一种解淀粉芽孢杆菌NTNK-3及其应用

技术领域

本发明涉及生物防治技术领域，具体地，涉及一种解淀粉芽孢杆菌NTNK-3及其应用。

背景技术

昆虫共生菌极其丰富，很多昆虫体内微生物与昆虫形成共生的关系，昆虫为体内共生菌提供营养物质，而昆虫体内共生菌可以为宿主提供营养素、维生素等很多营养物质，还能够协助宿主昆虫消化食物，调控宿主营养代谢，影响宿主肠道的形成，还可以帮助宿主抵御病原菌侵染等。在昆虫体内提取的共生菌可以为生活中多方面提供有价值的用途，在农业上，可以利用昆虫共生菌进行病、虫、草害防控，此外还有分解垃圾、抗菌、抗肿瘤、抗疟疾等多种作用。

植物病原真菌引起的植物病害显著降低了农作物产量及品质，对农作物安全生产造成严重影响，是农业生产中需要解决的难题之一。农田杂草生命力旺盛，与农作物争夺养分与空间，严重影响农作的生长，例如稗草Echinochloa crusgal li(L.)Beauv.、马塘Digitaria sanguinalis(L.)Scop.、狗尾草Setaria viridis(L.)Be auv.和反枝苋Amaranthus retroflexus L.等，它们是稻田、麦田、玉米地和果园等地的常见恶性杂草，有的杂草甚至因体内含有毒素，家畜食用后会引起中毒，例如菜园、果园中常见的反枝苋Amaranthus retroflexus L.，因而杂草也是农业安全生产的另一严重问题。在实际生产中常用化学杀菌剂、除草剂防治植物病害及杂草，而天然产物杀菌剂、除草剂与之相比具有环境污染小，可降解，不易产生耐药性等优点，微生物的次级代谢产物是研究和开发新的杀菌剂和除草剂的重要来源之一，具有安全有效的、无毒无污染作用。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种解淀粉芽孢杆菌NTNK-3及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)NTNK-3。

本发明的第二个目的是提供所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)NTNK-3和/或其发酵液的应用。

本发明的第三个目的是提供一种生防制剂。

本发明的第四个目的是提供所述的生防制剂的应用。

本发明的第五个目的是提供一种防治胶孢炭疽菌引起的植物病害和/或指状青霉引起的植物病害的方法。

本发明的第六个目的是提供一种抑制胶孢炭疽菌和/或指状青霉的方法。

本发明的第七个目的是提供一种抑制禾本科和/或苋科植物生长的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3，所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3已于2022年7月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为GDMCC No：62606。

所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3和/或其发酵液在以下中的任意一项或几种中的应用：

防治胶孢炭疽菌引起的植物病害和/或指状青霉引起的植物病害；

制备防治胶孢炭疽菌引起的植物病害和/或指状青霉引起的植物病害的制剂；

抑制胶孢炭疽菌和/或指状青霉；

制备抑制胶孢炭疽菌和/或指状青霉的制剂；

抑制禾本科和/或苋科植物生长；

制备抑制禾本科和/或苋科植物生长的制剂。

优选地，所述胶孢炭疽菌引起的植物病害为火龙果炭疽病；所述指状青霉引起的植物病害为柑橘绿霉病。

优选地，所述禾本科植物为稗草、马唐和/或狗尾草，所述苋科植物为反枝苋。

优选地，所述抑制禾本科和/或苋科植物生长为抑制稗草、马唐、狗尾草和/或反枝苋发芽、根和/或茎生长。

更优选地，所述抑制禾本科和/或苋科植物生长为抑制稗草、马唐和/或反枝苋发芽，抑制狗尾草和/或反枝苋的根和/或茎生长。

一种生防制剂，所述生防制剂中包含所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)NTNK-3和/或其发酵产物。

