一种纯化蛋白的方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种纯化蛋白的方法。

背景技术

目前，无论是实验室规模还是工业生产领域，蛋白纯化都是基因工程和蛋白质工程中的关键环节。据统计，基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60％-80％。已经开发出高效的原核、真菌和真核细胞类蛋白表达体系，然而，不论通过何种体系表达，目的蛋白都可能与组织和细胞中的其它蛋白相互作用形成复杂的混合物，造成分离纯化十分困难。

因此，提供一种操作简便，纯度高的纯化蛋白的方法是本领域亟需解决的问题。

发明内容

为弥补现有技术的不足，本发明提供了一种纯化蛋白的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种纯化蛋白的方法，所述方法包括：

(1)可操作的连接编码信号肽、标签、蛋白酶裂解位点的核酸至编码目的蛋白的核酸序列上，从而生成编码融合蛋白的表达载体；

(2)将所述的表达载体导入宿主细胞。

进一步，步骤(1)所述的信号肽、标签、蛋白酶裂解位点与目的蛋白依次连接。

进一步，所述信号肽包括CD33信号肽、人生长激素信号肽、hIG1 Kappa轻链信号肽、β2微球蛋白信号肽或IL2信号肽。

进一步，所述信号肽选自CD33信号肽。

进一步，所述CD33信号肽序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步，所述标签包括HA标签、His标签、Flag标签、c-Myc标签、V5标签或C9标签。

进一步，所述标签选自His标签。

进一步，所述His标签包括1-20个组氨酸残基。

进一步，所述His标签包括6-10个组氨酸残基。

进一步，所述His标签选自10个组氨酸残基。

进一步，所述His-标签还包括(His

进一步，所述R为丙氨酸残基。

进一步，所述His标签序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步，所述蛋白酶裂解位点如SEQ ID NO.5所示。

进一步，所述目的蛋白选自KLKB1蛋白。

进一步，所述KLKB1蛋白包括全长、部分截短的或截短的KLKB1蛋白。

进一步，所述KLKB1蛋白选自截短的KLKB1蛋白。

进一步，所述截短的KLKB1蛋白序列如SEQ ID NO.6所示。

进一步，步骤(2)所述宿主细胞包括原核宿主细胞、真核宿主细胞。

进一步，所述宿主细胞选自真核宿主细胞。

进一步，所述真核宿主细胞包括哺乳动物细胞、昆虫、酵母。

进一步，所述真核宿主细胞选自哺乳动物细胞。

进一步，所述哺乳动物细胞包括啮齿动物细胞、人细胞。

进一步，所述哺乳动物细胞选自人细胞。

进一步，所述人细胞包括Hela、HEK293、H9、Per.C6、Jurkat细胞。

进一步，所述人细胞选自HEK293细胞。

本发明的第二方面提供了一种蛋白，所述蛋白由本发明第一方面所述的方法制备而成。

本发明的第三方面提供了一种核酸，所述核酸包括编码本发明第二方面所述的蛋白的核苷酸序列。

本发明的第四方面提供了一种表达载体，所述表达载体包括本发明第三方面所述的核酸。

本发明的第五方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本发明第四方面所述的表达载体。

本发明的优点和有益效果：

本发明将CD33信号肽、His标签、蛋白酶裂解位点与KLKB1蛋白依次连接，对融合后的蛋白进行纯化，结果表明，本发明提供的蛋白纯化方法纯化的蛋白具有较高的表达量和纯度，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是序列1蛋白表达、纯化后电泳检测结果图；

