M1区神经元活性抑制剂在制备缺血性脑卒中防治药物中的应用

技术领域

本发明属于脑卒中治疗技术领域，具体涉及M1区神经元活性抑制剂在制备缺血性脑卒中防治药物中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

缺血性脑卒中由于脑供血不足引起能量代谢障碍，细胞膜去极化、突触前兴奋性递质(如谷氨酸和天冬氨酸)大量释放和离子失衡，导致神经功能损伤。缺血性脑卒中患者经过急性期康复治疗，恢复期后进入并发症期，此时期多数患者具有不同程度的运动、认知和吞咽等障碍。因此，针对缺血性脑卒中后遗留的神经功能障碍的康复治疗研究成为中枢神经系统(Central nervous system，CNS)研究领域关注的焦点。

化学遗传学是一种通过改造生物大分子物质，使其只接受外源性配体信号的方法。基于G蛋白偶联受体改造的只由特定药物激活的受体(designer receptorsexclusively activated by designer drugs，DREADDs)技术是目前应用最广泛的化学遗传学技术。通过应用选择性配体，氯氮平N-氧化物(clozapine-N-oxide，CNO)可以刺激或抑制谷氨酸能、γ-氨基丁酸或多巴胺能神经元的某些群体。在神经元中，CNO诱导人M3毒蕈碱受体(human M3 muscarinic receptor,hM3Dq)诱导神经元去极化，增强神经元的兴奋性，即促使神经元的放电活动。而CNO诱导人M4毒蕈碱受体可促进神经元超极化，抑制神经元的兴奋性。

研究发现，在急性脑缺血动物模型中利用谷氨酸能神经元特异性启动子(CaMKIIα)驱动的DREADDs工具(CaMKIIα-hM3Dq)选择性激活M1区兴奋性神经元(前脑谷氨酸能神经元)，结果发现CaMKIIα-hM3Dq处理后可减轻脑缺血大鼠梗死面积，改善线粒体功能障碍和认知功能障碍。Wen-Yuan Ling等在脑出血动物模型中发现激活M1区谷氨酸能神经元能改善小鼠行为和认知缺陷。在转基因小鼠hM4Di-TG(其中抑制性hM4Di-DREADD的表达主要局限于前脑兴奋性神经元)脑缺血模型中，与对照组小鼠相比，在脑缺血前或再灌注后接受CNO处理的hM4Di-TG小鼠的预后显著改善，结果提示特异性抑制脑缺血前脑兴奋性神经元的激活可促进其神经功能改善。M1区有两类互相拮抗的神经元：一类是谷氨酸能兴奋性神经元，一类是GABA能抑制性中间神经元，结合前期的一些研究，发明人推测不同神经元的兴奋状态会影响脑卒中预后。因此本研究中首先明确M1区谷氨酸能兴奋性神经元和GABA能抑制性中间神经元的兴奋状态，然后探讨神经元的兴奋性与缺血性脑卒中神经功能障碍的关系。

细胞外囊泡(Extracellular vesicles，EVs)是一种新的细胞间通讯方式。EVs是由细胞自主分泌的具有双层膜结构的异质性囊泡状小体。EVs富含蛋白质、脂质和核酸(包括信使RNA、微小RNA(microRNA，miRNA)和长链非编码RNA和DNA等)等多种生物活性物质。EVs在正常和疾病状态中通过在细胞之间传递遗传物质、蛋白质和脂质等发挥作用。在CNS中，EVs可从小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经元等细胞类型中释放出来，并被认为在CNS的各种生理过程中有助于神经元-胶质细胞之间的交流。体外培养的神经元释放EVs可被小胶质细胞摄入。神经元来源的EVs中携带的miR-21-5p促进小胶质细胞激活，抑制神经突起的生长。相反，另一项研究发现，神经元来源的EVs在体内和体外通过抑制促炎型小胶质细胞和A1型星形胶质细胞的活化促进功能恢复。神经元来源的EVs可以被小胶质细胞摄取并抑制脂多糖诱导的小胶质细胞活化。可见，神经元来源的EVs在神经元和胶质细胞之间的信息交流中发挥着重要作用。

