-CH

R

R

R

R

R

换言之，本发明提供了一种式(I)化合物或其溶剂化物、其互变异构体、其立体异构体或其盐，其用于治疗前列腺癌、胃癌、小肠癌、食道癌、黑色素瘤、头或颈癌、肾癌、膀胱癌、泌尿系统癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、胆管癌、胆囊癌、血管癌、阑尾癌、直肠癌、慢性淋巴细胞白血病或急性淋巴细胞白血病。

W

W选自-CH

优选地，W选自-CH

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甚至更优选地，R

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最优选地，R

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R

优选地，R

R

R

优选R

本发明的优选化合物包括式(II)化合物及其溶剂化物、其互变异构体、其立体异构体和其盐：

其中R

优选地，R

更优选地，R

本发明的更优选化合物包括式(III)化合物及其溶剂化物、其互变异构体、其立体异构体和其盐：

其中R

优选地，R

本发明的甚至更优选化合物包括式(IV)化合物及其溶剂化物、其互变异构体和其盐：

其中R

用于本发明的最优选化合物为化合物323-1和323-1及其盐。

另一方面，本发明提供一种式(I)化合物或其溶剂化物、其互变异构体、其立体异构体或其盐，

其中,

W选自-CH

R

R

R

R

R

条件是所述化合物不为：

在本发明的这一方面，基团W、R

因此，在一方面，本发明提供一种式(Ia)化合物或其溶剂化物、其互变异构体或其盐，其中式(Ia)化合物如上所定义，条件是所述化合物不为：

另一方面，本发明提供一种式(II)化合物或其溶剂化物、其互变异构体、其立体异构体或其盐，其中式(II)化合物如上所定义，条件是该化合物不为：

另一方面，本发明提供一种式(III)化合物或其溶剂化物、其互变异构体、其立体异构体或其盐，其中式(III)化合物如上所定义，条件是该化合物不为：

另一方面，本发明提供一种式(IV)化合物或其溶剂化物、其互变异构体或盐，其中式(IV)化合物如上所定义，条件是该化合物不为：

本发明的化合物可以使用任何合适的合成方法制备，本领域技术人员会知道本文公开的化合物的合适的合成路线。例如，Zhang等人报道了化合物323-1和323-2的全合成路线。(Journal of the American Chemical Society.2017；139:5558-67)。此外，化合物323-1和323-2是天然产物，因此可以从天然来源中分离。如实施例中所述，本发明的其他化合物可以从化合物323-1和323-2开始合成。或者，可以调整化合物323-1和323-2的合成以制备本发明的其它化合物。本领域技术人员非常清楚可以对化合物323-1和323-2的全合成进行适当的调整(如Zhang等人建议)，以便制备本发明的其它化合物。

本发明的化合物(例如式(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物)可作为STAT3 SH2结构域抑制剂。不希望受到理论的束缚，我们认为本发明的化合物可以通过靶向STAT3 SH2结构域并抑制磷酸化和非磷酸化的STAT3二聚来作为STAT3抑制剂。所述化合物被认为直接靶向STAT3而不是STAT1，不影响SRC或JAK2。因此，本发明的化合物具有抑制肿瘤细胞增殖的潜力。

本发明提供了本发明的化合物(例如式(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物)或其溶剂化物、其立体异构体、其互变异构体或其盐，其用于治疗(i)选自前列腺癌、胃癌、小肠癌、食道癌、黑色素瘤、头或颈癌、肾癌、膀胱癌、泌尿系统癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、胆管癌、胆囊癌、血管癌、阑尾癌和直肠癌的STAT3相关癌症；或(ii)选自慢性淋巴细胞白血病和急性淋巴细胞白血病的MCL-1相关癌症。

待治疗的所述癌症优选为STAT3相关癌症，即涉及一个或多个STAT3突变的癌症。诱导的髓系白血病细胞分化蛋白(MCL-1)相关癌症是与该蛋白相关的癌症，例如与异常的MCL-1表达、信号传导、行为或活性相关的癌症。

因此，待治疗的所述癌症优选为胃癌、小肠癌、食道癌、黑色素瘤、头或颈癌(例如上呼吸道或唾液腺癌)、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、泌尿系统癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、胆管癌、胆囊癌、血管癌、阑尾癌或直肠癌。

待治疗的所述癌症更优选前列腺癌，甚至更优选去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer，CRPC)，包括转移性CRPC。待治疗的优选患者是那些表现出STAT3信号通路的组成性激活的患者。换句话说，根据本发明治疗的肿瘤优选是由STAT3驱动的肿瘤，例如其中STAT3信号通路上调。

待治疗的优选前列腺癌是转移性前列腺癌，即已导致位于前列腺囊外的身体区域中的继发性肿瘤的癌症。在这种情况下，原发性和/或继发性肿瘤可能是治疗的目标。一般而言，本发明特别适用于治疗晚期前列腺癌，包括CRPC。晚期前列腺癌包括格里森(活检)评分为8-10的前列腺癌。

本发明还提供了一种组合物，其包含本发明的化合物(例如式(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物)或其溶剂化物、其立体异构体、其互变异构体或其盐，以及药学上可接受的载体。

本发明还提供了如上定义的组合物，其用于治疗(i)选自前列腺癌、胃癌、小肠癌、食道癌、黑色素瘤、头或颈癌、肾癌、膀胱癌、泌尿系统癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、胆管癌、胆囊癌、血管癌、阑尾癌和直肠癌的STAT3相关癌症；或(ii)选自慢性淋巴细胞白血病和急性淋巴细胞白血病的MCL-1相关癌症。优选的癌症如上所述。

本发明还提供如上定义的组合物，其用于治疗前列腺癌。

本发明所用的术语“治疗”包括预防性治疗。治疗包括减少肿瘤肿块、减少肿瘤肿块的生长或减少转移的形成。

本发明还提供一种本发明化合物(例如式(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物)或其溶剂化物、其立体异构体、其互变异构体或其盐作为STAT3抑制剂，优选STAT3 SH2结构域抑制剂的体外用途。

