一种人工富集的周丛生物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于土壤修复技术领域，具体涉及一种人工富集的周丛生物及其制备方法和用途。

背景技术

修复土壤有机污染，保障食物安全和农业的可持续发展，是当前农业环境领域的重大问题。土壤有机污染中最具代表性的一类持久性有机污染物是多环芳烃(Polycyclicaromatic hydrocarbons,PAHs)，常见的有菲、芘、苯并(b)荧蒽、苯并芘等。在众多的农业生产模式中，唯有稻田由土相和水相两部分组成。稻田特殊的耕作方式使得其已经成为下游水体污染物的重要污染源。PAHs更容易在稻田中沉积，这主要是由于水田中的有机碳含量高于旱地土壤的2.2倍，而PAHs具有高疏水性和强亲脂性，在富含有机质的土壤和自然水体中，溶解度常常高出理论值几倍甚至上百倍，促进其在环境中解吸、迁移和生物可利用性。目前，稻田PAHs污染治理工作是导致农村生态环境恶化及制约农业可持续发展的主要原因之一。由于土壤PAHs生物蓄积性、持久性、疏水性和毒性等特征，已形成的污染治理难度很大，因此需要从源头阻断PAHs的迁移积累并减少其通过食物链级联作用进入人体的含量，降低污染传播的风险。

目前，稻田有机污染阻控方法主要分为物理化学法、农业化学调控法和生物修复法。其中，物理化学法与农业化学调控法工程量大、操作复杂、投资费用高、存在二次污染等问题。相比于前者，生物修复法在治理稻田有机污染方面展示出低成本、高效率、无二次污染等方面的优势，并且具有非常好的应用前景。然而，生物修复技术在稻田有机污染修复过程中存在很多局限性，操作困难、难以大面积野外原位应用，并且目前新型修复材料研发力度不大，修复成本较高。对于农田而言，在注重有机污染阻控治理效果的同时还应该关注其环保性与安全性。因此，开发一些高效、廉价且环境友好，能够阻控土壤中有机污染的迁移并降低进入人体风险的新技术，将丰富土壤有机污染阻控技术种类，且进一步推进我国土壤有机污染治理研究工作。

周丛生物在防治稻田有机污染方面已经表现出巨大的潜力。周丛生物是一种以细菌、真菌和藻类为主要成分的微生物聚集体，其群落结构复杂，种群丰富，比表面积大，主要由光合自养型微生物主导，一般呈现绿色，广泛分布在稻田水土界面处。这种光养周丛生物最近受到广泛关注，因为它可以更有效地克服当前的生物修复限制，还可以增加土壤有机碳以促进农业养分循环和循环经济的闭合。如今，周丛生物已被应用于解毒废水中的各种有机污染物。Shabbir等人证明，周丛生物具有很强的生物吸附和降解能力，能够在168小时内完全去除高达1000mg L

然而天然存在的周丛生物成膜需要借助一定的载体。基于稻田需要定期进行灌溉的机制，所以周丛生物常常被破坏，无法发挥功能。常规的周丛生物培养基诱导的周丛生物生长成膜速度慢。目前还没有关于周丛生物降解稻田PAHs污染的报道。在PAHs降解的报道中，往往只降解单一PAHs。研究表明25天对液相体系的苯并芘的降解率为61.32％，而一旦进入到复杂的土壤体系后，降解能力不容乐观，对于100mg kg

发明内容

为解决现有稻田PAHs污染技术成本高、难以原位应用等技术问题，本发明公开了一种低成本、环境友好，同时兼具提高作物生长的效果，构建一种基于周丛生物的稻田PAHs污染原位防控技术。

本发明的技术方案为：

一种人工富集的周丛生物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将稻田水作为微生物种源与培养基混合得到混合培养液，将人工载体放置在混合培养液中，作为周丛生物附着人工载体，将周丛生物在人工载体上进行培养得到大量周丛生物。其中，所述周丛生物为PAHs富集潜力大的周丛生物，如膜状周丛生物，是一种绿色的微生物聚集体。

(2)将培养后的周丛生物从人工载体上剥离下来，得到周丛生物培养液；加水后离心，制备成周丛生物悬浮液。

(3)将制备好的周丛生物悬浮液均匀施加于稻田土壤表面。

(4)原位培养所述周丛生物。

进一步地，所述步骤(1)中，人工载体包括玻璃材料类、陶瓷类、沸石类、碳纤维类或碳酸盐类等。

进一步地，所述步骤(1)中，周丛生物混合培养液包括采集到的稻田水和培养基；其中，所述培养基的成分为：硝酸钠400～500mg，硫酸镁30～40mg，柠檬酸5～10mg，柠檬酸铁铵5～10mg，硼酸2～5mg，七水硫酸锌0.2～0.3mg，五水硫酸铜0.05～0.15mg，磷酸氢二钾30～50mg，氯化钙20～30mg，乙二胺四乙酸二钠0.5～1.5mg，碳酸钠10～30mg，四水氯化锰1～2mg，钼酸钠0.2～0.5mg，六水合二氯化钴0～0.08mg，溶剂为1L蒸馏水。

进一步地，所述步骤(1)中，对培养基进行优化，优化后新的培养基成分为：在原培养基成分基础上，再额外添加酵母提取物400～600mg和葡萄糖800～1200mg，溶剂为1L蒸馏水。该操作能够促进周丛生物的快速且稳定生长。