研究表明，EVs的释放是对神经递质信号的反应，因此脑内EVs释放水平和活动程度由神经元电变化(动作电位或者兴奋)控制。例如，神经元去极化(兴奋)可促进EVs分泌，释放的EVs富含miRNA，后者促进突触可塑性。神经元激活后动作电位抵达轴突末梢，诱导谷氨酸的释放，后者作用于少突胶质细胞的谷氨酸受体，继而释放EVs。研究表明脑卒中后谷氨酸能突触内的活性增加，诱导EVs释放，EVs优先与相邻神经元结合，促进神经元之间的信息传递。脑卒中后神经元激活释放的EVs是否影响炎症反应和神经功能障碍目前尚不清楚。

发明内容

为了证实M1神经激活释放的EVs与缺血性脑卒中诱导的炎症反应具有相关性，本发明设计了如下验证实验：

(1)本发明采用线栓法建立C57BL/6小鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebralartery occlusion，MCAO)模型模拟人类缺血性脑卒中。在MCAO小鼠模型构建前2周，利用脑立体定位注射技术在M1区注射腺相关病毒：AAV9-hSyn-HA-hM3D(Gq)-IRES-mCitrine(hM3Dq)和AAV9-hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine(hM4Di)。实验分为4组：hM3Dq+MCAO+Vehicle组、hM3Dq+MCAO+CNO组、hM4Di+MCAO+Vehicle组和hM4Di+MCAO+CNO组。发现以下实验结果：利用hM4Di+CNO抑制M1区神经元激活可降低MCAO小鼠脑梗死面积和细胞凋亡，抑制小胶质细胞/巨噬细胞激活，改善MCAO小鼠的神经功能缺损体征，增强前肢肌肉力量以及提高感觉运动功能及协调性。然而利用hM3Dq+CNO促进M1区神经元激活并不影响MCAO小鼠脑梗死面积、细胞凋亡、小胶质细胞/巨噬细胞激活和神经功能异常。

(2)利用PC12细胞构建体外神经元“缺血再灌注”损伤模型即氧糖剥夺/复氧(Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation，OGD/R)模型，并利用超速离心法提取PC12细胞上清中的EVs。结果发现，OGD/R处理可上调PC12细胞内[Ca

上述研究结论提示了，抑制M1区神经元活性有望预防缺血性脑卒中引发的脑梗死和细胞凋亡、改善缺血性脑卒中引发的炎症反应及神经功能障碍，提高患者运动能力。另外，M1区域神经元释放的EVs可能是调控缺血性脑卒中后炎症反应的关键递质，相应的，上述EVs的拮抗剂有望作为缺血性脑卒中后炎症反应的活性治疗药物。

基于上述研究结论，本发明提供如下的技术方案：

第一方面，M1区神经元活性抑制剂在制备缺血性脑卒中防治药物中的应用。

所述M1区神经元活性抑制剂包括但不限于能够降低受试者脑部M1区脑神经元活性的实体化合物、氨基酸类、核酸类成分或其结合；所述核酸类成分包括基于基因工程方式降低M1区脑神经元活性的相关试剂，如质粒、慢病毒、腺病毒等。

所述实体化合物的具体实例如1-羟基咪达唑仑、苯巴比妥、苯妥英钠等，可通过注射或靶向基团修饰等方式定向作用于M1区，而脑部M1区定位坐标可根据本领域常规理解，如Brodmann分区法，即中央前回和中央旁小叶前部的4区和6区，实际操作中可能需要通过手工测量方式或脑电图的定位帽进行定位。

本发明提供的一种实施方式中，采用腺病毒感染+CNO注射的方式实现M1区脑神经元活性的抑制，即所述M1区神经元活性抑制剂为含有hM4Di人工受体的腺病毒及CNO；具体操作如下：受试者脑部M1区定位注射hM4Di人工受体感染一段时间后，再进行CNO注射实现M1区脑神经元活性抑制。

所述缺血性脑卒中防治药物为用于预防、改善或治疗缺血性脑卒中及并发症的药物，所述缺血性脑卒中包括脑梗死，所述并发症包括但不限于脑部炎症反应、神经功能障碍、运动功能障碍等。