图2是序列2蛋白表达、纯化后电泳检测结果图；

图3是序列3蛋白表达、纯化后电泳检测结果图；

图4是序列4蛋白表达、纯化后电泳检测结果图；

图5是序列5蛋白表达、纯化后电泳检测结果图。

具体实施方式

下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。

本发明提供了一种纯化蛋白的方法，所述方法包括：

(1)可操作的连接编码信号肽、标签、蛋白酶裂解位点的核酸至编码目的蛋白的核酸序列上，从而生成编码融合蛋白的表达载体；

(2)将所述的表达载体导入宿主细胞。

进一步，步骤(1)所述的信号肽、标签、蛋白酶裂解位点与目的蛋白依次连接。

在本发明中，信号肽(也称为信号序列、前导序列或前导肽)在结构上通过疏水性氨基酸链段来表征，其具有形成单个α-螺旋的趋势。这个疏水性链段通常紧接在富含正电荷氨基酸(尤其是赖氨酸)的较短链段后。从成熟多肽切下的信号肽通常终止于被信号肽酶识别和切割的一段氨基酸。指导多肽基因产物插入膜中的信号肽，有时称为信号锚定序列，可以缺少被信号肽酶切割的氨基酸序列，并且在这种情况下保留在多肽基因产物中。信号肽通常可以通过在翻译的同时或翻译后将多肽指引转运到胞质外，并且例如通过原核生物的质膜(或革兰氏阴性细菌如大肠杆菌的内膜)，或转运至真核细胞的内质网中的能力来功能表征。

本发明的信号肽包括但不限于人生长激素信号肽、hIG1Kappa轻链信号肽、β2微球蛋白信号肽、CD33信号肽或IL2信号肽，信号肽的长度可以在3-33，3-10，10-30，10-20，15-30或20-30个氨基酸之间。

在本发明的具体实施方案中，信号肽选自CD33信号肽，在本发明中CD33信号肽可以与SP1互换使用。

在本发明中，标签指可用作标志物的任何化学结构，本发明的标签包括但不限于组氨酸(His)标签(特别是聚组氨酸标签)、精氨酸标签(特别是聚精氨酸标签)、抗体的肽底物、几丁质结合结构域、RNAse S肽、蛋白A、β-半乳糖苷酶、Flag标签、Strep II标签、链霉亲和素结合肽(SBP)标签、钙调蛋白结合肽(CBP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、S-标签、HA标签或c-Myc标签、V5标签、C9标签或任何其他已知可用于高效纯化与其融合的蛋白质的标签。

在本发明的实施方案中，通常标签具有约1-3kDa低分子量。示例性非限制的低分子量标签包括HA标签、His标签、Flag标签、c-Myc标签、V5标签或C9标签。

在本发明的实施方案中，标签选自His标签。

本发明中的His标签优选包括1-20个组氨酸残基，甚至更优选为1-His、2-His、3-His、4-His、5-His、6-His、7-His、8-His、9-His、10-His、11-His、12-His、13-His、14-His、15-His、16-His、17-His、18-His、19-His或20-His标签序列。

在本发明的一种实施方案中，His标签包括6-10个组氨酸残基，优选的为6-His、7-His、8-His、9-His、10-His。

在本发明的优选的实施方案中，His标签选自10个组氨酸残基，即10-His。

在一些实施方案中，标签中还包括除了His之外的其它残基。参见，例如，Knecht(2008)J.Mol.Recognit.22：270-279；Charlton(2008)Methods in Molecular Biology421:25-36。在一些实施方案中，His-标签可以包含(His

在本发明的具体实施方案中，R为丙氨酸残基(A)。

在一些实施方案中，His标签可以与一种或多种不同的亲和标签结合使用。在一些实施方案中，His标签可以位于目的蛋白质的N-末端或其附近，表示为HHHHHHHHHHA。在其它实施方案中，His标签可以位于目的蛋白质的C-末端或其附近，表示为AHHHHHHHHHH。