本发明还提供了本发明的化合物(例如式(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物)或其溶剂化物、其立体异构体、其互变异构体或其盐在制备用于治疗(i)选自前列腺癌、胃癌、小肠癌、食道癌、黑色素瘤、头或颈癌、肾癌、膀胱癌、泌尿系统癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、胆管癌、胆囊癌、血管癌、阑尾癌和直肠癌的STAT3相关癌症；或(ii)选自慢性淋巴细胞白血病和急性淋巴细胞白血病的MCL-1相关癌症的药物中的用途。

本发明还提供了本发明的化合物(例如式(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物)或其溶剂化物、其立体异构体、其互变异构体或其盐在制备用于治疗前列腺癌的药物中的用途。

本发明还提供了一种治疗(i)STAT3相关癌症的方法，所述STAT3相关癌症选自前列腺癌、胃癌、小肠癌、食道癌、黑色素瘤、头或颈癌、肾癌、膀胱癌、泌尿系统癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、胆管癌、胆囊癌、血管癌、阑尾癌和直肠癌；或者(ii)MCL-1相关癌症的方法，所述MCL-1相关癌症选自慢性淋巴细胞白血病和急性淋巴细胞白血病(待治疗的优选的癌症和肿瘤如本发明别处所述)，其中，所述方法包括向所需病人施用治疗有效量的本发明的化合物或组合物。

本发明还提供了一种治疗前列腺癌的方法(待治疗的优选的前列腺癌如本发明别处所述)，其中所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的如本文所定义的本发明的化合物或组合物。

本发明还提供了一种抑制患者中STAT3或STAT3通路(并由此治疗患者的癌症)的方法，其中所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的本发明化合物或组合物。优选的癌症和化合物如上所述。

治疗有效量将基于临床评估来确定并且可以随时监测。

除了对癌细胞的直接细胞毒性作用外，本发明人还表明，本发明主题的化合物在通过免疫疗法治疗癌症中具有实用性。在免疫治疗中，一个目标是刺激选定的免疫细胞，如抗原呈递树突状细胞(Dendritic cells，DCs)，这可以通过抑制STAT3信号转导来实现，从而调节促炎和抗炎特征。众所周知，STAT3抑制可能促进树突状细胞的促炎特征。这是免疫疗法中的理想效果。能够抑制癌细胞和/或对癌细胞具有细胞毒性并能够刺激相关免疫细胞的化合物是非常需要的。如实施例中所述，本发明化合物抑制pSTAT3，减少LPS诱导的IL-10和IL-12的产生，抑制DCs成熟(例如，如CD83所示)并抑制脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)诱导的成熟DCs中PD-L1和PD-L2的产生。因此，这些化合物代表了有前途的新型癌症免疫疗法。

目前的免疫检查点(Immune checkpoint，ICP)靶向药物，如PD-L1抑制剂，对所谓的“冷”肿瘤(尚未被T细胞浸润的非免疫原性肿瘤)表现不佳。因此，这种有前途的新型抗癌剂存在局限性，并且仍然需要额外的免疫调节剂来提高癌症治疗的效率。

此外，由于固有的肿瘤和局部适应性免疫抑制，肿瘤微环境(Tumourmicroenvironment，TME)会影响癌症免疫治疗的疗效。固有的肿瘤免疫抑制涉及遗传改变和不同的致癌途径，例如WNT–β-连环蛋白、丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activatedprotein kinase，MAPK)、Janus激酶(Janus kinase，JAK)–信号转导以及STAT3和核因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)信号通路的激活。这些信号通路与细胞因子和趋化因子的异常表达有关，这些异常表达在很大程度上决定了T细胞的排斥(“冷”免疫应答)或T细胞募集的抑制(“改变的”免疫应答)。因此，使用本文所述的STAT3抑制剂来调节TME是有利的，特别是与其他ICP靶向剂或TME调节剂联合使用。

因此，在另一方面，本发明提供一种用于癌症免疫治疗的本发明化合物(例如，式(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物)或其溶剂化物、其立体异构体、其互变异构体或其盐。

在另一方面，本发明提供一种用于癌症免疫治疗的本发明化合物(例如式(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物)或其溶剂化物、其立体异构体、其互变异构体或其盐，其中所述化合物与免疫检查点抑制剂和/或肿瘤微环境调节剂联合使用(即作为治疗方案的一部分施用)。

或者，本发明提供一种用于癌症免疫治疗的本发明化合物(例如式(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物)或其溶剂合物、其立体异构体、其互变异构体或其盐通过与免疫检查点抑制剂和/或肿瘤微环境(TME)调节剂联合、顺序或单独给药。

上面讨论了优选的癌症靶点，并且特别优选为前列腺癌，更具体地为CPRC。进一步优选的癌症靶点包括头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌(NSCLC、鳞状和非鳞状细胞癌)、黑色素瘤、尿路上皮癌和肾癌、默克尔细胞癌、难治性霍奇金淋巴瘤、微卫星不稳定性高的结直肠癌和胃癌。

优选的癌症靶标是“冷”肿瘤。

在本发明的又一方面提供一种药物包装或药物组合物，其包括：

(i)本发明的化合物；和

(ii)免疫检查点抑制剂和/或肿瘤微环境(TME)调节剂。

免疫检查点是本领域公知的，包括CTLA4、PD-1、PD-L1和PD-L2，根据本发明，这些也是优选的。检查点抑制剂也是本领域熟知的并且包括针对免疫检查点的抗体(例如针对CTLA4、PD-1、PD-L1和PD-L2的抗体)，例如伊匹单抗(Ipilimumab)、纳武利尤单抗(Nivolumab)、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)和德瓦鲁单抗(Durvalumab)。抗体是首选的免疫检查点抑制剂。