第二方面，提供M1区神经元细胞外囊泡拮抗剂在制备缺血性脑卒中炎症反应防治药物中的应用。

上述应用中，所述M1区神经元为缺血性脑卒中患者脑部神经元细胞，所述细胞外囊泡拮抗剂包括至少以下两种：(1)减少M1区神经元细胞外囊泡分泌的成分；(2)小胶质细胞亲和性成分，所述成分能够与上述细胞外囊泡竞争性结合小胶质细胞的相关物质，代替该细胞外囊泡被小胶质细胞摄入，从而抑制小胶质细胞炎症反应的发生。

第三方面，提供一种激活神经元的体外造模方法，所述方法包括对神经细胞进行体外氧糖剥夺/复氧操作。

优选的，所述神经细胞为PC12细胞，所述造模方法如下：将PC12细胞培养至细胞密度达到60～80％，更换RPMI 1640无糖培养基，并将细胞转移至1％O

第四方面，提供一种胶质细胞炎症模型造模方法，所述方法包括如下步骤，获取上述体外氧糖剥夺/复氧处理的神经元细胞，分离所述神经元细胞的细胞外囊泡，采用所述囊泡处理小胶质细胞即得。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为缺血性脑卒中诱导脑梗死实验结果；

图1(a)为Sham组、MCAO组利用激光散斑血流成像系统检测MCAO后6h脑血流量结果；

图1(b)为Sham组、MCAO组脑梗死面积检测结果，数据表示为Mean±SD，*P<0.05；

图2为MCAO组小鼠神经功能检测结果；

图2(a)为MCAO后24h mNSS评分结果；

图2(b)为MCAO后24h负趋地性实验结果；

图2(c)为MCAO后24h的Kondziella翻转网实验结果；

图2(d)为MCAO前后网格爬行测试结果；

图2中数据表示为Mean±SD，**P<0.01；

图3为MCAO小鼠造模24h后脑M1区小胶质细胞/巨噬细胞变化情况；

Iba-1(绿色)标记小胶质细胞/巨噬细胞，比例尺＝25μm；数据表示为Mean±SD，***P<0.001；

图4为MCAO小鼠M1区Iba-1，IL-1β，TNF-α和Arg-1蛋白水平检测结果；

其中，左图为蛋白条带电泳图，右图为蛋白水平检测结果，数据表示为Mean±SD，*P<0.05；

图5为MCAO小鼠脑部神经元状况；

图5(a)为基于Western blot检测M1区c-Fos蛋白水平，上图为蛋白条带图，下图为统计结果；

图5(b)为基于免疫组化检测M1区c-Fos

图6为病毒感染组小鼠缺血性脑卒中后M1区神经元活性；

图6(a)为hM3Dq、hM4Di病毒感染组小鼠M1区神经元中c-Fos电泳条带图(左)及表达量(右)；

图6(b)为免疫组化染色检测M1区c-Fos表达结果；数据表示为Mean±SD；*P<0.05，**P<0.01。

图7为病毒感染组小鼠缺血性脑卒中后神经功能障碍评估结果；

其中，图7(a-d)依次为各组小鼠MCAO后24h进行mNSS评分(a)、负趋地性实验(b)、Kondziella翻转网实验结果(c)及前网格爬行(d)训练结果；数据表示为Mean±SD；*P<0.05，**P<0.01。

图8为病毒感染组小鼠缺血性脑卒中后脑梗死面积结果；数据表示为Mean±SD，**P<0.01(t-test)。

图9为病毒感染组小鼠缺血性脑卒中后M1区小胶质细胞/巨噬细胞的激活情况；

其中，图9(a)为hM3Dq注射组中免疫荧光(左)和统计结果(右)；

图9(b)为hM4Di注射组中免疫荧光(左)和统计结果(右)；比例尺＝25μm；

图10为病毒感染组小鼠缺血性脑卒中后M1区脑组织炎症反应结果；

其中，图10(a)为hM3Dq注射组中Iba-1,IL-1β,TNF-α和Arg-1的电泳条带(左)及表达结果(右)；

图10(b)为hM4Di注射组中Iba-1,IL-1β,TNF-α和Arg-1的电泳条带(左)及表达结果(右)；数据表示为Mean±SD，*P<0.05，**P<0.01。

