一种海洋菌发酵高产六氢环庚烷灵菌红素的培养基及方法
文献发布时间:2023-06-19 19:28:50
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种海洋菌发酵高产六氢环庚烷灵菌红素的培养基及方法。
背景技术
1929年,Amak从沙雷氏菌(Serratia sp.)中发现灵菌红素( prodigiosin,PG),灵菌红素主要是微球菌、弧菌、沙雷氏菌、假交替单胞菌等细菌产生的次级代谢产物,具有3个吡咯环组成的甲氧基吡咯骨架结构,是一类天然红色素的总称。目前已知确定结构的有prodigiosin(PG)、undecylprodigiosin(UP)、cylononyl-prodiginine(CPrG)、metacycloprodigiosin(MP)和Six hydrogen cycloheptane prodigiosin(ShcPG六氢环庚烷灵菌红素)等12种,其中ShcPG为本实验室最新分离得到新化合物。研究表明,灵菌红素具有抗菌、抗疟疾、抗肿瘤、免疫调节等作用,尤其对多种肿瘤细胞有显著的抑制作用,而对正常细胞不具有毒性,并且在非细胞毒性作用浓度下能够抑制肿瘤细胞的浸润,表现为抗肿瘤细胞转移的作用,有望成为一种新型的抗肿瘤和抗肿瘤转移药物。2007 年美国Gemin X制药公司以PG为先导开发的灵菌红素类抗肿瘤专利药物奥巴拉克GX15-070 已经进入临床Ⅲ期研究。
不同结构灵菌红素的抗肿瘤活性存在差异,不同结构灵菌红素抗肿瘤机制有差异。本专利发明了Spartinivicinus ruber S2-4-1H菌(该菌株已于2019年04月17日保藏于中国海洋微生物菌种保藏管理中心,保藏中心登记入册编号:MCCC1K03745)高产ShcPG的培养基及培养方法。红色米草周生菌株可同时产生两种灵菌红素:C
2020年本团队对ShcPG进行了初步抗肿瘤活性研究,结果表明,对A549肿瘤细胞抑制的IC
发明内容
本发明的目的在于提供一种海洋菌发酵高产六氢环庚烷灵菌红素的培养基及方法。
为了达到上述目的,本发明采取以下技术措施:
一种海洋菌发酵高产六氢环庚烷灵菌红素的培养基,所述的培养基的组成为:碳源2g/L,氮源4g/L,氯化钠15.618g/L,氯化镁7.74g/L,硫酸镁3g/L,柠檬酸铁0.22g/L,氯化钙1.16g/L,氯化钾0.55g/L,碳酸钠0.16g/L,溴化钾0.08g/L,氯化锶34.0mg/L,硼酸22.0mg/L,硅酸钠4.0mg/L,氟化钠2.4mg/L,硝酸钾1.6mg/L,磷酸氢二钠8.0mg/L,其余为水;pH 7.74,总盐度2.86%。
以上所述的培养基中,优选的,所述的碳源为花生油。
以上所述的培养基中,优选的,所述的氮源为蛋白胨。
上述一种培养基在海洋菌发酵生产六氢环庚烷灵菌红素中的应用。
以上所述的应用中,优选的,所述的海洋菌为红色米草根际细菌S2-4-1 HMB,其分类命名为
以上所述的应用中,优选的,在应用过程中的发酵培养条件为:培养温度28℃,发酵时间48h。
本发明的显著优点在于:
本发明提供了一种能极大提高Spartinivicinus ruber S2-4-1HT菌产灵菌红素的培养基配方及发酵培养方法,通过特定的培养基成分与发酵条件配合,使海洋菌红色米草根际细菌S2-4-1 HMB代谢产物六氢环庚烷灵菌红素产量大幅提高。
附图说明
图1:培养基中不同浓度花生油对六氢环庚烷灵菌红素产量的影响。
图2:培养基中不同浓度蛋白胨对六氢环庚烷灵菌红素产量的影响。
图3:培养基中pH值对六氢环庚烷灵菌红素产量的影响。
图4:发酵培养温度对六氢环庚烷灵菌红素产量的影响。
图5:培养基中总盐度对六氢环庚烷灵菌红素产量的影响。
图6:发酵培养时间对六氢环庚烷灵菌红素产量的影响。
图7:发酵培养温度与培养基pH值交互作用影响六氢环庚烷灵菌红素产量的响应面图和等高线图。
图8:发酵培养温度与培养基总盐度交互作用影响六氢环庚烷灵菌红素产量的响应面图和等高线图。
图9:培养基总盐度与培养基pH值交互作用影响六氢环庚烷灵菌红素产量的响应面图和等高线图。
图10:培养基钙离子浓度对六氢环庚烷灵菌红素产量的影响。
图11:培养基镁离子浓度对六氢环庚烷灵菌红素产量的影响。
图12:培养基铁离子浓度对六氢环庚烷灵菌红素产量的影响。
