一种维格列汀原料中氯乙酰氯杂质检查方法及其应用

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，涉及一种维格列汀原料中氯乙酰氯杂质检查方法及其应用，具体提出一种采用气相色谱法测定维格列汀原料中氯乙酰氯杂质含量的方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

维格列汀是一种治疗2型糖尿病的药物，是具有选择性、竞争性、可逆的DPP24抑制剂。维格列汀通过与DPP24结合形成DPP24复合物而抑制该酶的活性，在提高GLP21浓度，促使胰岛β细胞产生胰岛素的同时，降低胰高血糖素浓度，从而降低血糖。相比其他降血糖类药物，对体重无明显影响，降低总胆固醇，耐受性好，不良反应发生概率低。在维格列汀的合成过程中用到了氯乙酰氯，氯乙酰氯对眼睛、皮肤粘膜和呼吸道有强烈的刺激作用，吸入可能由于喉、支气管的痉挛、水肿、炎症、化学性肺炎、肺水肿而致死。因此对维格列汀中的氯乙酰氯进行研究是十分重要的。

目前已有的氯乙酰氯检查方法有①电位滴定法，其优势为准确度高、速度快，缺点为：专属性差，不适用于微量杂质的检查。②液质联用(高效液相串联质谱法)，其优势为检验灵敏度高，专属性强，缺点为：样品需进行衍生化前处理，衍生条件苛刻，不确定性大，所用试剂对人体、环境有害，仪器价格昂贵，操作复杂。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明提供一种维格列汀原料中氯乙酰氯杂质检查方法及其应用。本发明过对检测方法进行系统性优化，从而确定气相色谱针对维格列汀中氯乙酰氯杂质的最佳检测方法，其具有专属性强、高灵敏度、样品用量少、定量限重复性好、试验使用试剂安全环保无害、仪器操作简便、可适用于大多数实验室使用等优点。基于上述研究成果，从而完成本发明。

具体的，本发明的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供一种维格列汀原料中氯乙酰氯杂质检查方法，所述方法包括基于气相色谱采用溶液直接进样法对维格列汀原料中氯乙酰氯杂质进行检测，其中所述溶液中使用的溶剂为无水乙醇，从而减少对人体与环境的危害。

具体的，所述方法包括：

气相色谱仪检测器为氢火焰离子化检测器(FID)，检测器温度为240-260℃，进样口温度为240-260℃，色谱柱采用二甲基聚硅氧烷毛细管色谱柱，程序升温，初始柱温：70-90℃，保持4-6min，以5-15℃/min的速度升温至190-210℃，维持15-20min。

本发明通过系统优化上述检测参数条件，最终获得具有专属性强、高灵敏度、样品用量少、定量限重复性好、准确度高、耐用性强、试验使用试剂安全环保无害、仪器操作简便、可适用于大多数实验室使用等优点的氯乙酰氯检查方法。

本发明的第二个方面，提供上述检查方法在维格列汀品质控制中的应用。

所述应用具体为判断评估维格列汀原料中的氯乙酰氯有无和含量。

上述一个或多个技术方案的有益效果：

上述技术方案提供一种适用于维格列汀中氯乙酰氯杂质的分析方法，具体采用气相色谱法测定维格列汀原料中氯乙酰氯杂质含量，通过对检测方法进行系统性优化，从而确定气相色谱针对维格列汀中氯乙酰氯杂质的最佳检测方法，该方法与其它分析方法相比，具有专属性强、高灵敏度、样品用量少、定量限重复性好等、试验使用试剂安全环保无害等优点，因此非常适合对维格列汀中氯乙酰氯杂质的检测，从而有利于对维格列汀的产品质量控制，具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例中典型检测图谱。

图2为本发明实施例中维格列汀氯乙酰氯检查线性曲线图。

具体实施方式

需要指出的是，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明。

如前所述，目前已有的氯乙酰氯检查方法包括电位滴定法和液质联用等，但仍存在专属性差，灵敏度低，或者样品需进行衍生化前处理，衍生条件苛刻，不确定性大，所用试剂对人体、环境有害，仪器价格昂贵，操作复杂等缺点。