图11为OGD/R模型中神经元激活情况检测结果；

其中，图11(a)为PC12细胞内[Ca

图11(b)为OGD/R处理后PC12细胞中c-Fos的表达；数据表示为Mean±SD，*P<0.05。

图12为Nor-N-EVs和OGD-N-EVs鉴定结果；

其中，图12(a)为Nor-N-EVs和OGD-N-EVs的电镜检测结果；

图12(b)为纳米颗粒示踪分析Nor-N-EVs和OGD-N-EVs的大小；

图12(c)为Western blot检测Nor-N-EVs和OGD-N-EVs标记蛋白(CD9和CD63)和阴性标记蛋白(Calnexin)结果。

图13为免疫荧光观察小胶质细胞及BV2细胞对EVs的摄取情况；

Iba-1标记原代小胶质细胞(红色)，比例尺＝50μm。

图14为EVs处理对炎症的诱导作用；

其中，图14(a)为Nor-N-EVs和OGD-N-EVs孵育BV2细胞后，细胞中炎症因子的IL-1β、Arg-1的条带图(上)及表达结果(下)；

图14(b)为Nor-N-EVs和OGD-N-EVs孵育原代小胶质细胞后，细胞中炎症因子的IL-1β、Arg-1的条带图(上)及表达结果(下)；数据表示为Mean±SD，*P<0.05。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

术语解释：

MCAO模型：MCAO是middle cerebral artery occlusion的缩写形式，中文意思为大脑中动脉栓塞，将缝合线引入颈内动脉(ICA)或经横断的颈外动脉(ECA)，并收紧缝合线直到其中断向MCA的血液供应，用于模拟缺血、缺氧后的生理状态，是用于小鼠和大鼠的常用脑卒中模型。

OGD/R：oxygen-glucose deprivation/reperfusion，缺氧缺糖/再灌注，用于模拟在体脑缺血模型，又称离体缺血模型。

mNSS评分：神经功能缺损评分，用于对脑损伤并发症表现进行评估，评分越低表示功能越健全，0分表示完全健全的大鼠。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

具体实施方式

一、研究方法

1.MCAO模型：本研究利用线栓法制作小鼠缺血性脑卒中模型，参考相关文献并略作修改，具体造模过程简述如下：选取C57BL/6(21-25g)雄性小鼠，用异氟烷(5％诱导麻醉，1％维持麻醉)麻醉后，依次分离右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。微型动脉夹夹闭颈总动脉(远头端)和颈内动脉(近头端)，在近头端用4-0手术线结扎颈外动脉，并用电凝离断颈外动脉。用显微剪在颈外动脉处剪一个小口，从此处将无菌线栓(瑞沃德，型号：MSMC21B120PK50)插入颈内动脉至黑色标记达到颈外血管和颈内血管分叉处停止，并在分叉处用4-0手术线结扎。取掉微型动脉夹，进行缝合。缺血2h后，轻轻地抽出线栓以允许再灌注。再灌注24h后，进行后续研究。除了插入线栓之外，假手术(Sham)组小鼠经历了相同的过程。

2.小鼠M1区脑立体定向注射

病毒注射后2周即可在小鼠M1区稳定表达。按照本实验设计，选取C57BL/6(14-17g)雄性小鼠注射病毒后2周构建MCAO模型。

将AAV9-hSyn-HA-hM3D(Gq)-IRES-mCitrine(hM3Dq)和AAV9-hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine(hM4Di)遗传学工具病毒按照实验设计不同分组处理措施注射至右侧M1区。M1区坐标：前后部(anteroposterior,AP)距前囟+1.0mm,中间外侧(mediolateral,ML)+1.5mm，背腹侧(dorsoventral,DV)-1.0mm。本课题所有定位坐标均以前囟为原点，参考Franklin和Paxino制定的小鼠脑图谱。具体操作简述如下：首先使用异氟烷(5％诱导麻醉，1％维持麻醉)对小鼠进行麻醉后，剪开小鼠头部皮肤暴露前囟位置，根据小鼠脑立体定位图谱，确定M1区的注射坐标，hM3Dq和hM4Di注射量为2×10

