一种生物标志物在制备早期诊断肾病综合征试剂中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种生物标志物在制备早期诊断肾病综合征试剂盒中的应用。本发明采用非靶向代谢组学和靶向代谢组学质谱检测方法，用于筛选和鉴定儿童激素敏感型肾病综合征早期诊断及发生发展。

技术背景

肾病综合征(nephrotic syndrome,NS)是由于肾小球滤过膜对血浆蛋白通透性增高、大量血浆蛋白自尿中丢失而导致一系列病理生理改变的一种临床综合征，期临床特征为大量蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症和水肿。肾病综合征可分为原发性、继发性和先天性3种，原发性INS(Idiopathic Nephrotic Syndrome)约占小儿时期NS总数的90％(Filler G,Young E,Geier P,Carpenter B,Drukker A,Feber J.Is there really an increase innon-minimal change nephrotic syndrome in children？Am J Kidney Dis.2003Dec；42(6):1107-13.doi:10.1053/j.ajkd.2003.08.010.PMID:14655180.)，是儿童常见的肾小球疾病之一。国外报道儿童INS年发病率(2-4)/10万，患病率为16/10万(Eddy AA,SymonsJM.Nephrotic syndrome in childhood.Lancet.2003Aug 23；362(9384):629-39.doi:10.1016/S0140-6736(03)14184-0.PMID:12944064；Wong W.Idiopathic nephroticsyndrome in New Zealand children,demographic,clinical features,initialmanagement and outcome after twelve-month follow-up:results of a three-yearnational surveillance study.J Paediatr Child Health.2007May；43(5):337-41.doi:10.1111/j.1440-1754.2007.01077.x.PMID:17489822.)，我国37所协作医院的统计资料显示，PNS约占同期泌尿系统疾病住院患儿总数的20％。(全国儿童常见肾脏病诊治现状调研工作组.我国儿童激素敏感、复发/依赖肾病综合征诊疗现状的多中心研究[J].中华儿科杂志,2014,52(3):194-200.DOI:10.3760/cma.j.issn.0578-1310.2014.03.007.)该疾病严重危害儿童身心健康，对患儿家庭及社会造成巨大经济负担。糖皮质激素(Glucocorticoid，GC)是全球公认的治疗肾病综合征一线方案，根据激素治疗的初始反应可将其分为激素敏感型肾病综合征(Steroid sensitive nephrotic syndrome，SSNS；定义为足量激素初始治疗≤4周尿蛋白转阴者)和激素耐药型肾病综合征(Steroid resistantnephrotic syndrome，SRNS；定义为足量激素初始治疗＞4周尿蛋白仍正离子者)。80％-90％的儿童患者为激素敏感型肾病综合征(Zotta F,Vivarelli M,Emma F.Update on thetreatment of steroid-sensitive nephrotic syndrome.Pediatr Nephrol.2022Feb；37(2):303-314.doi:10.1007/s00467-021-04983-3.Epub 2021Mar 5.PMID:33665752.)。这一类的肾病综合征的发病机制尚不清楚且复杂多样，遗传因素、免疫紊乱、炎性介质及高脂血症、大量蛋白尿等代谢因素均可能参与，延误了早期识别早期发现。目前，依据2021年KDIGO指南及2021中华医学会儿科分会肾脏学组指南,INS的早期诊断主要依靠基因检测和肾活检，而基因检测耗时长且费用高，肾活检是有创检测。因此，亟需一种新的无创且即时的诊断方法，方便临床医生更快更准确的确定INS患儿。