有鉴于此，本发明提供一种维格列汀原料中氯乙酰氯杂质检查方法，所述方法包括基于气相色谱采用溶液直接进样法对维格列汀原料中氯乙酰氯杂质进行检测，其中所述溶液中使用的溶剂为无水乙醇，从而减少对人体与环境的危害。

本发明的又一具体实施方式中，所述方法包括：

气相色谱仪检测器为氢火焰离子化检测器(FID)，检测器温度为240-260℃(优选为250℃)，进样口温度为240-260℃(优选为250℃)，色谱柱采用二甲基聚硅氧烷毛细管色谱柱，程序升温，初始柱温：70-90℃(优选为80℃)，保持4-6min(优选为5min)，以5-15℃/min(优选为10℃)的速度升温至190-210℃(优选为200℃)，维持15-20min(优选为18min)；本发明对上述色谱条件进行筛选优化，最终获得的色谱图具有与相邻峰分离良好，灵敏度高等特点。

如上所示，试样采用无水乙醇进行溶解稀释，采用直接进样法，流速为每分钟1.0-3.0ml(优选为2.0ml)；分流比5-15:1(优选为10:1)。

所述进样体积为1-5μl，优选为2μl，定量方法采用外标法。

检查方法中所使用的对照品为氯乙酰氯(标准品)的无水乙醇溶液。

本发明的又一具体实施方式中，采用外标法以峰面积计算氯乙酰氯的有无和含量；含氯乙酰氯不得过15ppm。

计算公式：

As为供试品溶液中氯乙酰氯的峰面积；

Ar为对照品溶液中氯乙酰氯的峰面积；

Ws为供试品的称样量，mg；

Wr为对照品的称样量，mg。

更具体的，所述色谱柱选用6％氰丙基苯基-94％二甲基聚硅氧烷毛细管色谱柱(DB-624，0.53mm×30m×3μm)。

本发明通过系统优化上述检测参数条件，最终获得具有专属性强、高灵敏度、样品用量少、定量限重复性好、准确度高、耐用性强、试验使用试剂安全环保无害、仪器操作简便、可适用于大多数实验室使用等优点的氯乙酰氯检查方法。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述检查方法在维格列汀品质控制中的应用。

所述应用具体为判断评估维格列汀原料中的氯乙酰氯有无和含量。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中用到的所有原料除特殊说明外，均为市购获得。

实施例

氯乙酰氯作为一种高活性物质易于水解或与其他试剂发生反应，溶液稳定性差。本试验采用的进样方式为直接进样溶剂使用无水乙醇减少对人体与环境的危害。

初始条件：用6％氰丙基苯基-94％二甲基聚硅氧烷毛细管色谱柱(DB-624,0.53mm×30m×3μm)；起始温度80℃，维持5分钟，以每分钟10℃升温至200℃，维持23分钟；流速为每分钟2.0ml；检测器为氢火焰离子化检测器(FID)，检测器温度250℃，进样口温度250℃；

溶液配制与摸索过程：

取氯乙酰氯约150mg，精密称定，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释刻度，摇匀，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液；

精密量取对照品贮备液5ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液1(7.5μg/ml)；

精密量取对照品贮备液1ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液2(1.5μg/ml)。

色谱条件1)分流比为5:1。

精密量取对照品溶液1(7.5μg/ml)和对照品溶液2(1.5μg/ml)各5μl，分别注入气相色谱仪，记录色谱图。

由色谱图知，对照品溶液1，氯乙酰氯为7.7mv(按噪音0.05计算，是15倍定量限)；对照品溶液2，氯乙酰氯为1.45mv(按噪音0.05计算，是2.9倍定量限)。

取维格列汀约200mg，精密称定，加对照品溶液1(7.5μg/ml)2ml溶解，摇匀，作为混合溶液1。

取维格列汀约200mg，精密称定，加对照品溶液2(1.5μg/ml)2ml溶解，摇匀，作为混合溶液2。

色谱条件2)继续增大分流比，增加其响应值，分流比改为2:1。

精密量取对照品溶液2(1.5μg/ml)和混合溶液2各5μl，分别注入气相色谱仪，记录色谱图。

由色谱图知，对照品溶液2，氯乙酰氯为2.6mv(按噪音0.05计算，是5倍定量限)。响应值良好。混合溶液2，氯乙酰氯为2mv(按噪音0.4计算，是0.5倍定量限)，噪音太大。后续增加柱温。

