特异性识别辣椒素核酸适配体及其筛选方法的建立与鉴定

技术领域

本发明属于食品安全生物技术领域，尤其涉及特异性识别辣椒素核酸适配体及其筛选方法的建立与鉴定。

背景技术

食用植物油广泛应用于家庭烹饪和食品工业中，是日常生活中的重要食品之一。食用植物油为人类提供了一些具有营养和健康功效的重要成分，但不限于必需脂肪酸(EFA)、维生素、矿物质等。

餐厨废弃油脂会受到各种化学毒素的污染并存在一定的致癌风险，这些化学毒素里面包含碳氢化合物、黄曲霉毒素B1、重金属离子等。目前对于检测的难点在于很难建立一套通用体系用来鉴定餐厨废弃油脂。

根据相关研究，常规检测需要结合多个指标作为判断依据，才能确定油样是否为废弃食用油。虽然这些指标的检测可以提高鉴定效率，但需要专业设备或复杂样品前处理。辣椒素是辣椒的主要化学成分，具有脂溶性好、稳定性高、沸点高的特点，作为食品添加剂被广泛使用和消费。传统植物油中不含辣椒素，相关研究表明，在高沸点非食用废油的精制过程中，由于辣椒素的亲脂性和不易脱除性，辣椒素可稳定存在于不可食用油当中，因此辣椒素可以作为餐厨废弃油脂鉴定的特异性靶标，并且可以作为辣度测定标准依据，因此，建立一种快速检测辣椒素的方法以解决餐厨废弃油脂引起的食用油掺伪问题的方法是非常有必要的。

辣椒中辣椒素的分析方法多种多样，例如分光光度法、气相色谱法(GC)、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱-质谱(GC-MS)和液相色谱-质谱(LC-MS)是测定辣椒素含量常用方法。分光光度法的选择性差，紫外高效液相色谱检测方法灵敏度不足，气相色谱法(GC)、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱-质谱(GC-MS)和液相色谱-质谱(LC-MS)方法具有令人较高的灵敏度和高特异性，但是这些方法需要昂贵的仪器以及色谱柱样品前处理工艺要求高，这限制了这些方法的普适性。电化学方法具有灵敏度高和特异性强的特点，采用不同的电极对辣椒素进行了检测，但是大多数用于辣椒素检测的传感器使用纳米材料或聚合物对电极进行复杂的修饰，导致操作繁琐和检测耗时，此外，大多数方法都采用传统的圆柱形电极，这使得食品工业部门难以实现设备便携的效果。

适配体是从单链核酸文库中筛选得到的寡核苷酸片段，通过指数富集(SELEX)技术使适配体在体外从大量的随机序列库中得以筛选出来，适配体可以通过氢键、范德华力和静电相互作用折叠成热力学稳定的三维结构，从而特异性的结合靶标，如小分子、金属离子、细菌、蛋白质和酶等。尽管适配体通常被认为是“化学抗体”，但与免疫球蛋白完全不同，首先，适配体可以由体外筛选技术获得且筛选周期较短，筛选无需依赖实验动物，获得序列后可直接化学合成。与传统抗体相比，适配体稳定性高，变性可逆，能够识别广谱表位，不受免疫原性限制；其次，适配体易于获得并且合成成本低；最后，适配体易于化学修饰和重复使用。鉴于以上优点，近年来适配体已广泛应用于医学诊断与治疗、药物研发与应用、环境污染物的检测、生化分析与成像、食品检测等多个领域。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了特异性识别辣椒素核酸适配体及其筛选方法的建立与鉴定。本发明方法采用基于文库固定技术，将文库固定在带有链霉亲和素的磁珠上。然后以辣椒素作为靶标进行孵育、分离、PCR扩增、纯化、酶切等一系列步骤，多轮筛选后进行高通量测序，利用NUPACK、MEGA等工具对候选适配体进行同源性分析和二级结构分析，从而准确挑选出两条适配体Cap-1、Cap-2，进行亲和力分析，利用荧光互补链猝灭法对适配体Cap-1进行灵敏度和特异性分析。该适配体可用于市面上非正常使用餐厨废弃油脂的检测，达到快速、准确检测的目的。