在本发明的具体实施方案中，His标签位于目的蛋白质的N-末端或其附近。

在本发明中，蛋白酶裂解位点包括但不限于IEGR、DDDDK、LVPRGS、ENLYFQG和LEVLFQGP。

在本发明的具体实施方案中，蛋白酶裂解位点选自LEVLFQGP(SEQ IDNO.5)。

进一步，本发明的目的蛋白选自KLKB1蛋白。

所述KLKB1蛋白可以包括全长、部分截短的或截短的KLKB1蛋白，或包括能引发对KLKB1的免疫应答的一个或多个表位的它的任何片段。

在本发明的实施方案中，所述KLKB1蛋白选自截短的KLKB1蛋白。

在本发明的优选的实施方案中，目的蛋白包括SEQ ID NO.6或与SEQ IDNO.6至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在本发明的另一种优选的实施方案中，所述目标蛋白包含或由以下组成：与SEQ ID NO.6至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其被修饰使得所述氨基酸序列在非保守区域发生氨基酸置换和残基的缺失，其中所述位置对应于SEQ ID NO.6的与SEQID NO.6至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列内的等同位置。

在本发明中，缺失是从蛋白序列中去除一个或多个氨基酸残基。通常，在蛋白分子内的任何一个位点处缺失不超过约1至6个残基(例如1至4个残基)。

在本发明的具体实施方案中，所述截短的KLKB1蛋白序列如SEQ ID NO.6所示。

在本发明的具体实施方案中，所述蛋白以SP1(SEQ ID NO.3)-His标签(SEQ IDNO.4)-蛋白酶裂解位点(SEQ ID NO.5)-KLKB1蛋白序列(SEQ ID NO.6)依次连接，组成序列1(SEQ ID NO.7)。

在本发明中，宿主细胞为寄生其他微生物或基因来供给营养的细胞，是指载体转化在宿主细胞来在宿主细胞中发挥各种基因或分子影响的细胞，同本发明实施例中的蛋白表达体系。

在本发明中，转化是指将脱氧核糖核酸(DNA)引入至宿主来使脱氧核糖核酸作为染色体的因子或通过染色体整合完成而复制，将外部的脱氧核糖核酸引入至细胞内来人为引起遗传变化的现象。上述转化方法包括CaCl

可根据所使用的宿主细胞的类型来选择生长培养基、生长温度和其他生长条件。用于从表达蛋白质的细胞培养物中收获宿主细胞的各种不同的方法是本领域技术人员熟知的，并且包括例如包含宿主细胞的培养基的离心，以及包含宿主细胞的培养基的过滤。通常，随后将所述细胞进行裂解，要么通过化学或机械的方法，要么通过其组合。

可以对包含诱导型表达构建体的宿主细胞的基因功能进行某些改变，以促进诱导剂对宿主细胞群体的有效且同源的诱导。优选地，表达构建体、宿主细胞基因型和诱导条件的组合导致培养物中至少75％(更优选至少85％，最优选至少95％)的细胞从每个诱导的启动子表达基因产物。

在本发明中，宿主细胞包括原核宿主细胞、真核宿主细胞。

其中，原核宿主细胞包括但不限于古细菌(如沃氏嗜盐富饶菌(Haloferaxvolcanii)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus))、革兰氏阳性细菌(如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)或变铅青链霉菌(Streptomyces lividans))，或革兰氏阴性细菌，包括α-变形菌纲

(Alphaproteobacteria)(根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)和苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti))，β-变形菌纲(Betaproteobacteria)(真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus))和γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)(醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticusus)、棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)、大肠杆菌、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的γ-变形菌，如肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏菌属(Escherichia)(包括大肠杆菌)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)(包括鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium))、沙雷氏菌属(Serratia)(包括粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans))和志贺氏菌属(Shigella)。

在本发明的实施方案中，所述宿主细胞选自真核宿主细胞。

所述真核宿主细胞包括哺乳动物细胞、昆虫、酵母。

其中，酵母包括但不限于巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。

昆虫包括但不限于Sf9、Mimic Sf9、Sf21、HighFive。

在本发明的优选的实施方案中，真核宿主细胞选自哺乳动物细胞。

哺乳动物细胞包括啮齿动物细胞、人细胞。

其中，啮齿动物细胞包括但不限于小鼠NIH3T3，NS0和C127细胞，COS 1，COS 7和CV1，L细胞，肉瘤细胞，Bowes黑素瘤细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