近年来，TME的重要性也得到了更大的认可，并成为治疗干预的目标(Nguyen等人,Journal of Cell Biology(2020)219(1):e201908224and Tang et al.,SignalTransduction and Targeted Therapy volume 6,Article number:72(2021))，并且TME调节剂是本领域已知的。可靶向的方面包括抗原呈递能力、免疫细胞浸润和肿瘤浸润。分子靶标包括MAPK、JAK、STAT3、β-连环蛋白、IDO和OX40，这些是本发明优选的TME靶标。就特定药物而言，节拍(低剂量)环磷酰胺或抗OX40抗体可能是优选的。

根据本发明的一种特别优选的组合是环磷酰胺(低/节拍剂量)和/或针对抗CTLA4、PD-1、PD-L1和PD-L2中的一种或多种的抗体以及本发明的化合物。

根据本发明治疗的受试者或患者优选是人类，但也考虑进行兽医治疗。

根据本发明的组合物(制剂)，例如药物组合物，可以例如以适合口服、鼻内、肠胃外、静脉内、局部、肿瘤内或直肠给药的形式呈现。如本文所用，术语“药物”包括本发明的兽医应用。

本发明定义的活性化合物(例如式(I)、(II)、(III)或(IV)化合物)可以常规药理学的给药形式呈现，例如片剂、包衣片剂、鼻腔喷雾剂、溶液、乳剂、脂质体、粉剂、胶囊或缓释剂型。

片剂可以例如通过将一种或多种活性成分与已知的赋形剂混合来制备，例如，与稀释剂如碳酸钙、磷酸钙或乳糖，与崩解剂如玉米淀粉或海藻酸，粘合剂如淀粉或明胶，与润滑剂如硬脂酸镁或滑石粉混合，和/或，与用于获得持续释放的试剂如羧基聚乙烯、羧甲基纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素或聚乙酸乙烯酯混合。

如果需要，片剂可以由几层组成。包衣片剂可通过包衣芯来生产，以与片剂类似的方式获得，包衣芯通常用于片剂包衣，例如聚乙烯吡咯烷酮或虫胶、阿拉伯树胶、滑石、二氧化钛或糖。为了获得持续释放或避免不相容性，所述芯也可以由几层组成。为了获得持续释放，片剂包衣也可以由几层组成，在这种情况下，可以使用上述片剂的赋形剂。

也可以使用器官特异性载体系统。

注射液可以例如以常规方式制备，例如通过添加防腐剂如对羟基苯甲酸盐，或稳定剂如EDTA。然后将溶液装入到注射小瓶或安瓿中。

鼻腔喷雾剂可以类似地配置成水溶液，并与气溶胶推进剂或手动压缩装置一起装入喷雾容器中。包含一种或多种活性成分的胶囊可以通过例如将活性成分与惰性载体如乳糖或山梨糖醇混合，并将混合物填充到明胶胶囊中来制备。

合适的栓剂可以例如通过混合活性成分或活性成分制品与为此目的设想的常规载体(例如天然脂肪或聚乙二醇或其衍生物)来制备。

本发明化合物优选通过注射给药，更优选腹腔注射给药。

对于小鼠的腹腔内注射，本发明化合物的合适剂量优选为5至100mg/kg，更优选25至50mg/kg。本领域技术人员很清楚如何调整这些剂量以用于其他给药模式和/或用于向其他受试者(例如人)给药。

现在将通过以下非限制性实施例描述本发明。

实施例1——功效证明

材料和方法

细胞培养和试剂

人前列腺癌细胞系LNCaP和22Rv1购自美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection，ATCC)，并在含有10％FCS的RPMI 1640培养基中培养。在含有10％FCS的DMEM培养基中培养293和DU145细胞(ATCC)。EPT3-M1-STAT3在含有10％FCS的Ham's F-12培养基中培养。隐丹参酮、IL-6购自(Sigma Aldrich，St.Louis，MI，USA)。S3I-201购自Thermo Fisher Scientific(Waltham，MA，USA)。

MTS测定

将PC3、22Rv1、LNCaP、EPT3-M1-STAT3细胞接种在96孔板中24小时，然后用不同剂量的323-1或323-2处理。3天后，通过加入10μL/孔的CellTiter

质粒和转染

使用脂质体(Lipofectamine)3000转染试剂(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)将HEK 293T细胞瞬时转染Cignal STAT3报告子(SABioscience，Qiagen，Venlo，Netherlands)24小时，然后用20ng/mL IL-6和指示浓度的323-1，323-2，S3I-201或隐丹参酮处理。荧光素酶活性使用发光酶标仪(Biotek)通过双荧光素酶检测试剂盒(Promega)进行测量。将数值标准化为DMSO载体的海肾荧光素酶活性。

DARTS分析

EPT3M1-STAT3细胞用含有蛋白酶(Roche，Basel，Switzerland，目录号11836153001)和磷酸酶抑制剂(Pierce目录号78420)的冷M-PER缓冲液(Thermo FisherScientific，Pierce目录号78501)裂解并离心(18,000×g在4℃下10分钟)。将裂解物稀释至相同的最终体积，并在TNC缓冲液[50mM的Tris-HCl(pH 8.0)，50mM的NaCl，10mM的CaCl

免疫荧光染色

用DMSO、20μM的323-1或323-2、100μM的S3I-201或5μM的隐丹参酮处理EPT3M1-STAT3细胞24小时。细胞用4％多聚甲醛固定，并用7μL的

SelectScreen

化合物323-1和323-2存在下，根据Invitrogen(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)中的Z'-LYTE