所述的生防制剂在以下中的任意一项或几种中的应用：

防治胶孢炭疽菌引起的植物病害和/或指状青霉引起的植物病害；

抑制胶孢炭疽菌和/或指状青霉；

抑制禾本科和/或苋科植物生长。

优选地，所述胶孢炭疽菌引起的植物病害为火龙果炭疽病；所述指状青霉引起的植物病害为柑橘绿霉病。

优选地，所述禾本科植物为稗草、马唐和/或狗尾草，所述苋科植物为反枝苋。

优选地，所述抑制禾本科和/或苋科植物生长为抑制稗草、马唐、狗尾草和/或反枝苋发芽、根和/或茎生长。

更优选地，所述抑制禾本科和/或苋科植物生长为抑制稗草、马唐和/或反枝苋发芽，抑制狗尾草和/或反枝苋的根和/或茎生长。

一种防治胶孢炭疽菌引起的植物病害和/或指状青霉引起的植物病害的方法，用所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3和/或其发酵产物进行防治。

优选地，所述胶孢炭疽菌引起的植物病害为火龙果炭疽病；所述指状青霉引起的植物病害为柑橘绿霉病。

一种抑制胶孢炭疽菌和/或指状青霉的方法，用所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)NTNK-3和/或其发酵产物进行抑制。

一种抑制禾本科和/或苋科植物生长的方法，用所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)NTNK-3和/或其发酵产物进行抑制。

优选地，所述禾本科植物为稗草、马唐和/或狗尾草，所述苋科植物为反枝苋。

优选地，所述所述抑制禾本科和/或苋科植物生长为抑制稗草、马唐、狗尾草和/或反枝苋发芽、根和/或茎生长。

更优选地，所述抑制禾本科和/或苋科植物生长为抑制稗草、马唐和/或反枝苋发芽，抑制狗尾草和/或反枝苋的根和/或茎生长。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌NTNK-3及其应用。解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)NTNK-3及其应用已于2022年7月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为GDMCC No：62606。该菌具有抑制植物病原真菌和杂草生长的作用，对引起火龙果炭疽病的胶孢炭疽菌和引起柑橘绿霉病的指状青霉有抑制作用；对稗草、马唐和反枝苋三种杂草的发芽抑制率分别高达82.93％、94.44％和94.87％，对狗尾草和反枝苋的根长抑制率分别为96.2％和91.84％，对狗尾草和反枝苋的茎长抑制率分别为92.19％、67.05％。本发明解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3来源于拟天牛科昆虫体内，对于环境无不良影响，且生产成本低，生产过程简单，不污染环境，适合于推广应用。该菌培养简单，易于保存和生产，发酵液既可以做杀菌剂，也可做除草剂，在农田植物病害及杂草生物防治中能够起到非常重要的作用，是一种具有良好开发前景的优效杀菌剂和除草剂。

附图说明

图1为来自昆虫拟天牛体内的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3在LB固体培养基上的菌落形态。

图2为基于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3的16S rDNA片段序列构建的系统发育树。

图3为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3发酵液对植物病原菌的抑制作用。其中A为火龙果炭疽菌在CK组的生长情况，B为火龙果炭疽菌与NTNK-3对峙生长情况，C为柑橘绿霉菌在CK组的生长情况，D为柑橘绿霉菌与NTNK-3对峙生长情况。

图4为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3发酵液对杂草发芽率影响的统计图。

图5为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3发酵液对杂草根长影响的统计图。

图6为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3发酵液对杂草茎长影响的统计图。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1菌株的分离、鉴定和保藏