随着人类基因组测序工作的完成，基因功能的研究逐渐成为热点，随之出现了一系列的“组学”研究，包括研究转录过程的转录组学(transcriptomics)、研究某个生物体系中所有蛋白及其功能的蛋白组学(proteomics)及研究代谢产物的变化及代谢途径的代谢组学(metabolomics/metabonomics)。与其它组学不同，代谢组学是研究生物体系(细胞，组织或生物体)受外部刺激所产生的所有代谢产物的变化的科学，其研究对象为相对分子量＜1500的小分子化合物(包括糖、氨基酸、有机酸、核酸、脂质等)，并对小分子化合物进行鉴定定量。它采用现代高通量、高灵敏度的检测手段对生物样本中的代谢物进行系统分析，核心概念是机体的代谢状态反映了机体的整体状况，同时也受到基因组编码、饮食、环境等因素共同影响(Beger RD,Dunn W,Schmidt MA,Gross SS,Kirwan JA,Cascante M,BrennanL,Wishart DS,Oresic M,Hankemeier T,Broadhurst DI,Lane AN,Suhre K,KastenmüllerG,Sumner SJ,Thiele I,Fiehn O,Kaddurah-Daouk R；for“Precision Medicine andPharmacometabolomics Task Group”-Metabolomics Society Initiative.Metabolomicsenables precision medicine:"A White Paper,Community Perspective".Metabolomics.2016；12(10):149.doi:10.1007/s11306-016-1094-6.Epub 2016Sep2.PMID:27642271；PMCID:PMC5009152.)。肾脏是人体小分子化合物代谢和清除的主要器官。肾功能受损可导致血清或尿液代谢物浓度的变化，并可作为肾脏疾病的预测指标。因此，代谢组学是研究肾脏疾病的一种非常前瞻性的实用方法。目前已有关于应用代谢组学寻找发现急性肾损伤、慢性肾脏病、常染色体显性遗传多囊肾及肾癌等肾脏疾病代谢标志物的报道(Fanos V,Fanni C,Ottonello G,Noto A,DessìA,Mussap M.Metabolomics inadult and pediatric nephrology.Molecules.2013Apr 24；18(5):4844-57.doi:10.3390/molecules18054844.PMID:23615531；PMCID:PMC6270081.)。迄今为止，儿童激素敏感型肾病综合征仍以传统的尿蛋白及血白蛋白水平作为临床诊断及监控疾病发生发展的指标，存在滞后性，尚缺乏早期临床特异性标志物及可靠的反映疾病发生发展的标志物。因此，发现儿童激素敏感型肾病综合征早期诊断的生物标志物并及时监测至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物标志物在制备早期诊断肾病综合征(SSNS)试剂盒中的应用，所述的生物标志物包括Dulcitol(半乳糖醇)、D-Sorbitol(山梨醇)、D-Mannitol(甘露醇)、NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)、α-KG like(酮戊二酸类似物)、Bilirubin(胆红素)、NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)。本发明根据血液中标志物的表达量可以预测患者是否具有肾功能异常，从而进行肾病综合征早期诊断。

本发明验证发现所述的生物标志物与SSNS的发生和发展密切相关，且将其应用于早期诊断的诊断效能较好，具有较高的准确性、敏感性、特异性，为SSNS的早期诊断和监控疾病发生发展提供了有价值的生物学信息。

本发明首先通过UHPLC-QTOF-MS方法检测发现集(对照组56人，INS患者27人)中初发SSNS患者的血清和尿液的非靶向代谢组学，结果表明相比于尿液，SSNS患者的血清与健康人组差异更加明显。且用药一周后，即使患者尿蛋白转阴后仍然与健康人组有显著差异,由此也提示代谢物比传统的尿蛋白指证更能反映疾病真实生理变化，也更能说明肾病综合征患者已复发的内在因素。差异通路富集分析结果表明，SSNS患者血清代谢物存在氨基酸代谢异常。进一步结合因果预测分析模型，我们发现8个分子与SSNS发生密切相关，其中正相关的是Dulcitol、D-Sorbitol、D-Mannitol、Xanthosine 5'-monophosphate(XMP)，负相关的是NADPH、NAD、Bilirubin、alpha-Ketoglutaric acid(α-KG)。通过三重四级杆靶向质谱仪检测，建立这8个代谢物的检测方法，并在验证集(对照组65人，INS患者65人)进行验证，结果表明其中6个分子(Dulcitol、D-Sorbitol、D-Mannitol、NADPH、NAD、Bilirubin、)和非靶向代谢组学筛选得到的趋势一致，其中有一个明显差异分子与α-KG峰位极其相似，但经过多次验证，其虽然也在α-KG质谱洗脱条件下出现，但显然是不一样的物质。因此，我们将其描述为α-KG like物质，其也有明显的差异。