DNA结合测定

将DU145细胞接种，并分别用5-20μM的323-1或323-2，或100μM的S3I-201处理24小时。采用STAT家族转录因子检测试剂盒(Abcam，ab207228)进行核提取。首先，用冰PBS洗涤细胞，并在冰PBS中加入磷酸酶抑制剂混合物(125mM的NaF、250M的β-甘油磷酸酶、250mM的PNPP、25mM的NaVO3)并将细胞从培养皿中刮除。然后在4℃下以300×g收集细胞5分钟。将沉淀重悬于低渗缓冲液(20mM的pH7.5的Hepes，5mM的NaF，10μM的Na

蛋白质印迹分析

按照Liu等人(Chem Biol.2014；21:1341-50)描述的程序，通过蛋白质印迹法测定磷酸化STAT3(Y705)、STAT1、MCL1、pSTAT1(Y701)、pSTAT1(S727)和STAT3蛋白的表达水平。来自英国剑桥Abcam的以下抗体用于蛋白质印迹：抗-pSTAT3(Tyr705)(ab76315，1/5000)；抗-总STAT3(ab119352，1/2500)；抗-pSTAT1(Y701)(ab30645，1/500)；抗-pSTAT1(S727)(ab86132，1/500)；抗-总STAT1(ab47425，1/500)；抗-JAK2(ab108596，1/1000)；抗-SRC(ab47405，1/500)；抗-PARP(G7341，1/1000)；抗-MCL1(ab32087，1/1000)；抗-细胞周期蛋白D1(ab10540，1/500)；抗-BCL-XL(ab32370，1/500)；抗-生存素(ab76424，1/2000)；抗-β-肌动蛋白(ab8226、ab8227、1/2000)；抗-GAPDH(ab181602，1/2500)；抗-HA(ab9110，1/5000)；抗-FLAG(DDDDK标签)(ab1162，1/10000)。

免疫共沉淀

用10μg/10cm培养皿FLAG-STAT3和10μg/10cm培养皿HA-STAT3质粒转染7.5×10

STAT3的计算对接

分子对接工具Maestro 9.0Glide利用化合物323-1和323-2与STAT3的三维晶体结构的计算对接，包括磷酸化的(PDB条目1BG1)和非磷酸化的(PDSB条目3CWG)结构，如郑等人所述(Mycobacterium smegmatis.FEBS Letters.2018；592:1445-57)。化合物323-1和323-2的低能构象异构体是由maestro的Ligprep模块生成的，而蛋白质模型是通过去除结晶溶剂分子、重新分配键序和补充氢原子建立的。OPLS-2005力场中的能量最小化采用的rmsd小于

荧光偏振(Fluorescence Polarization，FP)测定

FP测定如赵等人(J Biol Chem.2010；285:35855-65)所述进行。标记的磷酸肽5-FLU-G(P-TYR)LPQTV-NH2由ProImmune(英国伦敦)合成，纯度超过95％，作为探针。重组人STAT3蛋白购自Abcam(ab43618)。对于饱和曲线，将不同浓度的肽探针(0-100nM)和STAT3蛋白(0-1000μM)在缓冲液(50mm NaCl，10mm HEPES，1mm EDTA，0.1％Nonidet P-40)中室温下孵育30分钟。为了获得抑制效果，将药物(0-1000μM)和150nM人STAT3在37℃下孵育1小时，然后在室温下与10nM标记的LPQTV肽共同孵育30分钟。将平板在氮气下密封并在室温下放置72小时。然后通过BioTek Synergy

体内抗肿瘤活性

4周龄雄性BALB/c-nu裸鼠(15-20g)获自上海必凯实验动物有限公司(中国上海)。在第二军医大学实验动物中心，动物被饲养在无特定病原体的条件下，随意供应食物和水。所有动物实验均按照《国家卫生研究院实验动物护理和使用指南》进行，并经中国第二军医大学动物实验伦理委员会批准。收集LNCaP细胞并在PBS中重新悬浮。将总共5×10

统计学

通过学生t检验或SAM(微阵列的统计分析)微阵列数据确定各组的显著性，P值<0.05被认为是显著的。

结果

化合物323-1和323-2是STAT3而非STAT1通路的调节剂

在对近600种天然化合物的筛选中，发现(15R,2R)-地拉韦啶A(化合物323-1)和(15S,2R)-地拉韦啶A(化合物323-2)在治疗24小时后以剂量依赖的方式有效抑制人前列腺肿瘤起始细胞(Tumor-initiating cells，TICs)和其他肿瘤细胞的增殖。测试的细胞是PC3、22Rv1、LNCaP、EPT3-M1-STAT3-GFP，结果如图1-4所示。

为了获得图1-4所示的结果，用指定剂量的化合物323-1和323-2处理不同的细胞系72小时。所有数据均表示为平均值±标准差(n＝3)。通过使用未配对的双尾学生t检验验证显著性。*p≤0.05。

化合物323-1和323-2的全合成如张等人(Journal of the American ChemicalSociety.2017；139:5558-67)先前报道的那样进行。通过

为了证实化合物323-1和323-2对STAT3活性的抑制作用，在IL-6存在下用323-1、323-2或市售STAT3抑制剂S3I-201和隐丹参酮处理24小时后，在293T细胞中使用STAT3-荧光素酶报告载体进行荧光素酶测定。结果如图5所示。

在无细胞试验中，S3I-201的IC-50为86 μM，显示出对STAT3的DNA结合活性的有效抑制，对STAT1和STAT5的活性较低，以及对细胞系的STAT3抑制通常在50至100μM的浓度下。

隐丹参酮是一种STAT3抑制剂，在无细胞试验中IC50为4.6μM，强烈抑制STAT3的Tyr705的磷酸化，但对STAT1和STAT5均无抑制作用。据报道，隐丹参酮通常在5至50μM的浓度下抑制细胞系的STAT3。