一、实验方法

1、菌株的分离

供试菌株于2021年5月从广东省湛江市红树林自然保护区(东经109°40′～110°35′，北纬20°14′～21°35′)采集的拟天牛科昆虫虫体中分离培养得到。具体方法为：将采集的拟天牛科昆虫饥饿处理3d，将昆虫洗净后放置于平板，在无菌超净台上用消毒酒精将昆虫表面消毒3min，再用双氧水消毒5min，然后用无菌水清洗3次，用无菌研钵研磨。彻底研磨后吸取150μL研磨液到LB固体培养基上进行涂布，将涂布后的培养基封胶，置于28℃培养箱进行避光培养。培养3d左右，待单一菌落长出后挑取单一菌落到新的培养基继续分离纯化，待在新的培养基上菌落单一且菌落周围无污染时挑取单一菌落菌体到LB斜面试管中，培养3d后放入4℃冰箱中保存备用。由此获得一株细菌纯培养物，将该菌株命名为NTNK-3。

2、菌株的鉴定

将NTNK-3菌株接种于LB固体培养基上，恒温28℃培养3～5d，菌落直径可达15～20mm，菌落呈乳白色，表面较干燥，菌落边缘呈花瓣状褶皱(图1)。NTNK-3菌株接种于NA液体培养基中，于28℃，150r/min条件下振荡培养3～5d，所述NA液体培养基的配方为：950mL离子水中加入牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖2.5g，搅拌溶解后定容至1000mL，PH 7.0，121℃高压灭菌15min。

按照SteadyPure细菌基因组DNA提取试剂盒的方法提取菌株NTNK-3的基因组DNA，以细菌通用引物27F/1492R(27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')扩增NTNK-3菌株的16S rDNA片段，电泳测验有单一目标条带后测序。

测序结果经过Lasergene7中的SeqMan进行双向测序的DNA序列拼接，拼接完成后在NCBI中的BLAST进行检索对比其他已知序列，对比序列之后选取同源性在98％以上的基因序列下载其他序列的fasta格式文件，在MEGA 11软件中进行系统发育树的构建。

二、实验结果

所获序列与NCBI中的数据库序列进行BLAST同源性比对，与其亲缘关系较近的Bacillus amyloliquefaciens strain Lac19F(MH210892)序列相似性达100％，序列比对覆盖率达100％。确定NTNK-3菌株为解淀粉芽孢杆菌。NTNK-3菌株的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。NTNK-3菌株的系统发育树如图2所示。

将所述NTNK-3菌株命名为：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3，并于2022年7月7日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为：GDMCC No：62606，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。实施例2解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3发酵液对植物病原菌的抑制作用

一、实验方法

1、实验材料

供试病原真菌为火龙果炭疽病菌(胶孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides)及柑橘绿霉病菌(指状青霉Penicillium digitatum)。

2、实验方法

将实施例1的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3和供试植物病原真菌分别接到PDA固体培养基上，放置于28℃培养箱中培养3～4d。培养后，在无菌环境下，用直径为5mm的打孔器在培养基上打孔，分别取出解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、火龙果炭疽菌和柑橘绿霉菌的菌饼，将解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)NTNK-3分别与火龙果炭疽菌和柑橘绿霉菌进行对峙培养，具体为：

将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3和火龙果炭疽菌菌饼倒置放入PDA固体培养基的两侧，两菌饼相距4cm；将解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)NTNK-3和柑橘绿霉菌菌饼倒置放入PDA固体培养基的两侧，两菌饼相距4cm；两CK组分别为接种火龙果炭疽菌菌饼但不接种NTNK-3菌饼，和接种柑橘绿霉菌菌饼但不接种NTNK-3菌饼。

置于28℃培养箱中培养5d，记录火龙果炭疽菌、柑橘绿霉菌的直径，并计算抑菌率。每组实验重复三次。

抑菌率计算公式为：

二、实验结果

实验结果如图3所示，火龙果炭疽菌(图3B)及柑橘绿霉菌(图3D)的菌落生长直径显著小于CK组中的火龙果炭疽菌(图3A)和柑橘绿霉菌(图3C)菌落的生长直径(P<0.05)，说明解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3对火龙果炭疽病菌(胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides)及柑橘绿霉病菌(指状青霉Penicillium digitatum)的抑制作用很大，抑制率分别达到了87.5％，80.49％(表1)。表明解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3用于抑制胶孢炭疽菌引起的植物病害和指状青霉引起的植物病害。