色谱条件3)柱温改为起始温度80℃，维持5分钟，以每分钟10℃升温至200℃，以每分钟10℃升温至250℃，维持18分钟；

精密量取对照品溶液2(1.5μg/ml)和混合溶液2各5μl，分别注入气相色谱仪，记录色谱图。

由色谱图知，氯乙酰氯为2.61mv(按噪音0.05计算，是5.2倍定量限)，灵敏度良好，预回收率是98％，回收率良好。

换不同时间，重复进对照品溶液2(1.5μg/ml)和混合溶液2，氯乙酰氯为1.7mv(按噪音0.05计算，是3倍定量限)，比前一天有所降低(降低1倍定量限)。应是进样体积太大导致，后续降低进样体积。

精密量取对照品溶液1(7.5μg/ml)和混合溶液1各2μl，分别注入气相色谱仪，记录色谱图。

由色谱图知，氯乙酰氯为7.8mv(按噪音0.05计算，是15.7倍定量限，按限度浓度是3倍定量限)，与相邻峰分离良好，灵敏度良好。峰型良好。暂定此方法，进样量为2μl。

最终色谱条件溶液配制方式修订为：

取本品适量，加无水乙醇溶解并稀释制成每1ml中约含0.1g的溶液，作为供试品溶液；取氯乙酰氯适量，加无水乙醇溶解并稀释制成每1ml中约含7.5μg的溶液，作为对照品溶液。用6％氰丙基苯基-94％二甲基聚硅氧烷毛细管色谱柱(DB-624，0.53mm×30m×3μm)，起始温度80℃，维持5min，10℃/min升温至200℃，维持18分钟；流速为每分钟2.0ml；分流比为10:1；检测器为氢火焰离子化检测器(FID)，检测器温度250℃，进样口温度250℃；精密量取对照品溶液2μl，注入气相色谱仪，记录色谱图。色谱图中如显杂质峰，按外标法以峰面积计算，含氯乙酰氯不得过15ppm。

计算公式：

As为供试品溶液中氯乙酰氯的峰面积；

Ar为对照品溶液中氯乙酰氯的峰面积；

Ws为供试品的称样量，mg；

Wr为对照品的称样量，mg。

对以上方法进行方法学研究如下：

1、色谱峰定位及干扰试验

取氯乙酰氯约150mg，精密称定，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释刻度，摇匀，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

取维格列汀约200mg，精密称定，加溶剂2ml溶解，摇匀，作为供试品溶液。

取维格列汀约200mg，精密称定，加对照品溶液2ml溶解，摇匀，作为混合溶液。

取甲醇约0.75g、异丙醇约1.25g、甲基叔丁基醚约1.25g、乙酸乙酯约1.25g、N,N-二甲基甲酰胺约0.22g、甲苯约0.2225g，精密称定，置于50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为干扰试验溶液。

精密量取上述溶液以及溶剂各2μl，分别注入气相色谱仪，记录色谱图。

试验结果表明，氯乙酰氯的保留时间为9.000分钟；溶剂及干扰溶液不干扰氯乙酰氯的检查。

2、系统适用性试验

取氯乙酰氯约150mg，精密称定，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释刻度，摇匀，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，取维格列汀约200mg，精密称定，加上述溶液2ml溶解，作为系统适用性试验溶液。

精密量取上述溶液2μl，注入气相色谱仪，记录色谱图。重复操作5次。

试验结果见表1。

表-1维格列汀氯乙酰氯检查方法系统适用性试验结果

2、精密度试验

重复性试验

取氯乙酰氯约150mg，精密称定，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释刻度，摇匀，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为重复性试验溶液。