Dulcitol：半乳糖醇，目前研究不是很多，只有一篇报道暗示其在肾癌患者的尿液明显下降。D-Sorbitol：山梨醇，是一种利尿剂，有报道在尿毒症综合征患者的血清中上调。D-Mannitol：甘露醇，其对肾脏的作用有充分认识，其能诱发肾毒性也有报道。NAD：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，是一种重要的辅酶，调节多种代谢途径，在AKI患者中显著降低。Bilirubin：胆红素，是血红素分解的主要最终产物，是胆汁的重要组成部分，负责其特有的颜色。胆红素本身应该被视为急性肾小管坏死的潜在原因。NADPH：还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,可诱导肾脏微粒体发生化学发光和脂质过氧化作用。

本发明创新点归纳如下：

(1)本发明和既往其它研究相比，对初发的SSNS患者血清标本和尿液标本均进行了代谢组学分析，并证实血清中代谢物更具有差异性。

(2)本发明和既往其它研究相比，对SSNS患儿使用足量激素0周及使用足量激素1周的尿液及血液标本分别进行代谢组学分析，提示激素治疗一周后对代谢物影响不显著。

(3)本发明和既往其它研究相比，不仅做了非靶向代谢组学检测，还对相关标志物进行了靶向验证，并优化标志物检测方法，能同时检测出大量样本缩短了检测时间。所证实的差异代谢物具有较高的准确性、敏感性、特异性，为儿童激素敏感型肾病综合征的早期诊断和监控疾病发生发展提供了重要依据，填补了国内外空白。

(4)本发明生物标志物与儿童激素敏感型肾病综合征(SSNS)早期诊断及发生发展相关，可将其应用于SSNS的早期诊断试剂盒中。

附图说明

图1：血清中非靶向代谢物的PCA和OPLS-DA分析；其中：(A)正离子和(B)负离子模式的血清样品通过UHPLC-QTOF-MS检测非靶向代谢物谱的主成分分析(PCA)图。PCA分析图显示了健康人和SSNS两组的具有明显代谢物分离。(C)正离子和(D)负离子模式的血清样品代谢物的正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)的评分图。

图2：尿液中非靶向代谢物的PCA和OPLS-DA分析，其中：(A)正离子和(B)负离子模式的血清样品通过UHPLC-QTOF-MS检测非靶向代谢物谱的PCA得分图。PCA分析图显示了健康人和SSNS两组的没有明显代谢物分离。(C)正离子和(D)负离子模式的尿液样品代谢物OPLS-DA分析图。

图3：使用MetaboAnalyst在正离子模式下进行全局通路分析。图中列出了在正离子模式检测下SSNS组差异的代谢物，以及这些代谢物富集的代谢通路。甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、苯丙氨酸代谢和色氨酸代谢的途径。

图4：使用MetaboAnalyst在负离子模式下进行全局通路分析。图中列出了在负离子模式检测下SSNS组差异的代谢物，以及这些代谢物富集的代谢通路。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、组氨酸代谢和精氨酸生物合成的途径。

图5：基于正离子模式下非靶向分析检测到的代谢物的火山图，其中：(A)基于负离子模式下非靶向分析检测到的代谢物的火山图；(B)正离子模式下差异代谢物的富集的疾病通路；(C)负离子模式下差异代谢物的富集的疾病通路；(D)正离子模式下差异代谢物的富集的疾病通路；(E)①嘌呤代谢、②半乳糖代谢、③缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成、④果糖和甘露糖代谢、⑤甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、⑥氨酰-tRNA生物合成；(F)负离子模式下分化代谢物的途径：①丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，②精氨酸生物合成，③氨酰-tRNA生物合成，④柠檬酸循环(TCA循环)，⑤组氨酸代谢，⑥D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢。