本发明通过以下技术方案实现的：

本发明第一个目的是提供特异性识别辣椒素的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示。

本发明第二个目的是提供用于特异性识别辣椒素的核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤：

(1)固定筛选文库的磁性纳米颗粒的制备

将捕获探针与随机单链DNA文库混合孵育后，加入亲和素化磁性纳米颗粒继续混合孵育，通过生物素与亲和素的连接，获得固定筛选文库的磁性纳米颗粒；

(2)固定筛选文库的磁性纳米颗粒与辣椒素孵育

向步骤(1)中所得固定筛选文库的磁性纳米颗粒，加入辣椒素混合孵育，得到与辣椒素结合的ssDNA；

(3)PCR扩增

将步骤(2)中所得ssDNA作为模板进行PCR扩增；

(4)制备单链

将步骤(3)的扩增产物制备成单链DNA，得到下一轮筛选文库；

(5)多轮筛选

将步骤(1)的随机单链DNA文库替换为步骤(4)中所述下一轮筛选文库，按照步骤(1)-(4)重复多轮筛选；

(6)高通量测序

筛选结束后，将步骤(4)中筛选所得的筛选文库进行高通量测序分析，检测所得序列与辣椒素的亲和力，得到用于特异性识别辣椒素的核酸适配体。

在本发明的一个实施例中，所述随机单链DNA文库的结构为5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’；所述N40表示由40个任意的核苷酸碱基连接而成的序列。

在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述亲和素化磁性纳米颗粒通过以下方法制备得到：

S1、将氨基化磁性纳米颗粒与戊二醛溶液混合，使得氨基化磁珠转化为羧基化磁珠，避光反应后，固液分离取固相，分散至缓冲液后得到交联的磁珠溶液；

S2、将S1所得交联的磁珠溶液与亲和素孵育反应，固液分离取固相，得到所述亲和素化磁性纳米颗粒。

在本发明的一个实施例中，步骤S1中，所述氨基化磁性纳米颗粒通过以下方法制备得到：

在有机溶剂中加入无水乙酸钠、六水合三氯化铁与1，6-己二胺，加热混合，形成胶体溶液后，转移带聚四氟乙烯内衬的反应釜中，加热反应，得到氨基化磁性纳米颗粒。

在本发明的一个实施例中，步骤(4)中，所述多轮筛选是通过降低文库浓度来增加筛选压力。

在本发明的一个实施例中，步骤(6)中，筛选结束后，将步骤(4)中筛选所得的第三、六、九、十二和十五轮筛选文库进行高通量测序分析，检测所得序列与辣椒素的亲和力和特异性，得到用于特异性识别辣椒素的核酸适配体。

本发明第三个目的是提供一种组合物，所述组合物中含有所述的核酸适配体。

本发明第四个目的是提供一种试剂盒，所述试剂盒中含有所述的核酸适配体和/或所述的组合物。

本发明第五个目的是提供所述的组合物、所述的试剂盒或所述的核酸适配体在检测辣椒素中的应用。

在本发明的一个实施例中，所述核酸适配体序列中的5’端或3’端连接功能性基团或分子。

在本发明的一个实施例中，所述功能性基团或分子选自荧光素、磷酸基团、生物素、氨基、巯基、地高辛、放射性同位素、酶标记或纳米发光材料

本发明的技术原理：

本发明基于Capture-SELEX技术筛选富集辣椒素适配体(流程图如图1所示)，经过高通量测序监测适配体富集程度并终止筛选轮数，探究筛选出的适配体的二级结构和同源性关系，利用等温滴定量热技术(ITC)和荧光猝灭法鉴定适配体的亲和力和特异性。该发明为该核酸适配体在食品中辣椒素的检测提供理论和应用基础。

本发明的技术方案具有以下优点：

(1)与抗体相比，本发明的适配体可在体外筛选，筛选周期短，合成方便，易标记各种功能基团和报告分子，性质稳定，可长期保存使用。

(2)本发明的高通量测序方法可以显著提高适配体的筛选效率。在高通量测序中观察候选适配体出现频率变化，可直观地看出筛选终止轮数，节省验证适配体亲和力的时间和成本。

(3)本发明首次提供一种基于Capture-SELEX技术筛选得到特异性结合辣椒素核酸适配体Cap-1，该核酸适配体具有亲和力高、特异性强的特点，并且结构稳定，合成方便，成本较低，从而实现餐厨废弃油脂的鉴别，满足食用油安全检测基本要求，提升食品监管部门、餐饮行业对餐厨废弃油脂的鉴别能力，提高国民的食品安全性，有助于恢复食用油市场良性竞争。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1是本发明基于Capture-SELEX法对辣椒素核酸适配体的定向筛选流程图；

图2是本发明经过筛选和高通量测序后前五十条候选适配体序列的进化树分析；

图3-A是本发明辣椒素的候选适配体Cap-1的二级结构图；

图3-B是本发明辣椒素的候选适配体Cap-2的二级结构图；

图4是本发明辣椒素的候选适配体Cap-1、Cap-2亲和力饱和结合曲线；其中图4-A和图4-B中，横坐标为时间，纵坐标为热功率，峰底与峰尖之间的峰面积为每次滴定是释放的总热量；图4-C和图4-D中，横坐标为滴定物与样品溶液的摩尔比，纵坐标为滴定产生的总热量；