图13:培养基钙离子与铁离子交互作用影响六氢环庚烷灵菌红素产量的响应面图和等高线图。
图14:培养基镁离子与铁离子交互作用影响六氢环庚烷灵菌红素产量的响应面图和等高线图。
图15:培养基钙离子与镁离子交互作用影响六氢环庚烷灵菌红素产量的响应面图和等高线图。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解,下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明,但是本发明不仅限于此。
本发明所涉及的MB基础培养基,其配方为:蛋白胨5.0g/L、酵母膏1.0g/L、柠檬酸铁0.1g/L、 氯化钠19.451 g/L、氯化镁 5.9g/L、硫酸镁3.24g/L、氯化钙1.8g/L、氯化钾0.55g/L、碳酸钠0.16g/L、溴化钾0.08g/L、氯化锶0.034g/L、硼酸0.022g/L、硅酸钠0.004g/L、氟化钠0.0024g/L、硝酸铵0.0016g/L、磷酸二钠0.008g/L。pH 7.6±0.2,总盐度30g/L。
本发明所涉及的海洋菌红色米草根际细菌S2-4-1 HMB,其分类命名为
实施例1
(1)红色米草根际细菌S2-4-1 HMB的种子液的制备:将复苏的菌株0.1 mL接种于20 mL的MB培养基中,28℃、160 r/min条件下培养至红色即为种子液。
(2)以葡萄糖或花生油替代MB基础培养基中的酵母膏作为碳源,以酵母粉替代MB基础培养基中的蛋白胨作为氮源;除氮源与碳源外,培养基中其他组份与浓度与MB基础培养基相同,pH及总盐度也与MB基础培养基相同。以2.5%(v/v)接种量将红色米草根际细菌S2-4-1 HMB的种子液接入到培养基中,在28℃、160 r/min条件下发酵培养48小时,以培养液中灵菌红素浓度为考察指标筛选最适碳源及最适氮源。结果见表1。由表1可知,以花生油作为碳源、蛋白胨作为氮源时,红色米草根际细菌S2-4-1 HMB六氢环庚烷灵菌红素的产量最高。
表1碳源、氮源选择结果
(3)固定氮源蛋白胨浓度为5mg/mL,探索培养基中碳源花生油浓度(0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL、8.0 mg/mL)对红色米草根际细菌S2-4-1 HMB产灵菌红素的影响;除氮源与碳源外,培养基中其他组份与浓度与MB基础培养基相同,pH及总盐度也与MB基础培养基相同。以2.5%(v/v)接种量将红色米草根际细菌S2-4-1 HMB的种子液接入到培养基中,在28℃、160 r/min条件下发酵培养48小时,以培养液中灵菌红素浓度为考察指标确定最适碳源添加量。结果见图1。由图1可知,培养基中碳源花生油浓度为2.0 mg/mL时,六氢环庚烷灵菌红素的产量最高。
(4)固定碳源花生油浓度为5mg/mL,探索培养基中氮源蛋白胨浓度(0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL、8.0 mg/mL)对红色米草根际细菌S2-4-1 HMB产灵菌红素的影响;除氮源与碳源外,培养基中其他组份与浓度与MB基础培养基相同,pH及总盐度也与MB基础培养基相同。以2.5%(v/v)接种量将红色米草根际细菌S2-4-1 HMB的种子液接入到培养基中,在28℃、160 r/min条件下发酵培养48小时,以培养液中灵菌红素浓度为考察指标确定最适氮源添加量。结果见图2。由图2可知,培养基中氮源蛋白胨浓度为4.0 mg/mL时,六氢环庚烷灵菌红素的产量最高。
(5)配置MB基础培养基,调节其pH,探索培养基pH(6、6.5、7、7.5、8)对红色米草根际细菌S2-4-1 HMB产灵菌红素的影响。以以2.5%(v/v)接种量将红色米草根际细菌S2-4-1HMB的种子液接入到培养基中,在28℃、160 r/min条件下发酵培养48小时,以培养液中灵菌红素浓度为考察指标确定最适培养基pH。结果见图 3。由图3可知,当培养基pH值为7时,六氢环庚烷灵菌红素的产量最高,可达到1.509±0.62 mg/L。