图6：与SSNS相关的8种潜在代谢标志物的表达图。

图7：SSNS组中八种代谢物的因果效应估计。

图8：SSNS组中八种代谢物靶向定量检测。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

本发明实施例所用的试剂和仪器：

实施例1标志物筛选

步骤1.研究人群和样本采集、样本预处理

该研究经伦理委员会批准(伦理编号：2020-IRBAL-092)，并遵照《赫尔辛基宣言》进行。该项研究包括自2020年以来在医院注册的6～276个月的受试者。收集了27名SSNS患者和56名健康儿童的血清样本作为对照。关于尿液样本，收集了17名SSNS患儿和27名健康儿童的样本。当24小时尿蛋白排泄量≥50mg/kg，晨尿蛋白/肌酐＞2mg，低白蛋白血症＜25g/L，用足量泼尼松[2mg/(kg-d)或60mg/(m-d)]治疗者尿蛋白负离子≤4周，即可诊断为SSNS。进行无条件逻辑回归以相应的CI(95％)，并针对年龄、体质指数(BMI)、尿微量白蛋白(UAlb)、尿肌酐(UCr)、尿蛋白-肌酐比值(Up/Ucr)、血清肌酐(sCr)、甘油三酸酯(TG)、总胆固醇(TCHO)、肾小球滤过率(eGFR)进行了统计。在非空腹状态下收集参与者的血液和尿液样本，并在4℃下以3000rpm离心20分钟；然后将血清和尿清保存在-80℃以备进一步分析，血液标本为无菌操作条件下取晨起空腹静脉血1ml，收集于EDTA抗凝管中，留取后立即室温下3000r/min离心5min，取上清液，-80℃冰箱冻存。

结果如Table 1所示，研究参与者的一般特征。所有患者均为初发SSNS，未进行任何甾醇治疗。关于血清样本，正常组和患者组的中位年龄分别为58.9(95％置信区间[CI]：51.4-66.4)和37.0(95％CI，27.0至77.5)月。对于尿液样本，正常组和患者组的中位年龄分别为72.5(95％CI：56.0-89.1)和31.5(95％CI，48.0-92.5)月。在正常组中，血清和尿液样本中的男女比例约为1：1，而在SSNS组中，男女比例约为1.6：1，与其他研究相似。两组年龄或性别差异无统计学意义(p值>0.05)。

表1.基线时患者的临床资料

步骤2.代谢物分析的样品制备、使用UHPLC-QTOF-MS进行非靶向代谢物检测分析

在1.5mL/2mL Eppendorf管中使用800μL HPLC级甲醇(甲醇：H

使用包括Agilent 1290Infinity II UHPLC系统和Agilent6545 QTOF/MS(Agilent)的LC-MS系统进行分析。在ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm)上实现色谱分离。流动相由15mM乙酸铵、0.3％ NH

质谱数据是在200–1200m/z的正离子和负离子模式下使用电喷雾电离获得的。其他质谱设置包括：鞘气温度300℃，鞘气流速11L/min，VCap 3500V，毛细管0.09mA，喷嘴电压0V，气体温度275℃，碎裂器150V，分离器65V。原始数据使用Profinder 10.0(Agilent)进行处理，并进行峰值检测、校准和整合。所有的代谢物变量都是从UHPLC-QTOF-MS数据集中获得的。两组之间或多组之间进行了T检验、Wilcoxon检验和方差分析(ANOVA)检验并使用卡方检验比较分类变量。通过MetaboAnalyst 4.0版(http://www.metaboanalyst.ca)进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)。在进行PCA之前，数据被缩放为单位方差。代谢物富集度在进行路径分析前进行了对数转换。所有的统计测试都是双侧的，显著性设置为P＜0.05。

结果如图1所示，在UHPLC-QTOF-MS数据集中，在正离子模式下共检测到6870个代谢物特征，在负离子模式下检测到12760个代谢物特征。经过数据标注，正离子模式下我们获得了178个的代谢物特征,负离子模式下的163个代谢特征。我们应用主成分分析(PCA)模型和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)来确定SSNS患者的代谢特征是否与正常组不同。PCA模型中两组血清样品在正离子(图1A)和负离子模式(图1C)均有明显的分离趋势，OPLS-DA的评分图显示两组血清样品有明显的分离趋势(图1B，D)。然而，这两组尿样之间没有明显的分离趋势(图2)。因此，进一步分析血清样品以进行差异分析。此外，激素治疗一周后，PCA和OPLS-DA分析表明两组之间尿液的代谢谱没有差异。

为了探索SSNS疾病相关的代谢途径，如图3所示，对于正离子模式，SSNS病例的代谢物主要富集的通路包括甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢，丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢，牛磺酸和次牛磺酸代谢，苯丙氨酸代谢和色氨酸代谢。对于负离子模式，SSNS病例差异的代谢物主要富集的通路包括丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢，甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢，苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成，组氨酸代谢和精氨酸生物合成通路(图4)。