3.腹腔注射

病毒组小鼠在MCAO前3天经腹腔注射氯氮平N-氧化物CNO(1mg/kg)，对照组注射相同剂量的溶剂(每24h一次，共计3次)，MCAO前30min第4次注射CNO或Vehicle，MCAO后23.5h第5次注射CNO或Vehicle。

4.检测脑梗死比率

将不同分组的完整脑组织放置在-20℃冰箱中冷冻30min，结束后沿冠状面进行切片，共5片。将脑片浸泡在2％2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride monohydrate,TTC)溶液中，37℃恒温箱避光孵育20min。结束后，按照顺序依次排列并拍照，利用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分析梗死面积(TTC与正常组织中的脱氢酶反应而呈红色，而缺血组织内脱氢酶活性下降，反应受限，故呈苍白)。梗死面积计算公式：梗死面积％＝(左侧正常脑组织面积-右侧正常脑组织面积)/左侧正常脑组织面积×100％。

5.脑血流量检测

将MCAO组小鼠在缺血再灌注15min后，用异氟烷麻醉，剪开头部皮肤，暴露完整颅骨，放入激光多普勒仪的实验操作台上。利用激光散斑成像系统进行图片采集。Sham组小鼠进行同样的操作。

6.EVs的获取

6.1正常培养的PC12细胞来源的EVs(Nor-N-EVs)的提取

采用超高速离心法获取EVs-free FBS，具体操作如下，在4℃条件下100000g离心18h。收集上清，并用0.22μm滤器过滤上清获得无菌的EVs-free FBS，用于后续实验。

(1)PC12细胞密度达到70％左右后，弃去培养基，用无菌PBS缓冲液清洗三次后，更换含10％ EVs-free FBS的RPMI 1640完全培养基继续培养12h。收集培养基。

(2)在4℃下通过差速离心分离Nor-N-EVs，如下所示：300g离心10min，收集上清。2000g离心10min，收集上清。10000g离心30min，收集上清。100000g离心70min，最后EVs沉淀重新悬浮在PBS缓冲液中获得Nor-N-EVs并储存在-80℃。

6.2OGD/R处理的PC12细胞来源的EVs(OGD-N-EVs)的获取

(1)PC12细胞密度达到70％左右后，更换RPMI 1640无糖培养基，并将细胞转移至1％O

(2)在4℃下通过差速离心分离OGD-N-EVs，如下所示：300g离心10min，收集上清。2000g离心10min，收集上清。10000g离心30min，收集上清。100000g离心70min，弃上清收集EVs沉淀，用PBS缓冲液重悬沉淀获得OGD-N-EVs并储存在-80℃。

7.EVs的鉴定

(1)利用透射形电镜鉴定EVs形态。取8μL EVs悬液滴至载体铜网(220目)上，静置2min，用滤纸吸去铜网外侧多余样品，加入8μL 1％的磷钨酸负染液滴于铜网上，室温复染2min，再用滤纸小吸去多余染液，铜网放置在白炽灯下晾晒10min。透射电镜下观察并采集照片。

(2)利用Western blot鉴定EVs标记蛋白CD9和CD63的表达。

(3)利用纳米颗粒示踪分析EVs的大小。

8.荧光标记EVs

(1)将4μL PKH67染料与1mL稀释液C混合配置新鲜的PKH67溶液。

(2)将1mL Nor-N-EVs和OGD-N-EVs溶液分别与1mL PKH67溶液混合共孵育5min后，加入2mL无EVs的FBS孵育终止反应。

(3)终止后的混合液置于4℃超速离心机中100000g离心70min。弃上清，用PBS缓冲液洗涤一次，沉淀用200μL PBS缓冲液重悬，获得PKH67标记的Nor-N-EVs和OGD-N-EVs保存于-80℃备用。

9.RNA的提取和实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)

用TRIzol法裂解细胞和组织提取总RNA。qRT-PCR反应在Bio-rad IQ5实时定量PCR系统进行。

10.免疫荧光染色：常规细胞爬片和石蜡、冰冻切片荧光染色。

11.行为学检测:神经功能缺损评分(mNSS评分)、负趋地性实验、Kondziella翻转网实验和网格爬行实验

12.western blot分析：EVs、细胞或同侧皮质在含有蛋白酶/磷酸酶抑制剂和PMSF的RIPA缓冲液中均匀化15min后，13800g离心10min(4℃)。使用BCA蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度。利用ECL试剂盒产生化学发光信号，然后利用Tanon成像系统进行检测。