(6)配置MB基础培养基,探索发酵培养温度(22℃、25℃、28℃、31℃、34℃)对红色米草根际细菌S2-4-1 HMB产灵菌红素的影响。以2.5%(v/v)接种量将红色米草根际细菌S2-4-1 HMB的种子液接入到培养基中,在160 r/min条件下发酵培养48小时,以培养液中灵菌红素浓度为考察指标确定最适发酵培养温度。结果见图 4。由图4可知,当发酵培养温度为31℃时,六氢环庚烷灵菌红素的产量最高,可达到1.320±0.11 mg/L。
(7)配置MB基础培养基,向其中添加NaCl溶液,探索培养基总盐度(1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%)对红色米草根际细菌S2-4-1 HMB产灵菌红素的影响。以2.5%(v/v)接种量将红色米草根际细菌S2-4-1 HMB的种子液接入到培养基中,在28℃、160 r/min条件下发酵培养48小时,以培养液中灵菌红素浓度为考察指标确定最适培养基总盐度。结果见图 5。由图5可知,当培养基总盐度为2.5%时,六氢环庚烷灵菌红素的产量最高,可达到2.049±0.267 mg/L。
(8)配置MB基础培养基,探索发酵培养时间(36 h、42 h、48 h、54 h、60 h)对红色米草根际细菌S2-4-1 HMB产灵菌红素的影响。以2.5%(v/v)接种量将红色米草根际细菌S2-4-1 HMB的种子液接入到培养基中,在28℃、160 r/min条件下发酵培养,以培养液中灵菌红素浓度为考察指标确定最适发酵培养时间。结果见图 6。由图6可知,当发酵培养时间为48小时时,六氢环庚烷灵菌红素的产量最高,可达到2.827±0.4336 mg/L。
实施例2
固定碳源花生油浓度为2mg/mL,固定氮源蛋白胨浓度为4mg/mL,养基中其他组份与浓度与MB基础培养基相同。以2.5%(v/v)接种量将红色米草根际细菌S2-4-1 HMB的种子液接入到培养基中,在160 r/min条件下发酵培养48小时。选择发酵培养温度、培养基pH、培养基总盐度作为因变量,根据单因素试验设计确定各单因素取值范围,以灵菌红素产量为响应值,进行3因素3水平响应面试验设计,采用Box-Behnken设计试验方案。应用DesignExpert 8.0对试验数据进行分析,试验设计及结果见表2、3,拟合得到二次回归方程:Y=6.45-2.21A+1.89B+1.10C-1.67AB-0.0852AC+1.04BC-1.43A
此数学模型的方差分析结果见表4,模型的P<0.0001,表明该模型是高度显著的;失拟项的P=0.6069,表明模型拟合程度理想;复相关系数R
表2 温度、pH、总盐度对灵菌红素产量优化试验方案
表3 温度、pH、总盐度对灵菌红素产量优化试验结果
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表4 温度、pH、总盐度对灵菌红素产量优化试验结果方差分析
实施例3
(1)固定碳源花生油浓度为2mg/mL,固定氮源蛋白胨浓度为4mg/mL,探索培养基中氯化钙浓度(0.05 mg/mL、0.15 mg/mL、0.45 mg/mL、1.35 mg/mL、4.05 mg/mL)对红色米草根际细菌S2-4-1 HMB产灵菌红素的影响;除氮源、碳源和氯化钙外,培养基中其他组份与浓度与MB基础培养基相同,pH为7,总盐度为2.5%。以2.5%(v/v)接种量将红色米草根际细菌S2-4-1 HMB的种子液接入到培养基中,在31℃、160 r/min条件下发酵培养48小时,以培养液中灵菌红素浓度为考察指标确定最适氯化钙添加量。结果见图 10。由图10可知,当培养基中氯化钙浓度为0.45 mg/mL时,灵菌红素的产量最高,可达到1.365±0.022 mg/L。
(2)固定碳源花生油浓度为2mg/mL,固定氮源蛋白胨浓度为4mg/mL,探索培养基中氯化镁浓度(0 mg/mL、1.5 mg/mL、3 mg/mL、6 mg/mL、12 mg/mL)对红色米草根际细菌S2-4-1 HMB产灵菌红素的影响;除氮源、碳源和氯化镁外,培养基中其他组份与浓度与MB基础培养基相同,pH为7,总盐度为2.5%。以2.5%(v/v)接种量将红色米草根际细菌S2-4-1 HMB的种子液接入到培养基中,在31℃、160 r/min条件下发酵培养48小时,以培养液中灵菌红素浓度为考察指标确定最适氯化镁添加量。结果见图 11。由图11可知,当培养基中氯化钙浓度为6.0 mg/mL时,灵菌红素的产量最高,可达到4.790±0.194 mg/L。
