血清4型禽腺病毒ELISA抗体检测试剂盒

技术领域

本发明涉及血清4型禽腺病毒ELISA抗体检测试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

禽腺病毒(FowlAdenovirus，FAdV)是一种全世界范围内流行的家禽和野禽常见的传染病病原。FAdV可被分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3个亚群，其中Ⅰ亚群有A-E5个种，5个种内又包括12个血清型(1-7、8a、8b、9-11)。其中血清4型禽腺病毒(FowlAdenovirusSerotype4，FAdV-4)是我国目前主要的流行株，是导致肝炎-心包积液综合征(HepatitisHydropericardiumSyndrome，HHS)的病原体，也是致病性最强的一个血清型。该病潜伏期短，发病快，死亡率高，给家禽养殖业带来巨大的经济损失，已成为威胁我国养禽业的重大疫病之一。

FAdV-4属于腺病毒科、禽腺病毒属，为线性双股DNA病毒，无囊膜，具有标准的六边形轮廓。病毒粒子直径为70～90nm，呈二十面体对称结构，由252个壳粒组成，壳粒可以分为六邻体(Hexon)和五邻体(Penton)，Penton包括五邻体基和突出的Fiber蛋白。大多数腺病毒都只编码一种Fiber蛋白，但Ⅰ亚群FAdV的A种和C种都包含两种Fiber蛋白(Fiber-1、Fiber-2)，并且两种Fiber蛋白都位于同一个五邻体基上。Fiber蛋白是病毒粒子表面重要的纤突蛋白，在介导病毒感染宿主细胞中起重要作用，能有效刺激机体产生体液免疫，诱导中和抗体的产生。其中Fiber-2在介导病毒感染的宿主细胞中发挥重要作用，其具有较好的抗原性，可诱导机体产生中和抗体。

目前对于FAdV-4传统的实验室检测方法存在一定不足，如病毒的分离鉴定、中和试验、琼脂扩散试验等费时费力，结果不够精确；PCR、LAMP等检测手段对试剂盒及设备要求较高，且针对大量样品检测不便，而ELISA法具有操作简便、灵敏度高、特异性强、性价比高等特点。

发明内容

本发明公开了一种血清4型禽腺病毒ELISA抗体检测试剂盒制备方法和应用，并证明该试剂盒用于动物FAdV-4抗体检测，检测特异性高、灵敏度高、操作简便，属于兽用生物制品技术领域。本发明目的在于提供一种可大规模工业化生产的血清4型禽腺病毒ELISA抗体检测试剂盒的制备方法。

本发明的第一个目的是提供一种血清4型禽腺病毒的重组抗原蛋白，如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过增加或截短的且具有与血清4型禽腺病毒抗体结合能力的由(a)衍生的蛋白质。

本发明的第二个目的是提供编码上述重组抗原蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明第三个目的是提供携带上基因的表达载体。

在一种实施方式中，所述载体包括但不限于pFastBac1、pVL1393、pFastBacdual。

在一种实施方式中，所述载体为pFastBac1。

本发明的第四个目的是提供携带上述基因或上述表达载体的、细胞。

在一种实施方式中，所述细胞为大肠杆菌(Escherichiacoli)或Sf9细胞系。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括大肠杆菌E.coliDH5α和E.coliDH10Bac。

在一种实施方式中，所述Sf9细胞系包括Sf9、HighFive或Sf21细胞。

本发明还提供了所述重组抗原蛋白在制备检测血清4型禽腺病毒的分子检测制品中的应用。

在一种实施方式中，所述分子检测制品为ELISA检测试剂盒或胶体金试纸条。

本发明还提供了一种血清4型禽腺病毒ELISA检测试剂盒，所述ELISA检测试剂盒包括上述重组抗原蛋白。

在一种实施方式中，所述检测试剂盒还含有酶标板、酶标二抗、显色液、终止液、洗涤液、血清4型禽腺病毒阳性血清、血清4型禽腺病毒阴性血清。

本发明还提供了一种检测血清4型禽腺病毒的方法，所述方法具体步骤如下：将待测样品进行倍比稀释，加入包被有上述重组抗原蛋白的96孔酶标板中，35～38℃孵育0.5～1h，弃去上清，洗涤3～5次；每孔加入稀释的酶标二抗80～120μL，35～38℃孵育0.5～1h，弃去上清，洗涤3～5次；每孔加入显色液80～120μL，置35～38℃避光显色15～30min；每孔加入终止液80～120μL终止反应后，使用酶标仪检测OD

