一种从佛手中分离的查尔酮骈木脂素化合物及其抗非酒精性脂肪肝用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种从佛手中分离的新查尔酮骈木脂素化合物，以及该化合物的制备方法及其抗非酒精性脂肪肝用途。

背景技术

佛手(Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle)为芸香科(Rutaceae)柑橘属(Citrus L.)植物佛手的干燥果实，又名“佛手香橼”、“蜜罗柑”、“福寿橘”、“九爪木”、“佛手柑”、“五指橘”。佛手集药用、食用、观赏于一体，被称为“果中之仙品，世上之奇卉”。2002年，佛手被我国卫生部列入既是食品又是药品的物品名单。

佛手，性味辛、苦、温，入肝、脾、胃、肺经，有疏肝理气，和胃止痛，燥湿化痰之功效，适用于治疗肝郁气滞所致的胁痛、胸闷，脾胃气滞所致的脘腹胀满、纳呆胃痛、嗳气呕恶、咳嗽痰多、胸闷胸痛等病症。《本草纲目》记载：“治心下气痛”；《本草再新》曰：“治气舒肝”；《滇南本草》言：“补肝暖胃，和中行气”；《本草便读》言：“理气快膈，惟肝脾气滞者宜之”。因此，佛手在治疗肝脏疾病方面具有悠久的用药历史。现代研究发现，佛手具有保肝、降血脂、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抑菌等多种药理活性；佛手中含有黄酮、木脂素、香豆素、挥发油等多种化学成分。

发明内容

为进一步发掘佛手潜在的药用价值，本发明以药食两用植物——佛手作为研究对象，采用生物活性指导分离方法对佛手抗非酒精性脂肪肝活性部位进行分离纯化，从中得到一种新查尔酮骈木脂素化合物。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

从佛手中分离得到的结构如式Ⅰ所示的新查尔酮骈木脂素化合物：

化合物Ⅰ的化学名称：4-甲氧基-7-(5”',6”'-二甲基-呋喃-1”'-酮)-查尔酮-4',5'-骈-(4”,9”-二羟基-苯并呋喃)-木脂素。分子式：C

本发明的另一个目的是提供一种式Ⅰ所示的新查尔酮骈木脂素化合物的制备方法，包括如下步骤：

步骤(1)、将干燥的佛手果实粉碎，用85～100％乙醇加热回流提取3～5次，每次3～5小时，合并得到佛手总提取液；

步骤(2)、佛手总提取液在低温(50～55℃)真空条件下浓缩，得到干燥的佛手总提取物；

步骤(3)、将佛手总提取物均匀混悬于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，分别得到石油醚层、乙酸乙酯层、正丁醇层；

步骤(4)、乙酸乙酯层上硅胶柱，采用石油醚-乙酸乙酯洗脱系统进行梯度洗脱，得到5个馏分，分别为馏分A、B、C、D、E；

步骤(5)、馏分D上硅胶柱，采用石油醚-乙酸乙酯洗脱系统进行梯度洗脱，得到4个亚馏分，分别为亚馏分D-1、D-2、D-3、D-4；

步骤(6)、亚馏分D-2上Sephadex LH-20凝胶柱，采用二氯甲烷:甲醇体积比＝1:1进行洗脱，得到3个次馏分，分别为次馏分D-2-1、D-2-2、D-2-3；

步骤(7)、次馏分D-2-2上ToyopearlHW-40C凝胶柱，采用95％甲醇洗脱，得到小馏分D-2-2-1、D-2-2-2；

步骤(8)、小馏分D-2-2-2进行制备液相分离，得到化合物Ⅰ。

步骤(1)中，将干燥的佛手果实粉碎至60～100目。料液比为1:3～1:3.5kg/L或g/mL。

步骤(2)中，利用旋转蒸发仪，对佛手总提取液进行低温(50-55℃)真空浓缩。

步骤(3)中，佛手总提取物和水的体积比为1:1～1:2。

步骤(4)中，所述的硅胶柱的填料为100～200目硅胶。

所述的石油醚-乙酸乙酯洗脱系统中，石油醚和乙酸乙酯的体积比为30:1→1:1。

步骤(5)中，所述的硅胶柱的填料为200～300目硅胶。

所述的石油醚-乙酸乙酯洗脱系统中，石油醚和乙酸乙酯的体积比为8:1→4:1。

步骤(8)中，制备液相分离的条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-A柱(250×20mm,5μm)，流动相：25～35％甲醇，吸收波长：200～350nm，流速：2～4mL/min。