(3)固定碳源花生油浓度为2mg/mL,固定氮源蛋白胨浓度为4mg/mL,探索培养基中柠檬酸铁浓度(0.02 mg/mL、0.10 mg/mL、0.50 mg/mL、1.50 mg/mL、3.00 mg/mL)对红色米草根际细菌S2-4-1 HMB产灵菌红素的影响;除氮源、碳源和柠檬酸铁外,培养基中其他组份与浓度与MB基础培养基相同,pH为7,总盐度为2.5%。以2.5%(v/v)接种量将红色米草根际细菌S2-4-1 HMB的种子液接入到培养基中,在31℃、160 r/min条件下发酵培养48小时,以培养液中灵菌红素浓度为考察指标确定最适柠檬酸铁添加量。结果见图 12。由图12可知,当培养基中柠檬酸铁浓度为0.1 mg/mL时,灵菌红素的产量最高,可达到3.475±1.363 mg/L。
实施例4
固定碳源花生油浓度为2mg/mL,固定氮源蛋白胨浓度为4mg/mL,选择氯化钙浓度(钙离子浓度)、氯化镁浓度(镁离子浓度)、柠檬酸铁浓度(铁离子浓度)作为因变量,培养基中其他组份与浓度与MB基础培养基相同,pH为7,总盐度为2.5%。以2.5%(v/v)接种量将红色米草根际细菌S2-4-1 HMB的种子液接入到培养基中,在31℃、160 r/min条件下发酵培养48小时。根据单因素试验设计确定各单因素取值范围,以灵菌红素产量为响应值,进行3因素3水平响应面试验设计,采用Box-Behnken设计试验方案。应用Design Expert 8.0对试验数据进行分析,试验设计及结果见表5、6,拟合得到二次回归方程:
Y=4.47+0.45A+0.35B-0.66C+0.17AB+0.03AC-0.15BC-0.35A
此数学模型的方差分析结果见表7,模型
由回归模型绘出钙、镁、铁离子对灵菌红素产量影响的曲面图和等高线图(见图13至图15)。等高线图中,同一个圆形区域里的色素产量是相同的,在圆形区域的中心,色素产量达到最大;等高线的形状与响应曲面的坡度可以反映各因素间的交互作用,等高线若为椭圆则说明两因素的交互作用显著,若为圆形则说明交互作用不显著;如果响应曲面的坡度比较平缓,说明因素的变化对响应值影响较小,若响应曲面的坡度比较陡峭,则说明响应值对自变量的变化比较敏感。可以看出,图14与图15中三维曲面图较平缓,且等高线图形接近圆形,表明镁离子和铁离子浓度与钙离子和镁离子浓度的交互作用不太显著。图13中高线图形接近椭圆形,但三维曲面图较平缓,表明钙离子与铁离子浓度的交互作用不太显著。回归方程求导得到此模型的最大值,当钙离子浓度1.16 mg/mL,镁离子浓度10.74 mg/mL,铁离子浓度0.22 mg/mL,模型预测灵菌红素浓度为4.737 mg/L,此条件验证试验得到灵菌红素产量实际值为4.782 mg/L,与模型预测值基本吻,说明该模型比较可靠,可用来预测Spartinivicinus ruber S2-4-1HT 发酵产灵菌红素的实际情况。
表5 钙、镁、铁离子对灵菌红素产量优化试验方案
表6 钙、镁、铁离子对灵菌红素产量优化试验结果
表7 钙、镁、铁离子对灵菌红素产量优化试验结果方差分析
实施例5
综合实施例1~4,最终确定一种适用于海洋菌红色米草根际细菌S2-4-1 HMB发酵高产灵菌红素的培养基,其配方为:花生油2g/L,蛋白胨4g/L,氯化钠15.618g/L,氯化镁7.74g/L,硫酸镁3g/L,柠檬酸铁0.22g/L,氯化钙1.16g/L,氯化钾0.55g/L,碳酸钠0.16g/L,溴化钾0.08g/L,氯化锶34.0mg/L,硼酸22.0mg/L,硅酸钠4.0mg/L,氟化钠2.4mg/L,硝酸钾1.6mg/L,磷酸氢二钠8.0mg/L,其余为水;pH 7.74,总盐度2.86%。并确定一种适用于海洋菌红色米草根际细菌S2-4-1 HMB发酵高产灵菌红素的方法,将将红色米草根际细菌S2-4-1HMB的种子液接入到所述适用于海洋菌红色米草根际细菌S2-4-1 HMB发酵高产灵菌红素的培养基中,在28℃、160 r/min条件下发酵培养48小时,经测定,发酵培养液中的灵菌红素浓度达10.62mg/L。
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