如图5所示，化合物323-1和323-2表现出比隐丹参酮更强的对STAT3激活的抑制作用。

为了获得图5所示的结果，在20ng/mL的IL-6存在下，用不同剂量的化合物323-1或化合物323-2、S3I-201或隐丹参酮(Cryptotanshinone，Crypt)处理STAT3荧光素酶报告子转染的HEK293T细胞24小时。所有数据均表示为平均值±标准差(n＝3)。通过使用未配对的双尾学生t检验验证显著性。*p≤0.05。

测试了STAT3和STAT1在不同细胞系中的表达，发现三种细胞系(LNCaP，DU145，EPT3-M1-STAT3)表达了较高的STAT3基础水平，而三种细胞系(PC3，DU145，EPT3-M1-STAT3)显示丰富的STAT1基础表达(见图6和7)。在这些细胞系中，IL-6处理15分钟后，仅在LNCaP细胞而不在DU145或EPT3-M1-STAT3细胞中诱导STAT3在Tyr705上的磷酸化，并且不影响总的STAT3(见图8)。

为了获得图6所示的结果，使用具有特异性抗体的蛋白质印迹法来检查细胞裂解物。

为了获得图7所示的结果，用10ng/mL的IL-6处理各种细胞系15分钟，并用特异性抗体的蛋白质印迹法检测裂解物。

为了获得图8所示的结果，LNCaP细胞用DMSO，20μM的323-1或323-2或5μM的隐丹参酮处理24小时，然后用或不用10ng/mL的IL-6处理最后15分钟。

发现323-1和323-2抑制LNCaP细胞中IL-6诱导的STAT3在Tyr705上的磷酸化(见图9)，但不能抑制含IFN的PC3细胞中STAT1在Tyr-701上的磷酸化(见图10)。据报道，磷酸化STAT1(S727)可促进AML细胞增殖，并伴有JAK-STAT通路激活。值得注意的是，323-1和323-2具有对磷酸化的STAT3(Tyr705)而非pSTAT1(S727)的选择性抑制作用(见图11)。如图11所示，323-1和323-2抑制了各种STAT3高细胞中在Tyr705位点上磷酸化STAT3的表达，尤其是在DU145细胞中具有比S3I-201更好的效果。通过在STAT3高表达的EPT3M1细胞中用融合GFP-STAT3进行免疫荧光测定进一步证实了这一点(见图12)。综上所述，这些发现表明323-1和323-2是STAT3的小分子抑制剂。

为了获得图9所示的结果，LNCaP细胞用DMSO，20μM的化合物323-1或323-2或5μM的隐丹参酮处理24小时，然后用或不用10ng/mL的IL-6处理最后15分钟。

为获得图10所示的结果，PC3细胞用DMSO、20μM的化合物323-1、20的μM的化合物323-2、100μM的S3I-201或5μM的隐丹参酮处理24小时，然后用或不用500IU/mL的IFNγ处理最后15分钟。

为了获得图11所示的结果，用指定剂量的化合物323-1、化合物323-2或S3I-201处理DU145细胞24小时。

为获得图12所示的结果，细胞用DMSO、20μM的化合物323-1、20μM的化合物323-2、100μM的S3I-201或5μM的隐丹参酮处理24小时。

323-1和323-2降低了STAT3靶基因MCL1的蛋白水平

据报道，异常的STAT3调节参与抗凋亡(Bcl-2、Mcl-1、生存素和Bcl-xL)、细胞周期(细胞周期蛋白D1和c-Myc)、血管生成(VEGF和HIF1α)、侵袭和转移(MMP-1、MMP-2、MMP-9)以及抑制宿主免疫监视的下游靶基因的表达。为了进一步鉴定323-1和323-2的特性特征，用323-1和323-2处理DU145、EPT3-M1-STAT3和LNCaP细胞，然后进行蛋白质印迹。图11显示，这两种化合物剂量依赖性地下调了LNCaP细胞中细胞周期蛋白D1的表达，而不是BCL-XL的表达。化合物323-1和323-2抑制两种细胞系中STAT3靶基因MCL1的蛋白质水平，但不抑制EPT3-M1-STAT3和LNCaP细胞中的生存素或PARP(见图13)。结果表明323-1和323-2调节STAT3靶基因表达。

为获得图13所示的结果，EPT3M1-STAT3或LNCaP细胞分别用DMSO、20μM的化合物323-1、或20μM的化合物323-2处理48小时。对裂解物进行分析，并进行蛋白质印迹。

323-1和323-2不影响STAT3与DNA的结合

据报道，许多STAT3抑制剂靶向STAT3的DBD或抑制SH2结构域与pTyr705残基的结合，以进行二聚化或抑制Tyr705的磷酸化以进行激活。由于与其他蛋白质(如Src)相比，SH2结构域高度保守区域内的序列高度相似，以及当前流行的STAT3SH2结构域抑制剂抑制异常STAT3通路的能力不足，因此靶向STAT3的DBD的兴趣正在增加。为了确定化合物323-1和323-2是否靶向STAT3的DBD，从用药物处理24小时的细胞中提取核裂解物，并与含有STAT共有结合位点的寡核苷酸一起孵育，然后添加相关的一抗(STAT1、STAT3、STAT5a或STAT5b)。与STAT3 DBD抑制剂S3I-201相比，323-1和323-2都不影响STAT1、STAT3、STAT5A、STAT5B的DNA结合域(参见图14)。

为获得图14所示的结果，将DU145细胞接种并用5-20μM的化合物323-1或化合物323-2处理24小时。然后根据材料和方法中所描述的方案，从细胞裂解物中提取核蛋白用于与STAT1、STAT3和STAT5的DNA结合检测。完全裂解缓冲液(Complete Lysis Buffer，CLB)设置为空白。将Nb2核提取物(催乳素刺激的)与野生型寡核苷酸(野生型，与样品核提取物竞争STAT)或突变寡核苷酸(突变的，对样品核提取物结合STAT的能力没有影响)一起加入到预涂抹的96孔中，以STAT寡核苷酸作为对照来监测分析的特异性。