人细胞包括但不限于Hela、HEK293、H9、Per.C6或Jurkat细胞。

在本发明的最优选的实施方案中，哺乳动物细胞选自人细胞。

在本发明的具体实施方案中，人细胞选自HEK293细胞。

在本发明中，纯化是指将目的蛋白从一种或多种污染物中分离。污染物是不同于所述蛋白或目标蛋白或其缀合物(例如生物缀合物)的任何物质。污染物可以例如是细胞碎片、核酸、脂质、除融合蛋白或目标蛋白之外的蛋白、多糖和其他细胞组分。

本发明中的用于回收和纯化本申请所述的方法连接的蛋白的方法包括但不限于使用微生物蛋白质的亲和层析(例如蛋白A或蛋白G亲和层析)，使用重组蛋白作为配体(例如单链Fv作为配体，例如Kappa选择)的亲和层析，离子交换层析(例如阳离子交换(羧甲基树脂))，阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式交换)，亲硫吸附(例如用β-巯基乙醇和其他SH配体)，疏水相互作用或芳香吸附层析(例如用苯基-琼脂糖，氮杂-arenophilic树脂或间氨基苯基硼酸)，金属螯合物亲和层析(例如用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)，大小排阻层析和电泳方法(如凝胶电泳，毛细管电泳)。这些方法可以在本发明中报道的不同实施方式中独立地组合。

在本发明的实施方案中，所述方法选自凝胶电泳。

本发明提供了一种核酸，所述核酸包括编码上述蛋白的核苷酸序列。

在本发明中，核酸与核酸分子可互换使用，本发明的核酸还包括上述核酸的互补序列，例如反义核苷酸或探针。

本发明的核酸可以是RNA形式(例如mRNA)或DNA形式，包括例如cDNA、合成的DNA或基因组DNA。可通过克隆、化学合成技术或它们的组合获得这些核酸。例如，可用固相亚磷酰胺化学合成等技术化学合成，从基因组或cDNA文库获得，或从生物体分离来制备这些核酸。通常可通过体外或体内转录DNA序列而产生RNA分子。

所述核酸可以是双链，也可以是单链。单链DNA可以是编码链(也称为正义链)，或非编码链(也称为反义链)。

编码本发明蛋白的核酸可与本发明所述一个或多个核酸的编码序列相同。

本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括上述核酸。

在本发明中，表达载体与载体可互换使用，为可在适当的宿主细胞中表达目的蛋白的表达载体，是指包含可操作地连接必须调控元件来表达核酸插入物的核酸构建体。上述载体包含本领域通常使用的质粒、细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。

其中，质粒包括但不限于pSC101、pGV1106、pACYC177、ColE1、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFR1、pHV14、pGEX系列、pET系列及pUC19。

噬菌体包括但不限于λgt4λB、λ-Charon、λΔz1及M1。

病毒包括但不限于CMV、SV40。

通常，载体可以含有一个或多个复制起点(ori)和用于克隆或表达的遗传系统，用于在宿主中选择的一个或多个标志物，例如抗生素抗性和一个或多个表达盒。适合的复制起点的例子包括例如全长ColE1，其截短的形式，如存在于pUC质粒上的那些，SV40病毒和M13噬菌体复制起点。可选择标志物的非限制性例子包括氨苄青霉素，氯霉素，四环素，卡那霉素，dhfr，gpt，新霉素，潮霉素，杀稻瘟素或遗传霉素。