在一种实施方式中，所述包被有上述重组抗原蛋白的96孔酶标板的制备方法为在96孔酶标板中每孔加入上述重组抗原蛋白0.1μg，2～8℃孵育过夜，弃去上清，洗涤3～5次；加入180～220μL1％BSA，35～38℃孵育1.5～2h，弃去上清，洗涤3～5次。

在一种实施方式中，所述显色液包括底物A和底物B；底物B为1mg/ml的四甲基联苯胺溶液备用；底物A为0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液；将底物A和底物B等体积混合制备得到显色液。

在一种实施方式中，所述终止液为2mol/L硫酸溶液。

在一种实施方式中，所述血清4型禽腺病毒阳性血清可通过免疫动物获得。

在一种实施方式中，所述动物包括兔、鸡或小鼠。

有益效果：

1.本发明使用Fiber-2抗原蛋白作为靶标，串联重复表达Knob区域，制备重组抗原蛋白。利用本发明提供的重组抗原蛋白制备的试剂盒灵敏度高且特异性强，最高检测到阳性血清稀释倍数为12800倍；本发明提供的ELISA抗体检测试剂盒在检测除血清4型禽腺病毒以外的不同血清型禽腺病毒时，其S/P值在0.2左右，特异性显著好于市售试剂盒(S/P值在0.4左右)。

2、本发明试剂盒组分中，包被酶标板的抗原为使用Sf9细胞表达重组FAdV-4-KN蛋白，抗原纯度高，与病毒抗体结合能力更强，且可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养，由此抗原包被的包被板所建立的ELISA抗体检测试剂盒，灵敏度高、特异性强、性价比高，易于大规模推广应用。

附图说明

图1FAdV-4-KN基因片段验证凝胶电泳图。

图2菌落PCR验证凝胶电泳图。

图3转移载体pF-FAdV-4-KN的质粒图谱。

图4SDS-PAGE检测重组杆状病毒表达产物；1：rBac-FAdV-4-KN；2：对照。

图5WesternBlot检测重组杆状病毒表达产物；1：rBac-FAdV-4-KN；2：对照。

图6SDS-PAGE检测FAdV-4-KN蛋白。

图7不同试剂盒特异性比较。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市售商品或者可以通过已知方法制备。

转染培养基T1购自苏州沃美生物技术有限公司，Cellfectin转染试剂购自赛默飞世尔，SF-SFM新鲜培养基购买自苏州沃美生物技术有限公司。

商业化质粒pFastBac1、大肠杆菌DH10Bac感受态细胞均购买于赛默飞世尔公司。

实施例1转移载体pF-FAdV-4-KN构建与鉴定

1.FAdV-4-KN基因扩增与纯化在南京金斯瑞生物科技有限公司合成了密码子优化后的FAdV-4-KN基因(SEQ ID NO.1)并克隆到pUC17载体上的酶切位点BamHⅠ和HindⅢ之间，得到pUC-FAdV-4-KN质粒载体。以pUC-FAdV-4-KN质粒作为模板，FAdV-4-KN-F、FAdV-4-KN-R作为上下游引物进行PCR扩增(FAdV-4-KN-F、FAdV-4-KN-R的基因序列如SEQ ID NO.3、4所示)，扩增体系见表1。

表1FAdV-4-KN基因扩增体系

反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性45秒，54℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。

将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图1所示，在1.3kbp的位置出现目的条带，FAdV-4-KN基因片段扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。

2.酶切与纯化将pFastBac1质粒和FAdV-4-KN基因片段使用BamHⅠ、HindⅢ37℃双酶切3h，具体酶切反应体系见表2、表3。

将酶切产物进行凝胶电泳，分别使用凝胶回收纯化试剂盒纯化酶切的pFastBac1质粒以及FAdV-4-KN基因片段。

表2FAdV-4-KN基因酶切反应体系

表3pFastBac1质粒酶切反应体系

3.连接将酶切过的pFastBac1质粒和FAdV-4-KN基因片段使用T4DNA连接酶16℃水浴连接过夜获得连接产物，连接体系见表4。

表4FAdV-4-KN基因与pFastBac1质粒连接体系

4.转化取10μl连接产物加入100μl的DH5α感受态细胞，混匀，42℃热休克90秒，冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB培养基，37℃培养1小时。取1.0mL菌液离心浓缩成100μl涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。