323-1和323-2直接靶向STAT3并破坏STAT3二聚化

为了直接解决323-1和323-2是否靶向STAT3蛋白的问题，使用药物亲和反应的靶点稳定性(Drug affinity responsive target stability，DARTS)分析进行靶向鉴定，其依据是靶向蛋白和药物的结合对于蛋白酶更稳定。在图15-18中，蛋白质印迹显示了靶蛋白STAT3的保护作用，而非靶蛋白STAT1、JAK2、Src和β-肌动蛋白的消化作用确没有被323-1和323-2改变。这表明化合物323-1和323-2直接靶向STAT3。

EPT3M1-STAT3细胞裂解物的制备如Lomenick等人(Proc Natl Acad SciUSA.2009；106:21984-9)所述，用200μM的323-1或200μM的323-1或等量的载体(DMSO)孵育1小时，然后1.25mg/mL的链霉蛋白酶(1：100储备溶液)使用1×TNC缓冲液以1：3000、1：1000和1：300的稀释比制备连续链霉蛋白酶储备等分试样1小时。然后用针对STAT3(图15，ab119352，1：2500)，STAT1(图16，ab119352)，Src(图17)，JAK2(图18)的抗体对样品进行蛋白质印迹。

STAT3二聚体的核转位介导STAT3转录活性。为了测试化合物323-1和323-2是否是STAT3二聚化抑制剂，用HA-标记的STAT3和FLAG-标记的STAT3质粒瞬时转染293T细胞，然后用化合物323-1(50μM)和323-2(50μM)或S3I-201(200μM)刺激24小时，接着用抗-FLAG抗体免疫沉淀以下拉STAT3相关蛋白，然后进行蛋白质印迹并用抗-HA、抗Flag或抗β肌动蛋白抗体孵育。如图19所示，与S3I-201相比，确认化合物323-1和323-2可以破坏STAT3的二聚化。

分子对接数据支持323-1和323-2靶向STAT3的SH2结构域

STAT3 SH2结构域(残基583-688)包含三个亚口袋：PY、PY+1和PY+X。STAT3 SH2结构域促进STAT3的磷酸化和二聚化，因为它在STAT3单体和相关受体内的磷酸酪氨酸基序之间存在关联。迄今为止，STAT3 SH2结构域已成为发现和开发小分子调节剂的主要治疗靶点。几种新的STAT3 SH2结构域结合抑制剂已通过计算机计算筛选试验将化合物对接至STAT3 SH2结构域(例如S3I-201)而得到认定。

为了确认化合物323-1和323-2与STAT3结合，使用了计算机计算模型和荧光偏振(Fluorescence Polarization，FP)分析。计算对接和分子动力学模拟确定了STAT3的SH2D中化合物323-1和323-2的潜在结合位点(参见图30-32)。在与磷酸化(PDB条目1BG1)STAT3的分子对接中，两种化合物似乎都具有与STAT3 SH2结构域中的三个口袋PY、PY+1和PY-X的潜在结合能力，而S3I-201似乎只能结合到PY和PY-X口袋，而不能与PY+1口袋结合。如图31所示，化合物323-1中异喹啉基的氮与Gln635形成氢键，甲醛基上的羰基氧与Glu638形成氢键。pY+1口袋主要是疏水区域，小分子骨架环戊[de]异喹啉正对着这个口袋，与周围的氨基酸残基(IIe634、Ser636、Val637)形成疏水相互作用。化合物323-1中喹啉基的氮与Glu 594形成氢键，甲醛基上的羰基氧面向pY结合袋与Arg609形成氢键，Arg609可与磷酸酪氨酸705形成正极性。Arg609的作用可以抑制SH2与磷酸酪氨酸705的结合。小分子骨架环戊[de]异喹啉面向pY-X结合口袋，并与相邻的氨基酸残基(Phe588、IIe589、Ser590、Val637)疏水地相互作用。类似地，化合物323-2与STAT3 SH2结构域中的PY、PY+1和PY-X口袋(Gln635、Glu638、IIe634、Ser636、Val 637、Arg 595、Lys 591)形成键(参见图30)。

据报道，未磷酸化的STAT3也可以二聚化，从细胞质进入细胞核与DNA结合，并作为转录激活因子进行调节。在与非磷酸化(PDB条目3CWG)STAT3结构的对接中，预测化合物323-1和323-2都通过残基Lys-591内的氢键直接与Tyr(P)-结合亚基直接相互作用(参见图32)。此外，化合物323-1和323-2的环戊[de]异喹啉与四氢环戊烷结合的pY-X结合口袋联系，并形成由残基Phe588、IIe589、Ser590、Val637排列的疏水相互作用。总之，这些数据表明化合物323-1和323-2是通过破坏STAT3二聚化的STAT3 SH2结构域抑制剂，进一步支持DARTS分析的结果。

323-1和323-2取代了STAT3与荧光素标记的pTyr-肽GpYLPQTV-NH2的结合

通过竞争性结合FP试验进一步证实了计算机预测，该试验检测了标记的磷酸肽5-FLU-G(P-TYR)LPQTV-NH2与配体人重组STAT3蛋白的结合的药物取代。磷酸酪氨酸肽GpYLPQTV对应于IL-6受体的gp-130亚单位内的残基903-909，其已被证实结合STAT3-SH2结构域。最近一直在寻求针对STAT3 SH2的策略。这些小分子抑制剂被设计成通过与p-Tyr705竞争来结合位于STAT3 SH2结构域中的位点。

由于STAT3可能在磷酸酪氨酸残基内被募集到gp130，因此利用竞争性结合FP试验来鉴定323-1和323-2是否靶向STAT3 SH2结构域。图20显示了10nM的GpYLTQTV-NH2和150nM的人STAT3蛋白的结合以及药物浓度增加的荧光偏振(Fluorescence Polarization，FP)分析。图20显示323-1和323-2破坏了STAT3与磷酸酪氨酸肽GpYLPQTV的结合，Ki值分别约为94μM和75μM。