此外，所述载体包含与本发明所述的核酸可操作地连接的调控序列。本发明的载体能够指导本发明提供的核酸的复制和表达，例如包含编码本发明提供的蛋白的核苷酸序列的核酸。

如上所述的核酸和/或载体可以设计用于通过例如非化学方法(电穿孔，声孔(sonoporation)，光学转染，基因电转移，流体动力递送，或将细胞与本发明的核酸接触时的自然发生的转化)，基于化学的方法(磷酸钙，DMSO，PEG，脂质体，DEAE-葡聚糖(dextrane)，聚乙烯亚胺，核转染等)，基于颗粒的方法(基因枪，磁转染(magnetofection)，刺穿染(impalefection))，基于噬菌体或噬菌粒载体的方法和病毒方法引入细胞中。例如，可以使用衍生于病毒如逆转录病毒，牛痘病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒，塞米利克森林病毒(Semliki Forest Virus)或牛乳头瘤病毒(bovine papilloma virus)的表达载体用于将核酸递送到目标细胞群体中。

如果没有明确地另外指出，在本发明中使用术语“包含/包括”是为了表明，除了在“包含/包括”之下所列示的组分之外，其他组分也可能可选地存在。然而，被认为是特别的实施方案的是，术语“包含/包括”包括没有其他组分存在的可能性，即在该特别的实施方案的范围内，术语“包含/包括”被理解为术语“由......组成”。