精密量取上述溶液2μl，注入气相色谱仪，记录色谱图。重复操作6次。

试验结果见表2。

表2维格列汀氯乙酰氯检查方法重复性试验结果

试验结果表明，本法检查氯乙酰氯系统适用性良好。

3、耐用性试验

取氯乙酰氯约150mg，精密称定，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释刻度，摇匀，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取维格列汀约200mg，精密称定，加上述溶液2ml溶解，作为混合溶液。

设计如下耐用性：

初始柱温分别选择75℃、80℃、85℃；流速分别选择1.8ml/min、2.0ml/min、2.2ml/min；进样口与检测器分别选择240℃、250℃、260℃；精密量取对照品溶液和混合溶液各2μl，分别注入气相色谱仪，变换上述参数进行耐用性试验。

试验结果见表3。

表3维格列汀氯乙酰氯检查耐用性试验结果

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上述色谱条件的变化仅对保留时间与峰面积略有影响，试验结果表明该色谱条件测定氯乙酰氯耐用性良好。

4、耐用性试验

取氯乙酰氯约150mg，精密称定，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释刻度，摇匀，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。分别精密量取照品储备液1ml、2.5ml、5ml、6ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，分别作为20％浓度、50％浓度、100％浓度、120％线性浓度系列溶液。精密量取检测限与定量限项下的定量限溶液及上述溶液各2μl，分别注入气相色谱仪，记录色谱图。以浓度对峰面积进行线性回归。分别计算回归方程，相关系数(r)，截距占100％浓度响应值的比例(％)。

试验结果见4。

表4维格列汀氯乙酰氯检查线性试验结果

试验结果表明，氯乙酰氯在0.489μg/ml～8.884μg/ml浓度范围内线性关系良好。

5、检测限与定量限试验

取氯乙酰氯对照品适量，精密称定，加溶剂适量使溶解并稀释制成系列浓度的溶液，以S/N(信噪比)≈10时为定量限，以S/N(信噪比)≈3时为检测限。

试验结果见表5。

表5维格列汀氯乙酰氯检查定量限与检测限试验结果

取定量限浓度溶液连续进样6次，记录色谱图。计算氯乙酰氯保留时间和峰面积的相对标准偏差。

试验结果见表6。

表6维格列汀氯乙酰氯检查定量限重复性试验结果

试验结果表明，定量限浓度，重复性良好。

6、溶液稳定性试验

取维格列汀约200mg，精密称定，加溶剂2ml溶解，作为供试品溶液；

取氯乙酰氯约150mg，精密称定，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释刻度，摇匀，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

取供试品溶液和对照品溶液于室温下放置8小时，分别于第0小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时，精密量取上述溶液2μl，注入气相色谱仪，记录色谱图。

试验结果见表7。

表7维格列汀氯乙酰氯检查溶液稳定性试验结果

试验结果表明，供试品溶液和对照品溶液中，氯乙酰氯无变化趋势，室温8小时内基本稳定。

7、准确度试验

取氯乙酰氯约150mg，精密称定，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，精密量取对照品储备液1ml、2.5ml、5ml、6ml，置不同50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，分别取主成分约200mg，精密称定，分别加入上述溶液2ml溶解，摇匀，分别作为回收率0.0015％组、0.00375％组、0.0075％组、0.0090％组准确度系列溶液。同法制备三份。精密量取对照品储备液5ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取3.3ml置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，取主成分约200mg，精密称定，加入上述溶液2ml溶解，摇匀，分别作为回收率0.0005％组准确度系列溶液。同法制备三份。精密量取2μl，注入气相色谱仪，记录色谱图。另取氯乙酰氯约150mg，精密称定，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释刻度，摇匀，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。同法测定，按外标法以峰面积计算回收率。

试验结果见表8。

表8维格列汀氯乙酰氯检查准确度试验结果

试验结果表明，氯乙酰氯回收率在92.62％～107.27％之间，符合验证要求(85％～110％范围内)，证实该方法具有良好的准确度。

方法验证结果概要

综上，所述本发明是一种具有专属性强、高灵敏度、样品用量少、定量限重复性好、准确度高、耐用性强、试验使用试剂安全环保无害、仪器操作简便、可适用于大多数实验室使用等优点的氯乙酰氯检查方法。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。