图5是本发明不同浓度的辣椒素与核酸适配体Cap-1结合灵敏度线性关系图；

图6是本发明基于荧光猝灭检测辣椒素与核酸适配体Cap-1结合特异性分析；

图7是本发明核酸适配体Cap-1与辣椒素结合前后圆二色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

1、随机文库(ssDNA)、引物及捕获探针的设计

SELEX初始文库(ssDNA)文库：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’，N40表示由40个任意的核苷酸碱基连接而成的序列。

PCR扩增所需引物依据ssDNA文库序列所得。

正向引物：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’；

反向引物：3’-phosphate-TTCACGGTAGCACGCATAGG-5’，3’端采用磷酸基团标记。

捕获探针：5’-bioton-CATCTGACCTCTGTG-3’，5’端标记生物素，与磁珠上的链霉亲和素结合。

2、亲和素化磁性纳米颗粒的制备、文库固定及基于Capture-SELEX法对辣椒素核酸适配体的定向筛选

(1)亲和素化磁性纳米颗粒制备：称取无水乙酸钠2.0g，六水合三氯化铁1.0g和1，6-己二胺(C

(2)ssDNA文库的固定：首先将桥接序列bBS与寡核苷酸ssDNA文库按照摩尔比2：1的比例混合，体系经95℃加热10min后，于37℃、130rpm条件下孵育2h后，将bBS-ssDNA与纳米磁珠颗粒以1：300质量比进行混合，在37℃、130rpm条件下孵育1h以达到动态平衡状态，这样带有生物素标记的寡核苷酸杂交序列与亲和素包被的磁珠溶液通过生物素-亲和素的作用连接从而将筛选文库固定在磁珠上，然后磁分离并用PBS缓冲溶液清洗磁珠多次以去除非特异性吸附的寡核苷酸序列，清洗后的磁珠再用BB溶液分散便于与靶标孵育进行筛选。

(3)基于Capture-SELEX对辣椒素的适配体进行定向筛选：第一轮筛选总体系为400μL，将5μg的辣椒素和1nmol固定好的寡核苷酸ssDNA文库在37℃、130rpm条件下孵育2h，即为试验组。这样游离的辣椒素将特异性结合的核酸适配体从磁珠上竞争解离下来形成辣椒素/ssDNA复合物而保留在上清液中，然后利用磁分离去除磁珠，以收集的上清液作为模板进行PCR扩增。

(4)PCR扩增：以经过第一轮筛选获得的上清液为模板进行PCR扩增。PCR的体系为1μL模板，浓度为5μM的上下游引物各1μL，浓度为5mM的含Mg

(5)聚丙烯酰胺凝胶电泳验证：PCR产物采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。酶切后的产物采用8％变性聚丙烯酰胺凝胶(含7M尿素)进行电泳，使用凝胶成像仪成像，观察电泳条带是否单一明亮，条带是否处在80bp的位置。

(6)PCR产物的纯化及酶切：将获得的PCR产物采用纯化试剂盒进行纯化处理，以除去PCR反应体系中的其他物质。用NanoDrop-2000微量紫外可见分光光度计测定纯化好的核酸浓度，以确定酶切所需的大致时间。取纯化后的产物，加入1/10体积的酶切缓冲液和适量核酸外切酶混合均匀，于37℃下反应直至酶切完全，酶切完成后于75℃下灭酶10min以停止酶切反应。

(7)酶切产物的纯化：向酶切产物中加入1/10体积3mol/L的NaAC并混匀，再加入2倍体积无水乙醇混匀，放置于-20℃冰箱中沉淀过夜。沉淀后的溶液在4℃下于14000rpm离心15min。弃去上清液后，向体系加入200μL 70％乙醇，混合均匀后在4℃下于14000rpm离心15min，弃去上清。将其放置于50℃烘箱中进行干燥处理，加入50μL 1×TE缓冲液溶解作为下一轮筛选的文库。

随着筛选轮数的增加，逐渐增加筛选压力以获得亲和力和特异性均良好的适配体序列。除第一轮筛选的文库添加量为1nmol，从第二轮筛选开始随着筛选轮数的增加，文库的添加量逐渐减少10pmol。

3.高通量测序及序列分析

分别以三、六、九、十二、十五轮筛选过程中与靶标孵育后的上清液作为模板进行PCR扩增，扩增后的产物送往上海生工进行高通量测序得到各适配体富集率，可通过每一轮富集率决定终止轮数，如表1所示，Cap-1、Cap-2富集趋势明显，其次利用MegaX软件分析第15轮高通量测序所得序列，将富集率前五十的序列进行同源性分析，如图2所示，Cap-1、Cap-2核酸适配体同源性较好，表1结果和图2结果保持一致，因此选用Cap-1、Cap-2这两条作为候选适配体，再利用Nupack在线工具对亲和力较好的适配体进行二级结构分析(如图3所示)，Cap-1与Cap-2均存在较稳定的茎环结构，以便后续对候选适配体Cap-1、Cap-2进行亲和力、特异性分析。