下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。

实施例1蛋白纯化方法

1.1实验材料

HEK293细胞购自ATCC

1.1实验方法

1.1.1表达载体构建

1、PCR扩增

扩增目的基因所用引物序列如表1所示；

表1引物序列

引物是干粉状存在，13000rpm离心5min，将引物稀释成10pmol/L，制备成工作液，将其在漩涡混匀仪上混匀；

RCR反应体系如表2所示；

表2PCR反应体系

PCR反应程序：

2、胶回收纯化

1)打开水浴锅，调至55℃～65℃；

2)电泳完成之后，可见光或者紫外光下(条带浓度偏弱用紫外)仔细切下含待回收DNA的凝胶，置1.5mLEP管中，称重；

3)每10mg重量的胶回收带加入10μL膜结合液，置65℃水浴，2-3分钟后将EP管取出，上下颠倒混匀，如果胶没有全部溶化，重复上述操作即可；

4)将柱子放在2mL收集管上，将溶化的凝胶液加于柱子上，室温下放置1分钟，16000g离心1分钟；

5)将收集管中的液体重新加到柱子上，放置1分钟，16000g离心1分钟，弃去收集管中液体，加入700μL膜洗脱液，16000g离心1分钟，弃去收集管中液体；

6)加入500μL膜洗脱液，16000g离心5分钟，弃去收集管中液体，空柱子16000g离心1.5分钟；

7)将柱子放于一新的1.5mL离心管上，在柱子的膜中央加入40μL ddH

3、连接表达载体

1)先将连接酶和载体从-20℃取出放置冰盒上解冻；

2)将PCR仪调为50℃。按照表3添加反应体系；

表3连接反应体系

3)将PCR管放入PCR仪，50℃反应20分钟。

4、热激法转化感受态

1)将制好的平板培养基从4℃取出，转化前1小时放在超净台上；

2)从-80℃取出制备分装好的感受态细胞，放在冰盒上4℃化冻，约30分钟；

3)将水浴锅调为45℃；

4)1.5mLEP管中每100μL感受态细胞约加入10μL连接产物；

5)4℃冰盒上放置30分钟；

6)42℃水浴锅内热激90s；

7)快速将离心管转移至冰盒上，4℃放置3分钟；

8)加入500μL SOC于离心管中，37℃，200rpm复苏45min；

9)6000rpm离心1min，在超净台取500μL弃掉，剩余的混匀，用涂布棒涂于平板培养基上，倒置放入培养箱培养。培养条件：37℃，16-18h。

5、测序

将过夜培养的平板挑取单克隆送测，分析测序结果，得到含有正确序列的质粒。

6、放大培养

1)将测序正确的质粒进行转化；

2)将过夜培养的平板挑取单克隆到相应抗性的培养基中放大培养，培养条件：培养温度：37℃，转速：250rpm；培养时间：16-18h。

7、质粒提取

1)将过夜培养的菌，6000rpm离心10min，弃上清；

2)加入菌液1/10倍体积的悬浮液，重新悬浮菌液；

3)加入相同体积的碱裂解液,上下轻轻颠倒，至液体变澄清，静止3min；

4)加入1.4倍体积的酸中和液，颠倒混匀；

5)6000rpm离心30min，将上清液过柱子纯化，用缓冲液洗脱；

6)将得到的质粒交给下游表达。

8、细胞培养与蛋白表达

使用293无血清CD培养基(货号SMM 293-TI)传代培养HEK293细胞，将目的蛋白表达质粒与转染试剂TF1混合后加入细胞中，转染后第1、3和5天分别添加293无血清加料液(货号:M293-SUPI-100)，细胞培养7天后进行蛋白纯化。

9、蛋白纯化

1)培养料液离心后，用滤器过滤去除剩余不溶物后使用亲和层析柱纯化目标蛋白；

2)金属螯合亲和层析纯化：将Ni-离子亲和层析柱使用上样缓冲液平衡后将培养液上清上样至层析柱，待杂蛋白流穿后使用咪唑梯度洗脱目标蛋白，将纯化后的目标蛋白进行换液后标定蛋白浓度并进行纯度检测。

1.3实验结果

1.3.1蛋白名称代号：22ZJY17-2，His-KLKB1-HEK293

序列特征：以SP1(SEQ ID NO.3)-His标签(SEQ ID NO.4)-蛋白酶裂解位点(SEQID NO.5)-KLKB1蛋白序列(SEQ ID NO.6)为序连接，组成序列1(SEQ ID NO.7)，具体序列见表4。

蛋白表达体系为293细胞表达体系，蛋白表达、纯化后电泳检测结果如图1所示，蛋白纯度为98.4％。

表4序列1

对比例1蛋白名称代号：22ZJY17-2，His-KLKB1-HEK293

序列特征：以SP1(SEQ ID NO.3)-KLKB1蛋白序列(SEQ ID NO.6)-蛋白酶裂解位点(SEQ ID NO.5)-His标签(SEQ ID NO.8)为序连接，组成序列2(SEQ ID NO.9)，具体序列见表5。

蛋白表达体系为293细胞表达体系，蛋白表达、纯化后电泳检测结果如图2所示，纯化后蛋白产量为0.1mg，纯度为81.8％。

表5序列2

对比例2蛋白名称代号：SP-KLKB1(376-638aa)-3C-10his-22ZJY17

序列特征：以SP2(SEQ ID NO.10)-KLKB1蛋白序列(SEQ ID NO.6)-蛋白酶裂解位点(SEQ ID NO.5)-His标签(SEQ ID NO.8)为序连接，组成序列3(SEQ ID NO.11)，具体序列见表6。

蛋白表达体系为293细胞表达体系，蛋白表达、纯化后电泳检测结果如图3所示，纯化后蛋白产量为0.25mg，纯度为82％。

表6序列3

对比例3蛋白名称代号：BSP-10His-3C-KLKB1(376-638aa)-22ZJY18-2

序列特征：以SP3(SEQ ID NO.12)-His标签(SEQ ID NO.4)-蛋白酶裂解位点(SEQID NO.5)-KLKB1蛋白序列(SEQ ID NO.6)为序连接，组成序列4(SEQ ID NO.13)，具体序列见表7。

蛋白表达体系为昆虫细胞表达体系，蛋白表达、纯化后电泳检测结果如图4所示，蛋白纯度为91.2％，产量为0.6mg。

表7序列4

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对比例4蛋白名称代号：BSP-10His-3C-KLKB1(376-638aa)-22ZJY18-2

序列特征：以SP3(SEQ ID NO.12)-KLKB1蛋白序列(SEQ ID NO.6)-蛋白酶裂解位点(SEQ ID NO.5)-His标签(SEQ ID NO.8)为序连接，组成序列5(SEQ ID NO.14)，具体序列见表8。

蛋白表达体系为昆虫细胞表达体系，蛋白表达、纯化后电泳检测结果如图5所示，蛋白纯度为79.9％，产量为0.08mg。

表8序列5

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上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。