在正离子模式(111个)和负离子模式(113个)下，SSNS组中共鉴定出22个显著上调和172个显著下调的代谢物。在这些改变的代谢物中，正离子和负离子模式均验证了3种不同的上调代谢物和27种不同的下调代谢物，并进一步对差异显著的代谢物进行富集疾病途径(图5A/B)。如图5C/D所示，在正离子和负离子模式下都预测了慢性肾功能衰竭。这些结果表明，差异代谢物与肾脏功能有关。这些不同的代谢物进一步进行通路分析。结果显示，儿童SSNS与健康对照组的主要差异集中在氨基酸代谢和TCA循环上(图5E/F)。

本发明进行了层次聚类分析(HCA)和曲线下面积(AUC)分析，以对显着改变的代谢物进行全局可视化。正常组和SSNS组之间血清水平显示显着模式的代谢物被确定为早期检测SSNS的潜在生物标志物。其中，根据HCA簇和AUC分析(AUC＝1，log2(FC)>5)(图6)选择了前8种代谢产物，即Dulcitol、D-Sorbitol、D-Mannitol、XMP、NADPH、NAD、Bilirubin、α-KG。

步骤3.因果效应估计

因果效应在变量之间呈现出稳定且可解释的关系，但很难被确定。相比之下，统计方法和机器学习方法能研究变量的相关性。但是，虽然可以找到相关性，但它并不能说明变量之间的因果关系。在某些情况下，观察到的关联是“虚假关联”，这意味着两个变量都与第三个变量有关，而这个变量在模型中被遗漏了。此外，当数据集和样本的选择发生变化时，就会出现选择偏差。为了克服这个缺点，本申请应用了因果推断，它从多个不同的研究领域诞生并发展而来，包括计算机科学、计量经济学、生物统计学和流行病学(Hernan,Robins2020；Pearl,Mackenzie 2018)。更具体地说，应用了DoWhy模型，该模型可以指定和测试因果假设(Glass等人，2013年；Sharma，Kiciman 2020年)。因果关系的推断可以在传统使用的统计方法之外，提供一个更可靠的参考。

为了验证假设，应用了因果推理模型，即DoWhy模型分析，构建一个多因素相关性(Dulcitol、D-Sorbitol、D-Mannitol、XMP、NADPH、NAD、Bilirubin、α-KG)评估所选变量与SSNS之间的因果关系。假设所有这些变量对SSNS都有因果效应，并研究了因果效应关系的强度。所有数据都通过最小-最大归一化预处理到范围内，因为某些变量的值比其他变量大几个数量级，这可能导致对其他变量的贡献的错误估计。所有变量对SSNS均显示出明显的因果效应(图7)。四个变量具有正因果效应，即Dulcitol、D-Sorbitol、D-Mannitol、XMP，而其他四个变量具有负相关的因果效应，即NADPH，NAD，Bilirubin、α-KG。

实施例2靶向代谢物定量验证

步骤1.新的研究人群和样本采集、样本预处理

收集了41名SSNS患者和43名健康儿童的血清样本作为对照。临床信息整理，血清样品采集及预处理方式同前。正常组和患者组的中位年龄分别为61.0(95％置信区间[CI]：45.0-84.0)和41.0(95％CI，28.0至66.0)月。在正常组中，血清和尿液样本中的男女比例约为1.6：1，而在SSNS组中，男女比例约为2.1：1，与其他研究相似。两组年龄或性别差异无统计学意义(p值>0.05)。

表2.验证集患者基线临床资料

步骤2.针对筛选出来的标志物使用三重四级杆进行绝对定量

MS技术提供了检测和量化大量代谢物的能力。目前对目标代谢物的量化是在配备有Agilent Jet Stream ESI源的Agilent 1290Infinity II LC和Agilent 6495TripleQuadrupole MS系统(Agilent Technologies,Palo Alto,CA,USA)上进行的。Mass HunterWorkstation(Ver B.06.00,Agilent Technologies)软件用于数据采集和分析。根据差异代谢物的生物理化差异，分别选用三种不同的方法进行检测。

2.1甲醇法提取代谢物后，用负离子检测模式下，D-Mannitol(甘露醇,182.0788g/mol,C

2.2甲醇法提取代谢物后，用正离子检测模式下，NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,663.1275g/mol,C

如图8所示，与非靶向代谢谱一致，SSNS组的D-甘露醇，杜尔西醇和D-山梨醇水平较高，而SSNS组的NADPH，NAD，胆红素和α-酮戊二酸类似物水平较低。