化合物323-1和323-2破坏STAT3/GpYLPQTV的能力比约529μM的S3I-201的Kd值高约5倍。值得注意的是，323-1和323-2在浓度高于200M时极化都有所增加，这些化合物在测量的波长下似乎没有荧光，因此在高浓度下，药物和荧光团之间可能会发生一些相互作用，从而由于它们的自发荧光而降低荧光团的迁移率。这是通过在存在高浓度药物和没有STAT3的情况下测量肽的极化来检查(参见图21和22)。将不同剂量的药物与10nM的GpYLTQTV-NH2(图21)或150nM的人STAT3蛋白(图22)结合，以检查药物的自发荧光是否影响最终信号。

为了减去背景并最小化自发荧光的干扰，仅使用肽和配体给药来验证蛋白质-配体相互作用的功效，323-1的Ki值为94M，323-2的Ki值为75M(见图33)。

图33显示了通过应用10nM的GpYLTQTV-NH2和增加药物剂量的背景扣除的荧光偏振分析。对照设定为1％ DMSO。数据代表两个独立的实验。

综上所述，这些数据证实了323-1和323-2通过破坏STAT3磷酸酪氨酸-肽的结合而直接成为STAT3 SH2抑制剂，这与计算对接和DARTS分析一致。

323-1和323-2降低了形成集落的能力并诱导了细胞凋亡

在体外克隆形成试验中研究了323-1和323-2对克隆形成的抑制作用，这与裸鼠中的致瘤性非常一致。在接种单细胞后的第二天，加入不同浓度的323-1和323-2，使细胞生长2周以形成集落，然后用0.4％结晶紫(w/v)染色。在暴露于323-1和323-2后，在四种癌细胞系DU145、PC3、EPT3M1-STAT3和22Rv1细胞中明显观察到集落形成的浓度依赖性抑制(见图23)。

在DU145细胞中评估化合物323-1和323-2的抗凋亡作用。如图24所示，323-1和323-2在许多细胞中诱导出类似凋亡的变化，并且似乎在被处理72小时的DU145细胞中诱导凋亡。相比之下，化合物323-1和323-2对细胞凋亡的诱导比隐丹参酮弱得多，据报道隐丹参酮具有高细胞毒性作用。

图24表明在DU145细胞中用323-1、323-2或隐丹参酮处理72小时所诱导的细胞凋亡的流式细胞术分析。数据显示为三个实验的代表性结果。

总之，所有这些结果表明化合物323-1和323-2通过诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖和克隆形成而具有体外抗肿瘤活性。

化合物323s逆转CRPC肿瘤的发展

为了进一步测试化合物323-1和323-2抗前列腺癌的效果，将人前列腺癌细胞系LNCaP(其表达全长雄激素受体)注射到NOD/SCID小鼠中，以建立人源化NOD/SCID小鼠CRPC模型。将总共5×10

连续三周每天通过IP注射媒介物(橄榄油)或化合物323-2(在媒介物中为20mg/kg或40mg/kg)来治疗小鼠。每次药物注射前测量体重和肿瘤体积。第22天后，处死小鼠，收集肿瘤，称重，并在-70℃下保存。

图34显示了在死亡当天从每组收获的LNCaP肿瘤的照片。图35显示了每组动物在死亡当天的肿瘤体积和重量。图36显示了每组中收获的代表性LNCaP肿瘤的H&E染色。

这些数据表明，化合物323-2显著抑制CRPC肿瘤生长，特别是对于高剂量组(40mg/kg)。在整个给药过程中，没有观察到明显的体重变化，也没有小鼠死亡。

免疫治疗相关工作

通过Ficoll-Paque密度离心法从健康供体的外周血中分离出低血小板外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。用CD14+微珠(来自MiltenyiBiotec的泛单核细胞分离试剂盒)通过免疫磁性选择从上述PBMCs中获得单核细胞，并将0.5×10

化合物323-1和323-2在树突状细胞中引发免疫抑制

测定了化合物323-1和323-2以及各种对照对LPS诱导的细胞因子IL10、IL-12p70、共刺激分子和成熟标记物(CD80、CD83、CD86、HLA-DR、CCR7)以及程序性死亡配体1(Programmed death-ligand-1，PD-L1)和程序性死亡配体2(Programmed death-ligand-2，PD-L2)的表达的影响。

用化合物323-1或323-2处理24小时后，两种化合物都显著减少了IL-10和IL-12p70的分泌(图37)。

值得注意的是，323s明显抑制LPS诱导的树突状标记物(CD80、CD83、CD86、HLA-DR、CCR7)。有趣的是，PD-L1和PD-L2的表达也观察到了类似的免疫抑制作用。流式细胞术分析的结果如图38所示。前两行是对照，化合物154和S-31201中有两个阳性对照。S-3I201是一种已知的商用STAT3抑制剂，154已作为双重AR/STAT3抑制剂被公布。与这两种STAT3抑制剂相比，323s作为PD-L1/L2调节剂更有效。

目前PD-L1的免疫检测点抑制剂已被证明是癌症免疫治疗的有效方法。因此，化合物323-1和323-2在STAT3i检查点阻断免疫学中也具有潜力。

323-1和323-2是JAK3、TYK1、TGFB1、MAP2K4和FRAP1激酶抑制剂

STAT3在酪氨酸磷酸化时的激活可由细胞因子受体相关激酶如JAKs、某些生长因子受体酪氨酸激酶(RTKs)如EGF、FGF、PDGF和VEGF以及非受体相关酪氨酸激酶如Src。323-1和323-2的选择性通过表1中针对36种关键激酶的激酶谱来检测。