二、研究结果

1.缺血性脑卒中诱导脑梗死

在实验性缺血性脑卒中模型中，大鼠和小鼠的MCAO模型是最常见的模型，该模型侵入性小，可以受控的实现永久性和短暂性缺血。本研究使用线栓法对小鼠右侧大脑中动脉进行2h的梗塞，梗塞结束后取出线栓，缝合伤口。再灌注6h后检测脑血流，结果显示，与Sham组相比，MCAO组小鼠脑血流量明显减少(图1a)。缺血再灌注24h后检测脑梗死面积，TTC结果显示，与Sham组相比，MCAO组小鼠脑梗死面积明显增加(图1b)。以上结果提示MCAO模型建立成功。

2.缺血性脑卒中诱导神经功能障碍

本实施例通过采用mNSS评分、负趋地性实验、Kondziella翻转网实验和网格爬行实验对小鼠行为学进行评价。mNSS评分结果显示，与Sham组相比，MCAO组小鼠mNSS评分显著升高(2(a))。负趋地性实验结果显示，与Sham组相比，MCAO组小鼠潜伏期明显增加(2(b))。Kondziella翻转网实验结果显示，与Sham组相比，MCAO组小鼠倒挂时间明显减少(2(c))。网格爬行实验结果显示，与Sham组相比，MCAO组小鼠脚步失误明显增多(2(d))。以上结果表明，缺血性脑卒中诱导小鼠神经功能缺损严重，前肢肌肉力量下降以及感觉运动功能及协调性降低。

3.缺血性脑卒中诱导小胶质细胞/巨噬细胞激活

为了探究MCAO对炎症反应的影响，利用免疫荧光染色观察MCAO后24h损伤侧皮层M1区小胶质细胞/巨噬细胞的激活情况。结果如图3，Sham组只有少量的Iba-1

4.缺血性脑卒中诱导炎症反应

本实施例通过Western blot检测MCAO后M1区炎症因子Iba-1，IL-1β，TNF-α和Arg-1蛋白水平，如图4，与Sham组相比，MCAO组M1区Iba-1表达增加，促炎因子(IL-1β和TNF-α)表达增加，抑炎因子(Arg-1)表达降低(图4)。以上结果说明，缺血性脑卒中诱导小胶质细胞/巨噬细胞激活，引起神经炎症反应。

5.缺血性脑卒中诱导神经元激活

研究表明，在出血性脑卒中动物模型中激活M1区谷氨酸能神经元可减轻脑出血引起的认知行为缺陷。在缺血性脑卒中动物模型中选择性激活M1区谷氨酸能神经元促进缺血性卒中后功能恢复。在抑制前脑兴奋性神经元的脑缺血模型中，抑制其兴奋性可明显改善小鼠预后。可见，神经元的兴奋性在脑卒中动物模型的病理过程中发挥重要作用。因此，本实验首先探究MCAO后M1区神经元是否激活以及哪类神经元激活。然而，由于电生理记录的基本局限性，包括该技术的侵入性，需要在每个感兴趣的部位放置(可能是几个)电极，以及从单个细胞类型选择性记录的困难，出现了检测神经元激活的替代方法。目前有两种较为成熟的在细胞水平判断神经元激活的方法：即刻早期基因(最重要的Cellular oncogenefos，c-Fos)和基因编码的钙指示剂(最重要的GCaMP6)。本研究选择c-Fos的表达水平反应神经元激活情况。Western blot检测MCAO后24h损伤侧皮层M1区c-Fos的表达水平。结果显示，与Sham组相比，MCAO组M1区c-Fos的表达显著升高(图5a)。免疫组化染色观察MCAO后24h损伤侧皮层M1区c-Fos表达情况。结果显示，与Sham组相比，MCAO组M1区c-Fos+细胞数明显增加(图5b)。