发明人采用生化法检测大鼠血脂指标(TC、TG、HDL-C、LDL-C)和大鼠肝脏功能指标(AST、ALT、γ-GT、ALP、APN)，分析并评价该新查尔酮骈木脂素化合物抗非酒精性脂肪肝作用，首次发现该化合物Ⅰ可有效降低非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型大鼠血清中TC、TG、LDL-C、AST、ALT、γ-GT、ALP含量，升高HDL-C和APN含量。

因此，本发明的另一个目的是提供式Ⅰ所示的新查尔酮骈木脂素化合物在制备抗非酒精性脂肪肝药物中的应用。

本发明的另一个目的是提供一种抗非酒精性脂肪肝组合物，以本发明所述的新查尔酮骈木脂素化合物为有效成分，与药学上可接受的辅料制成药学上可接受的剂型。

所述的剂型为胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂。

本发明的有益效果：

本发明采用85-100％乙醇对佛手进行加热回流提取，利用生物活性指导分离的方法从佛手抗非酒精性脂肪肝活性部位中分离得到一种新查尔酮骈木脂素化合物。该化合物结构新颖，分离方法简便快捷、易于操作；以佛手作为研究对象，该植物资源丰富，原料易得。

本发明首次公开了化合物Ⅰ在制备抗非酒精性脂肪肝药物方面的用途。

附图说明

图1是本发明新查尔酮骈木脂素化合物的制备流程图。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。

实施例1

化合物Ⅰ的制备方法如图1所示，步骤如下：

步骤(1)、将干燥的佛手果实(9.5千克)粉碎(60目)，用95％乙醇(30L)加热回流提取3次，每次4小时，合并得到佛手总提取液；

步骤(2)、利用旋转蒸发仪，步骤(1)得到的佛手总提取液在低温(50℃)真空条件下浓缩干燥，得到干燥的佛手总提取物(1.7千克)；

步骤(3)、将步骤(2)得到的佛手总提取物均匀混悬于水中(佛手总提取物和水的体积比＝1:1.5)，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，分别得到石油醚层(143.4克)、乙酸乙酯层(300.8克)、正丁醇层(512.5克)；

步骤(4)、采用生物活性指导分离的方法，利用生化检测法对步骤(3)得到的3个不同萃取层进行抗非酒精性脂肪肝活性筛选，确定乙酸乙酯层为活性部位；

步骤(5)、步骤(4)得到的抗非酒精性脂肪肝活性部位—乙酸乙酯层上硅胶(100～200目)柱，用石油醚-乙酸乙酯洗脱系统(石油醚:乙酸乙酯＝30:1→15:1→8:1→4:1→1:1，V/V)进行梯度洗脱，得到5个馏分，分别记为馏分A(16.8克)、B(38.2克)、C(57.6克)、D(43.5克)、E(26.7克)；

步骤(6)、采用生物活性指导分离的方法对步骤(5)所得的5个馏分进行抗非酒精性脂肪肝活性筛选，结果表明馏分D具有显著的抗非酒精性脂肪肝活性。

馏分D上硅胶(200～300目)柱，用石油醚-乙酸乙酯洗脱系统(石油醚:乙酸乙酯＝8:1→6:1→5:1→4:1，V/V)进行梯度洗脱，得到4个亚馏分，分别记为亚馏分D-1(9.3克)、D-2(11.5克)、D-3(10.7克)、D-4(8.7克)；

步骤(7)、步骤(6)得到的亚馏分D-2上Sephadex LH-20凝胶柱，用二氯甲烷:甲醇＝1:1(V/V)洗脱，得到3个次馏分，分别记为次馏分D-2-1(2.3克)、D-2-2(3.5克)、D-2-3(3.1克)；