5.菌落PCR和测序鉴定挑取平板上的单菌落接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，FAdV-4-KN-F和FAdV-4-KN-R作为引物进行菌落PCR。将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图2所示，出现1.3kbp附近条带的样品为阳性样品。将菌落PCR鉴定阳性的菌液送测序公司测序，选择测序正确的菌液进行保存。构建的含有目的基因的转移载体pF-FAdV-4-KN，其示意图如图3。

实施例2构建重组杆状病毒基因组Bac-FAdV-4-KN并转染重组杆状病毒

1.DH10Bac菌转化取1μl实施例1制备的转移载体pF-FAdV-4-KN加入到100μl的DH10Bac感受态细胞中混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，再冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB液体培养基，37℃培养5小时。之后取100μl菌液稀释81倍后，再取100μl稀释的菌液涂布到含有庆大霉素、卡那霉素、四环素、X-gal以及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固体培养基上，37℃培养48小时。

2.挑选单克隆使用接种针挑取大的白色菌落，然后在含有庆大霉素、卡那霉素、四环素、X-gal以及IPTG的LB固体培养基上划线，37℃培养48小时，然后挑取单菌落接种含有庆大霉素、卡那霉素、四环素的LB液体培养基培养，保存菌种，抽提质粒。获得重组质粒Bacmid-FAdV-4-KN。

3.制备重组杆状病毒在六孔板中每个孔接种0.8×10

实施例3SDS-PAGE检测及WesternBlot检测

将实施例2中收获的重组杆状病毒rBac-FAdV-4-KN和感染空杆状病毒的Sf9细胞培养物(阴性对照)进行SDS-PAGE检测。以鸡源抗FAdV-4阳性血清作为一抗，HRP标记的羊抗鸡IgG作为二抗进行WesternBlot鉴定。SDS-PAGE检测结果如图4所示，重组杆状病毒rBac-FAdV-4-KN在分子量约47kDa处出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带，证明蛋白表达成功。WesternBlot鉴定结果如图5所示，重组杆状病毒表达样品都有目的条带，阴性对照没有目的条带，说明目的蛋白在Sf9细胞中得到正确表达。

实施例4昆虫细胞的生物反应器无血清悬浮培养及FAdV-4-KN蛋白的表达定量

在1000ml摇瓶中无菌培养Sf9昆虫细胞3～4天，待浓度达到3～5×10

通过粒子交换层析、疏水层析、分子筛纯化对细胞培养上清进行纯化获得重组蛋白FAdV-4-KN，使用BCA总蛋白定量法测定重组蛋白FAdV-4-KN的含量，用SDS-PAGE电泳的方法再结合灰度扫描确定其浓度，结果如图6所示，FAdV-4-KN蛋白浓度为1245μg/mL，纯度为91％。

实施例5血清4型禽腺病毒ELISA抗体检测试剂盒各组分的制备

1.抗原包被板的制备取96孔酶标板，每孔加入纯化的FAdV-4-KN蛋白(1μg/mL)，100μl/孔，2～8℃孵育过夜。弃去液体，每孔加入250μL洗涤液，静置1分钟，洗板3次；每孔加入200μl1％BSA封闭，37℃孵育1小时，弃去封闭液；每孔加入250μL洗涤液，静置1分钟，洗板5次。将包被好的反应板密封包装，4℃保存备用。

2.酶标二抗的制备制备HRP标记的不同动物IgG(兔抗鸡IgG)作为酶标二抗。

3.样品稀释液的制备配置pH7.40.1mol/LPBS缓冲液。

4.洗涤液(PBST缓冲液)的制备20×PBST溶液：氯化钠(NaCl)160g，氯化钾(KCl)4g，磷酸氢二钠·12水(Na

5.底物A的制备制备0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液备用。

6.底物B的制备制备1mg/ml的四甲基联苯胺溶液备用。

7.终止液的制备制备2mol/L硫酸溶液。

8.阳性血清的制备使用FAdV-4-KN蛋白免疫动物，获得的FAdV-4抗体阳性血清。

9.阴性血清的制备无特定病原体(SPF)的动物血清。

实施例6血清4型禽腺病毒ELISA抗体检测试剂盒检测程序设置

1.操作方法将实施例5组装的血清4型禽腺病毒ELISA抗体检测试剂盒从4℃环境中取出，置室温平衡30min备用，各组分试剂在使用前需混匀。将待检测的样品用样品稀释液分别进行系列倍比稀释，加入抗原包被板，50μl/孔，每样品2个重复，同时加入3个阴性对照和3个阳性对照。37℃孵育0.5小时，弃去血清孵育物，每孔加入250μL洗涤液，静置1分钟，洗板5次后拍干；每孔加入稀释2000倍后的酶标二抗100μl，37℃孵育0.5小时，每孔加入250μL洗涤液，静置1分钟，洗板5次后拍干。每孔加入底物显色液(现用现配，将底物液A和底物液B等体积混合后即为底物工作液)100μl，置37℃避光显色15分钟。每孔加入100μl终止液终止反应。使用酶标仪检测OD