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在36种激酶中，发现化合物323-1和323-2均能抑制这些激酶，JAK3、TYK1、TGFB1、MAP2K4和FRAP1(参见图25-29)，这有助于STAT3激活。在无细胞测定中，323-1的JAK3酶活性的IC

通过Z′-LYTE

实施例2-合成方法

化合物323-1和323-2的盐

将27.7g(0.1mol)化合物323-1或323-2样品和17.7g(0.1mol)富马酸(或0.1mol另一种有机酸或无机酸)溶解在200mL乙醇中，然后在水浴中加热直至所有样品溶解。溶液用硅藻土过滤，缓慢冷却滤液，在0-5℃下静置5小时。晶体沉淀、过滤和干燥获得化合物323-1或323-2的富马酸盐(或其他)。

化合℃323-1和323-2的醇和酯衍生物

在0C和氮气保护条件下，将27.7mg(0.1mmol)化合物323-1或323-2、5mLTHF和57mg(1.5mmol)LiAlH

在0℃和氮气保护的条件下，将27.9mg(0.1mmol)化合物I、10mL的THF羧酸(0.12mmol)、DCC(1.5mmol)和DMAP(0.5mmol)加入到25mL双颈烧瓶中，然后在室温下搅拌反应24小时。过滤除去二环己基脲，滤液用0.5mol/L盐酸洗涤两次，随后再用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次。用无水硫酸镁干燥有机相，真空蒸发溶剂获得白色固体，然后通过硅胶柱色谱，用乙酸乙酯：石油醚＝2：1洗脱得到固体产物化合物II-1。

化合物323-1和323-2的羧酸和酯衍生物

在0℃和氮气保护的条件下，将27.7mg(0.1mmol)化合物323-1或323-2、2mL的H

在0℃和氮气保护的条件下，将29.3mg(0.1mmol)化合物III、10mL的THF醇(0.12mmol)、DCC(1.5mmol)和DMAP(0.5mmol)加入到25mL双颈烧瓶中，然后在室温下搅拌反应24小时。过滤除去二环己基脲。用0.5mol/L盐酸洗涤滤液两次，然后用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次。有机相经无水硫酸镁干燥，真空蒸发溶剂得到白色固体，可经硅胶层析，用乙酸乙酯：石油醚＝2：1洗脱获得固体产物IV-1。

化合物323-1和323-2的缩醛衍生物

在0℃和氮气保护下，将27.7mg(0.1mmol)化合物323-1或323-2、无水甲醇(2.0mL)和催化量的PPTS(0.008g，0.032mmol)加入到25mL双颈烧瓶中。搅拌反应混合物1小时，然后用CH

在0℃和氮气保护的条件下，将32.3mg(0.1mmol)化合物V-1、5mL CH

化合物323-1和323-2的卤化衍生物

在室温下，在15分钟内向装有化合物323-1或323-2(277mg，1.0mmol)的CH

将吖嗪-N-氧化物sxx(586mg，2.0mmol)，三乙胺(0.53mL，4.0mmol)的二溴甲烷(3mL)溶液加入到反应瓶中。将所得溶液冷却至约-60℃，然后滴加草酰溴溶液(0.57mL，4.0mmol)。0.5小时后，加入MeOH(0.5mL)淬灭反应混合物。将反应温热至室温。用饱和NH

向装有磁力搅拌棒的反应管中，加入化合物323-1或323-3(69.29mg，0.25mmol)，溴化钠(127mg，1.25mmol)，过硫酸钾(135mg，0.5mmol)和1.0mL二氯甲烷(DCM)。室温下，在密闭的试管中搅拌混合物。TLC监测反应。产物可以用EtOAc萃取，合并的有机层用Na

化合物323-1和323-2的氧化衍生物

在80℃搅拌化合物323-1或323-2(277mg，1mmol)、TBHP(1.14mL，10mmol)和依布硒(63.5mg，0.25mmol)的叔丁醇(5mL)溶液，直到底物耗尽。30小时后，过滤黄色固体并加入少许钯＝石棉(10％)以分解过氧化物，并在真空中蒸发溶剂。粗固体残余物可以通过硅胶柱色谱纯化(己烷/EtOAc＝4/1)，得到如下所示的纯化合物3。

在0℃下，向化合物3(291mg，1mmol)的MeOH(4.2mL)和CH

化合物323-1和323-2的酰胺衍生物

在氩气下，将二苯基磷酰叠氮化物(1.2eq)添加到化合物323-1或323-2(279mg)的醇衍生物的无水甲苯([酒精]＝0.7-1.2M)溶液中。将反应混合物冷却至0℃，搅拌10分钟，然后在20分钟内缓慢加入DBU(1.2eq)。将混合物在0℃下搅拌2小时，然后在室温下搅拌20小时，并在真空中除去溶剂。将残留物溶解在1:1的乙酸乙酯/己烷混合物中，通过短硅胶板过滤、浓缩、溶解在干燥的THF([叠氮化物]＝0.1M)中，并添加Ph

在0℃下，向羧酸(7mmol)的无水二氯甲烷(20mL)搅拌混合物中滴加二环己基碳二亚胺(7mmol)的二氯甲烷(15mL)溶液，然后加入化合物323-1或323-2(279mg，1mmol)的伯胺的二氯甲烷(15mL)溶液。在0℃下搅拌混合物30分钟，然后再升温至室温搅拌2小时。反应完成后，添加0.5mL乙酸，并再搅拌混合物30分钟。过滤除去不溶的二环己基脲。除去溶剂后，可将残余物溶解在乙醚中，然后再次过滤。通过用饱和NaHCO

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化合物323-1和323-2的胺衍生物

向装有磁力搅拌器的通气的100mL双颈烧瓶中，加入1mmol化合物323-1或323-2的氨化物、0.8g(20mmol)NaBH

蒸发有机溶剂可以得到产物323-1/2的胺衍生物(如下所示的化合物6)。

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