步骤(8)、步骤(7)得到的次馏分D-2-2上ToyopearlHW-40C凝胶柱，用95％甲醇洗脱，得到小馏分D-2-2-1(1.1克)、D-2-2-2(1.5克)；

步骤(9)、步骤(8)得到的小馏分D-2-2-2进行制备液相分离，色谱柱：YMC-PackODS-A柱(250×20mm,5μm)，流动相：28％甲醇，吸收波长：210nm，流速：2.5mL/min，经多次制备和纯化，最终得到化合物Ⅰ(0.27克)。

化合物Ⅰ为浅黄色固体，HR-ESI-MS m/z 533.1573[M+Na]

化合物Ⅰ的

根据化合物Ⅰ的波谱数据和HMBC偶联相关信息，经SciFinder检索，鉴定化合物Ⅰ为一个新查尔酮骈木脂素化合物。化合物Ⅰ的化学名称：4-甲氧基-7-(5”',6”'-二甲基-呋喃-1”'-酮)-查尔酮-4',5'-骈-(4”,9”-二羟基-苯并呋喃)-木脂素。

表1.化合物Ⅰ的

实施例2

化合物Ⅰ抗非酒精性脂肪肝活性测定

2.1实验动物、试剂和仪器

SPF级SD大鼠、雌雄各半、体重180～220g、普通饲料、高脂饲料、辛伐他汀、水合氯酸、PBS、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)、大鼠碱性磷酸酶(ALP)、血清脂联素(APN)、全自动生化分析仪、离心机、酶标仪等。

2.2动物分组

将48只SD大鼠随机分为6组：正常对照组、模型组、阳性对照组、化合物Ⅰ高剂量组、化合物Ⅰ中剂量组、化合物Ⅰ低剂量组，每组8只，雌雄各半，分笼饲养，先正常饲养1周后开始造模。每周称量体重。

2.3造模与给药

正常对照组投喂普通饲料，其他5组投喂高脂饲料连续6周。第4周开始对阳性对照组、化合物Ⅰ高剂量组、化合物Ⅰ中剂量组、化合物Ⅰ低剂量组大鼠进行灌胃，分别给予：辛伐他汀(7.2mg/kg)，化合物Ⅰ高剂量(0.5g/kg)、中剂量(0.1g/kg)、低剂量(0.05g/kg)。正常对照组和模型组灌胃等量的蒸馈水。实验结束前天晚上禁食不禁水。

2.4血清样本制备

大鼠用10％水合氯醛(0.3mL/100g)麻醉后，腹主动脉采血，分离血清(3000r，15min)，利用全自动生化分析仪检测血清生化指标(TC、TG、HDL-C、LDL-C、AST、ALT、γ-GT、ALP、APN)、以及用大鼠脂联素试剂盒ELISA检测APN指标。

2.5新化合物Ⅰ抗非酒精性脂肪肝活性筛选结果

结果见表2、表3。与正常对照组比较，模型组血清中TC、TG、LDL-C、AST、ALT、γ-GT、ALP均显著升高(P＜0.01)，而HDL-C和APN显著降低(P＜0.05或P＜0.01)；与模型组比较，辛伐他汀能显著降低血清中TC、TG、LDL-C、AST、ALT、γ-GT、ALP并升高HDL-C和APN(P＜0.05或P＜0.01)。与模型组比较，化合物Ⅰ高、中、低剂量均能显著降低血清中TC、TG、LDL-C、AST、ALT、γ-GT、ALP，并升高HDL-C和APN(P＜0.05或P＜0.01)，具有统计学意义。

表2.化合物Ⅰ对各组大鼠血脂指标的影响(均数±标准差，n＝6)

注：与正常对照组比较：

表3.化合物Ⅰ对各组大鼠肝脏功能指标的影响(均数±标准差，n＝6)

注：与正常对照组比较：

综上所述，化合物Ⅰ的高、中、低剂量均可有效降低非酒精性脂肪肝模型大鼠血清中TC、TG、LDL-C、AST、ALT、γ-GT、ALP含量，升高HDL-C和APN含量。因此，化合物Ⅰ具有显著的抗非酒精性脂肪肝活性，这对于从佛手中开发出新型抗非酒精性脂肪肝药物具有重要的科学意义。