2.结果判定阴性血清(NC)OD

实施例7特异性、灵敏度及符合率检测

1.特异性试验利用制备的血清4型禽腺病毒ELISA抗体检测试剂盒分别检测鸡新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)、禽流感病毒(AIV)、血清1型禽腺病毒(FAdV-1)、血清7型禽腺病毒(FAdV-7)、血清8b型禽腺病毒(FAdV-8b)、血清9型禽腺病毒(FAdV-9)、血清11型禽腺病毒(FAdV-11)阳性血清样品，同时用FAdV-4阳性和阴性血清作为对照，根据实施例6相同的检测方法进行检测，检测结果如表5所示，除FAdV-4阳性血清外其余血清样品均显示为阴性，说明血清4型禽腺病毒ELISA抗体检测试剂盒所使用的抗原与其它病原的抗体之间并无交叉反应，具有良好的特异性。

表5ELISA试剂盒检测结果

注：“+”为阳性，“-”为阴性。

2.灵敏度试验将实施例5制备的FAdV-4阳性血清从1:100倍倍比稀释至1:51200倍，用血清4型禽腺病毒ELISA抗体检测试剂盒进行检测，其最高检测到阳性血清稀释倍数为12800倍，而市售的IDEXX公司的禽腺病毒抗体检测试剂盒最高检测到阳性血清稀释倍数为3200倍，说明本血清4型禽腺病毒ELISA抗体检测试剂盒灵敏度高于IDEXX试剂盒。

同时我们比较了三个Knob序列重复得到的抗原以及四个Knob序列重复得到的抗原与本专利中抗原作为铺板抗原检测血清4型禽腺病毒抗体的灵敏度。检测结果如下，从表格中看出，增加Knob区域重复构建的抗原作为铺板检测抗原，并不能提高检测的灵敏性，因为考虑到增加重复蛋白的表达量降低明显，所以优选本专利抗原。

表6灵敏度测定结果

3.符合率试验使用病毒中和试验方法。制备感染禽腺病毒后出现临床症状的鸡血清，经过56℃灭活，混合十份样本；制备健康鸡血清，经56℃灭活，混合十份样本；制备禽腺病毒的鸡肝癌细胞扩增毒，200TCID

血清经灭活后，使用DMEM培养基进行倍比稀释，50μl/孔，每个稀释度3个复孔，每孔加入等体积100TCID

对比例1

通过比较市售FAdVELISA抗体检测试剂盒、使用FAdV-4-Fiber2蛋白全长制备抗原包被板的ELISA抗体检测试剂盒以及本发明制备的ELISA抗体检测试剂盒分别检测鸡新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)、禽流感病毒(AIV)、血清1型禽腺病毒(FAdV-1)、血清4型禽腺病毒(FAdV-4)、血清7型禽腺病毒(FAdV-7)、血清8b型禽腺病毒(FAdV-8b)、血清9型禽腺病毒(FAdV-9)、血清11型禽腺病毒(FAdV-11)阳性血清样品和血清4型禽腺病毒(FAdV-4)阴性血清样品，检测结果如表7和图7所示，除血清4型禽腺病毒(FAdV-4)阳性血清样品检测结果为阳性外，其余样品检测结果均阴性，但本发明提供的ELISA抗体检测试剂盒在检测不同血清型禽腺病毒时，其S/P值在0.2左右，而市售FAdVELISA抗体检测试剂盒和使用FAdV-4-Fiber2蛋白全长制备抗原包被板的ELISA抗体检测试剂盒的S/P值在0.4左右，可见，本发明的特异性显著优于市售试剂盒以及利用FAdV-4-Fiber2蛋白全长制备的试剂盒。

表7ELISA试剂盒检测结果

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注：“+”为阳性，“-”为阴性。S/P＝(SA(450nm)-NC)/(PC-NC)

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。