表1高通量测序得到的部分候选适配体序列及其富集趋势

4.等温滴定量热法(ITC)分析候选适配体亲和力

采用PEAQ-ITC(Malvern,UK)在25℃的条件下对候选适配体Cap-1、Cap-2进行亲和力分析，辣椒素及其对应的候选适配体均使用含10％DMSO的BB缓冲液(pH 7.4)溶解。适配体在95℃下加热变性10min，室温冷却半小时。样品在反应前均进行脱气处理，适配体的浓度为100μM，靶标的浓度为10μM。对照组将靶标溶液换为同体积的缓冲液，测量稀释热。结合实验选取了13滴的模型，其中包括60s的初始延迟、0.4μL的首次注射和150s的延迟。随后的12次进样为4μL，每150s间隔一次。所得数据用MicroCal PEAQ-ITC Analysis软件进行处理。

结果发现适配体(Cap-1)对辣椒素具有最优的结合能力，适配体Cap-1的序列如下所示：

AGCAGCACAGAGGTCAGATGTGACCGGCTTAGGCCTTTTCTTTGACTTGTCTTGAATTGGCCTATGCGTGCTACCGTGAA(SEQ ID No.1)。

适配体(Cap-1)的ITC分析结果如图4-A和图4-C所示，从图4-A和图4-C可以看出，核酸适配体Cap-1对辣椒素具有较好的结合能力。

另外，如图4-B和图4-D所示，适配体Cap-1的同源性序列Cap-2与辣椒素也具有较好的结合性能。

适配体Cap-2的序列如下所示：AGCAGCACAGAGGTCAGATGACCGTCATAGGTCGCCTATTGATTCTTCTCAATTGGTGTTCCTATGCGTGCTACCGTGAA(SEQ ID No.2)。

表2基于ITC分析法适配体Cap-1、Cap-2的Kd值

实施例2基于荧光互补链猝灭竞争法分析核酸适配体Cap-1的亲和力和特异性

用含有10％甲醇的BB缓冲液将FAM荧光标记的核酸适配体Cap-1与猝灭基团(Dabcyl)修饰的互补链按照摩尔浓度1:2.5的比例进行稀释，其中FAM荧光标记的适配体浓度为100nM，其体积按照1:1的比例进行95℃变性5min后，37℃孵育30min，再加入相同体积靶标使其终浓度200ng/mL(辣椒素、二氢辣椒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、呕吐毒素、黄曲霉毒素B1、混标)37℃孵育30min后，用多功能酶标仪测定加入靶标前后在激发波长为490nm，发射波长在518nm处的荧光强度，分别记为F

利用同样的方法评价上述适配体(Cap-1)的特异性，将100nM适配体固定在磁珠上分别于200ng/mL共存物质(玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、呕吐毒素、黄曲霉毒素B1、混标)和结构类似物(二氢辣椒素)进行孵育，经磁分离后，分别测定上清液中荧光强度，然后评价适配体的特异性。结果如图6所示，核酸适配体Cap-1与其他几种共存物质相对荧光强度几乎保持不变，与辣椒素类物质发生交叉反应，说明核酸适配体Cap-1可以作为检测餐厨废弃油脂中辣椒素类的通用适配体。

FAM修饰的核酸适配体Cap-1：5’-FAM-AGCAGCACAGAGGTCAGATGTGACCGGCTTAGGCCTTTTCTTTG ACTTGTCTTGAATTGGCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’

猝灭基团修饰的互补链：5’-CATCTGACCTCTGTG-Dabcyl-3’

实施例3圆二色谱表征

将10μM核酸适配体Cap-1加热至95℃变性10min，随后冷却至室温，使得适配体能够形成稳定的三维结构。取200μL上述适配体溶液与5μM辣椒素溶液在4mL的含10％DMSO的BB缓冲体系中孵育(37℃，30min)形成稳定的复合物，同时在相同条件下以仅含有适配体和仅含有靶标的两个体系作为空白对照组。使用1cm的石英比色皿测定上述溶液的圆二色谱信号，扫描范围是230nm～320nm，扫描速度是100nm/min，带宽1nm，扫描次数为3次。圆二色谱法结果如图7所示，核酸适配体Cap-1结合辣椒素后在251nm和278nm处分别形成一个负峰和正峰，与结合前相比，正峰和负峰均发生轻微的蓝移，且正峰和负峰的强度均明显增强，从而进一步说明了Cap-1与辣椒素具有较高亲和力。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。