表1芽孢杆菌NTNK-3对植物病原真菌的抑制率

注：同列数据中的不同小写字母代表在P＝0.05水平上差异显著。

实施例3制备解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3发酵液

将实施例1的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3接种于含有NA液体培养基250mL的锥形瓶中，于28℃，150r/min条件下振荡培养3～5d，培养得到的发酵液即为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3的发酵液，所述发酵液中含有解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3。所述NA液体培养基配方与实施例1相同。

实施例4解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3发酵液对杂草发芽率的抑制作用

一、实验方法

1、实验材料

供试杂草种子为稗草Echinochloa crusgalli(L.)Beauv.、马唐Digitariasanguinalis(L.)Scop.、反枝苋Amaranthus retroflexus L.和狗尾草Setaria viridis(L.)Beauv.。

2、实验方法

将实施例1的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3在NA液体培养基上培养3d。

实验组取稗草、马唐、反枝苋和狗尾草的种子各20粒，50℃温水浸泡30min。放入有滤纸的培养基上，在每个培养基加入2mL实施例3的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)NTNK-3发酵液保持湿度，放入27℃培养箱暗培养3d，测定稗草、马唐和反枝苋的种子萌发率。对照组用无菌水浸泡上述4种种子30min，用无菌水替换实施例3的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3发酵液，其他参数与实验组相同。每组重复3次。发芽率与抑制率计算公式如下：

二、实验结果

实验结果表明，实施例3的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3发酵液处理后，稗草、反枝苋和马唐三种杂草的发芽率显著低于CK组(P<0.05)，抑制率分别为82.93％，94.87％，94.44％(表2、图4)。实施例3的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)NTNK-3发酵液对狗尾草发芽率没有显著抑制作用。

表2解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3对杂草发芽率的抑制作用

注：表中同行数据后不同字母表示P＝0.05水平上差异显著。

实施例5解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3发酵液对杂草根、茎的抑制作用

一、实验方法

1、实验材料

供试杂草种子为稗草Echinochloa crusgalli(L.)Beauv.、马唐Digitariasanguinalis(L.)Scop.、反枝苋Amaranthus retroflexus L.和狗尾草Setaria viridis(L.)Beauv.。

2、实验方法

实验组为在培养皿中放置滤纸，然后挑选稗草、马唐、狗尾草和反枝苋种子各24粒(要求24粒杂草的发芽情况一致)，将挑选好的稗草、马唐、狗尾草和反枝苋种子分别放入有滤纸片的培养皿上。用移液枪分别加入2mL实施例3的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)NTNK-3发酵液，盖上皿盖进行保温培养。对照组为用清水替换发酵液，其他参数与实验组相同。每个处理重复3次，将各组处理好的培养基于28℃培养箱培养，光照比为14L：10D，相对湿度为80％。培养5d后测量稗草、马唐、狗尾草和反枝苋的根、茎长度，统计数据并计算根长抑制率和茎长抑制率。根长和茎长抑制率计算公式如下：

二、实验结果

实验结果表明，实施例3的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3发酵液对狗尾草以及反枝苋的根、茎生长均有抑制作用，对比对照组的根、茎生长长度，空白对照组与实验组的根长和茎长的生长长度有差异显著(P<0.05)。实施例3的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3发酵液对狗尾草根、茎的抑制率分别为96.2％、92.19，对反枝苋根、茎的抑制率分别为91.84％、67.05(表3、图5、图6)。实施例3的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3发酵液对稗草和马唐的根、茎生长并没有显著抑制作用。

表3解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NTNK-3对杂草根长、茎长的抑制作用

注：CK表示空白对照；表中同行数据后不同字母表示P＝0.05水平上差异显著。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。