以上结果说明，缺血性脑卒中诱导神经元激活。

6.抑制M1区神经元激活降低缺血性脑卒中后c-Fos的表达

本实施例对M1区神经元进行深入研究主要有两个原因，其一是M1区在控制躯体运动中发挥重要作用，挽救M1区神经元的功能对于缺血性脑卒中功能康复是至关重要的。其二是M1区在MCAO模型中位于半暗带区域，神经保护旨在保护半暗带，特别是运动皮层的半暗带，挽救该区域细胞的功能对于减少神经功能损害至关重要。为了进一步探究M1区神经元激活在缺血性脑卒中中是否起关键作用。本实施例在构建MCAO模型2周前，M1区脑立体定位注射hSyn启动子驱动的化学遗传学腺相关病毒hM3Dq或hM4Di：AAV9-hSyn-HA-hM3D(Gq)

-IRES-mCitrine(hM3Dq)和AAV9-hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine(hM4Di)分别构建神经元激活和抑制模型；在hM3Dq或hM4Di病毒感染第11天腹腔注射CNO(1mg/kg)，对照组注射Vehicle(每24h一次，共计3次)。MCAO前30min第4次注射CNO或Vehicle，MCAO后23.5h第5次注射CNO或Vehicle，MCAO 24h取M1区脑组织，Western blot检测c-Fos表达；另外取完整脑组织，制备石蜡切片，免疫组化染色检测M1区c-Fos表达。

利用Western blot和免疫组化检测不同分组c-Fos的表达情况，结果显示，与hM3Dq+MCAO+Vehicle组相比，hM3Dq+MCAO+CNO组小鼠M1区c-Fos表达没有差异。与hM4Di+MCAO+Vehicle组相比，hM4Di+MCAO+CNO组小鼠M1区c-Fos表达降低(图6)。提示hM4Di+CNO抑制缺血性脑卒中诱导的神经元激活。

7.抑制M1区神经元激活减轻缺血性脑卒中诱导的神经功能障碍

为了评估M1区神经元活性对小鼠神经功能障碍的影响，本实施例通过行为学实验(包括mNSS评分、负趋地性实验、Kondziella翻转网实验和网格爬行实验)对上述化学遗传学病毒注射后小鼠进行检测。结果显示，hM3Dq+MCAO+Vehicle组和hM3Dq+MCAO+CNO组小鼠之间都没有显著差异(图7(a-d))。与hM4Di+MCAO+Vehicle组相比，hM4Di+MCAO+CNO组小鼠mNSS评分显著降低(图7(a))。负趋地性实验结果显示，与hM4Di+MCAO+Vehicle组相比，hM4Di+MCAO+CNO组小鼠潜伏期明显变短(图7(b))。Kondziella翻转网实验结果显示，与hM4Di+MCAO+Vehicle组相比，hM4Di+MCAO+CNO组小鼠倒挂时间明显增加(图7(c))。网格爬行实验结果显示，与hM4Di+MCAO+Vehicle组相比，hM4Di+MCAO+CNO组小鼠脚步失误明显降低(图7(d))。以上结果表明，抑制M1区神经元激活可改善缺血性脑卒中小鼠的神经功能缺损体征，增强前肢肌肉力量以及提高感觉运动功能及协调性。

8.抑制M1区神经元激活降低缺血性脑卒中诱导的脑梗死

检测上述化学遗传学病毒注射后小鼠M1脑梗死面积，MCAO 24h取脑组织，利用TTC染色检测梗死面积，结果如图8所示，hM3Dq+MCAO+Vehicle组和hM3Dq+MCAO+CNO组小鼠均有明显的脑梗死且两组之间没有显著差异。与hM4Di+MCAO+Vehicle组相比，hM4Di+MCAO+CNO组小鼠脑梗死面积明显降低。提示抑制M1区神经元激活降低缺血性脑卒中后脑梗死面积。

9.抑制M1区神经元激活减轻缺血性脑卒中诱导的小胶质细胞/巨噬细胞的激活

在hM3Dq或hM4Di病毒感染第11天腹腔注射CNO(1mg/kg)或Vehicle(每24h一次，共计3次)，MCAO前30min第4次注射CNO或Vehicle，MCAO后23.5h第5次注射CNO或Vehicle。MCAO24h取脑组织，制备石蜡切片，免疫荧光染色Iba-1标M1区小胶质细胞/巨噬细胞，结果如图9，与hM3Dq+MCAO+Vehicle组相比，hM3Dq+MCAO+CNO组小鼠M1区小胶质细胞/巨噬细胞数目没有明显差异且多数都处于激活状态。与hM4Di+MCAO+Vehicle组相比，hM4Di+MCAO+CNO组小鼠M1区小胶质细胞/巨噬细胞数目明显降低且部分呈现分支结构10.抑制M1区神经元激活减轻缺血性脑卒中诱导的炎症反应

在hM3Dq或hM4Di病毒感染第11天腹腔注射CNO(1mg/kg)或Vehicle(每24h一次，共计3次)，MCAO前30min第4次注射CNO或Vehicle，MCAO后23.5h第5次注射CNO或Vehicle。MCAO24h取M1区脑组织，Western blot检测Iba-1,IL-1β,TNF-α和Arg-1的表达，结果如图10，与hM3Dq+MCAO+Vehicle组相比，hM3Dq+MCAO+CNO组小鼠M1区Iba-1、IL-1β、TNF-α和Arg-1表达没有差异。与hM4Di+MCAO+Vehicle组相比，hM4Di+MCAO+CNO组小鼠M1区和core区Iba-1、IL-1β和TNF-α表达降低，Arg-1表达升高。表明利用hM4Di+CNO抑制M1区神经元激活有效降低了缺血性脑卒中诱导的炎症反应。

11.OGD/R诱导神经元激活

本实施例利用PC12细胞构建体外神经元“缺血再灌注”损伤模型即氧糖剥夺/复氧(Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation，OGD/R)模型，PC12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株，具有神经细胞特征，广泛用于神经生理和病理学研究。体外培养的PC12细胞进行OGD/R处理常用来模拟体内MCAO模型。本实施例选择OGD 6h/R 12h模拟体内缺血再灌注后神经元的激活状态，并利用超速离心法提取PC12细胞上清中的EVs。结果发现与Normal组相比，细胞内Ca

12.Nor-N-EVs和OGD-N-EVs鉴定

先前的研究发现，体外培养的神经元以活性依赖的方式释放EVs。神经元来源的EVs可以被小胶质细胞摄取并抑制LPS诱导的小胶质细胞活化。因此，接下来，探究缺血诱发神经元激活释放的EVs是否有助于神经元-小胶质细胞之间的通讯。通过TEM、纳米颗粒示踪和Western blot对来自正常培养的PC12细胞来源的EVs(Nor-N-EVs)和OGD/R培养的PC12细胞来源的EVs(OGD-N-EVs)进行表征。TEM结果显示，两种EVs均具有双层膜结构，呈现茶托状，直径在100nm左右(图12a)。纳米颗粒示踪分析结果，显示两种EVs的直径在100nm左右(图12b)。Western blot结果显示，两种EVs均表达CD9和CD63标志蛋白，不表达Calnexin(图12c)。符合EVs的特征。

13.OGD-N-EVs被小胶质细胞摄取

为了观察EVs能否被小胶质细胞摄取，本研究将收集的OGD-N-EVs与PKH67染液共孵育，获得PKH67标记的EVs(PKH67-labeled OGD-N-EVs)。用PKH67-labeled OGD-N-EVs孵育小胶质细胞，结果显示，PKH67-labled OGD-N-EVs被小胶质细胞摄取(图13)。

14.OGD-N-EVs诱导小胶质细胞炎症反应

为了验证OGD-N-EV是否能够诱导小胶质细胞炎症反应，本实施例用Nor-N-EVs(50μg/mL)和OGD-N-EVs(50μg/mL)孵育BV2细胞和原代小胶质细胞，结果发现，与Control组相比，Nor-N-EVs组IL-1β和Arg-1表达没有差异，但OGD-N-EVs组IL-1β表达显著升高，Arg-1表达降低。与Nor-N-EVs组相比，OGD-N-EVs组IL-1β表达显著升高，Arg-1表达降低(图14)。结果提示，OGD-N-EVs诱导小胶质细胞炎症反应。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。