进一步地，所述步骤(1)中，周丛生物混合培养液中稻田水和优化后新的培养基体积比为100：(5～10)。

进一步地，所述步骤(1)中，每5～7天补充优化后新的培养基以至初始体积，以保证在周丛生物形成过程中提供足够的营养。

进一步地，所述步骤(1)中，周丛生物培养的时间为20～30天，直至周丛生物成熟为墨绿色。

进一步地，所述步骤(1)中，培养成熟的周丛生物中，群落内包含细菌、真菌和藻类，其中优势细菌为Proteobacteria，优势真菌为Ascomycota，优势藻类为Chloroplastida。

进一步地，所述步骤(2)中，周丛生物培养液与水的体积比为1：(10～20)，离心温度为28±2℃，转速为7000～8000rpm，时间为10～15min。沉淀物为周丛生物。

进一步地，所述步骤(2)中，加水制备周丛生物悬浮液，浓度为5～6g/L，以干重计。

进一步地，所述步骤(3)中，在烧杯、花盆或圆柱形罐子中加入300～400g采集的稻田土壤，添加周丛生物悬浮液5～10ml于稻田土壤中。

进一步地，所述步骤(3)中，添加周丛生物悬浮液的时机为水稻插秧之前。

进一步地，所述步骤(4)中，在稻田土壤表面原位培养周丛生物，构建上覆水—周丛生物—土壤微模型。

进一步地，所述步骤(4)中，上覆水深为3～6cm，待周丛生物大量生长，在土壤表面看到清晰的生物膜形状，即颜色变为墨绿色时，周丛生物制备完成。

本发明还包括一种人工富集的周丛生物在稻田PAHs污染原位防控方法的应用。在上述上覆水—周丛生物—土壤微模型中，进行水稻盆栽实验。

进一步地，水稻盆栽实验中，在水稻生长后的不同时间段，检测不同体系PAHs残留情况，包括但不限于上覆水、土壤及周丛生物。

进一步地，水稻盆栽实验中，在水稻生长后的不同时间段，检测水稻不同部位PAHs的积累情况，包括但不限于水稻根、茎、叶。

进一步地，水稻盆栽实验中，计算所有多环芳烃的总毒性苯并[a]芘当量来量化多环芳烃对水稻的毒性影响。

进一步地，水稻盆栽实验中，在水稻生长后的不同时间段，评估周丛生物对水稻生长的影响，包括但不限于测量水稻株高、根长。

本发明的有益效果：

(1)本发明通过人工载体富集大量周丛生物，操作简便，效果好，成本低，环境友好，无二次污染。相对于引入外源材料而言，该方法具有极高的环境安全性，适合野外大面积原位应用和推广。

(2)优化的培养方法使得周丛生物生长成膜快，提高了周丛生物内部微生物群落多样性，增强了对PAHs的耐受性，提高对PAHs的去除率。

(3)周丛生物还可以定殖在土壤中，促进水稻的生长，减轻PAHs对水稻的有害影响，不会对人体健康造成危害，在降低成本的同时环保处理了稻田PAHs污染难题。

附图说明

图1为基于16S rRNA序列的周丛生物的不同微生物群落组成成分气泡图，其中(A)为细菌群落组成成分气泡图，(B)为真菌群落组成成分气泡图，(C)为藻类群落组成成分气泡图。

图2为周丛生物和浮游菌对PAHs去除率比较图片。

图3为周丛生物对PAHs去除机制图片，其中(A)为周丛生物对PAHs总去除率图片，(B)为周丛生物对PAHs的吸附和降解比较图片。

图4为不同处理下稻田上覆水中PAHs浓度变化情况。

图5为不同处理下稻田土壤中PAHs浓度变化情况。

图6为不同处理下周丛生物内PAHs浓度变化情况。

图7为不同处理下水稻茎叶内PAHs浓度变化情况。

图8为不同处理下水稻根内部PAHs浓度变化情况。

图9为不同处理下水稻生物量变化情况。

具体实施方式

以下，举出实施例来说明本发明的具体实施方式，但本发明的实施方式不受如下这些实施例的限制，可在不影响本发明所要达到的技术效果的范围内做出任意选择和变更。实施例和试验中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明的具体实施方式中涉及如下实验技术与分析方法：

PAHs的提取与检测

样品用2倍体积的丙酮和正己烷混合物(1：1，体积比)超声提取30分钟，连续提取3次。使用旋转蒸发器将提取物合并蒸发，并重新溶解在2mL正己烷中，然后通过含有15mL正己烷和二氯甲烷混合物(1：1，体积比)的5.0g硅胶柱进行净化程序。再次蒸发样品并重新溶解在2mL乙腈中。通过0.22μm滤膜后进行样品检测。样品中的PAHs通过HPLC系统(Waters600,Waters 1525,America)和紫外检测器进行定量。在220nm处检测到菲、芘、苯并(b)荧蒽和苯并芘。使用PAH专用柱(Eclipse PAH 5μm,3.0×250mm)进行分离，色谱柱温度为25℃。PAHs分离优化条件为乙腈/水作为流动相，采用梯度洗脱，流速为0.8ml/min，进样量为10μL。

1.PAHs总量＝吸附量+降解量。

2.苯并[a]芘当量(TEQ)计算

计算所有多环芳烃的总毒性苯并[a]芘当量(TEQ)来量化多环芳烃的毒性。研究中所有多环芳烃浓度均以干重为基础进行描述。此外，如果多环芳烃化合物低于检测限，则认为缺失的浓度值等于检测限的1/3，以最大程度地减少样品的误差。TEQ计算公式为：

其中，C

3.水稻苯并芘毒性当量(TEQ)值安全范围参考国标GB2762-2017。

实施例1周丛生物的培养和富集

以玻璃载玻片为人工载体，诱导周丛生物生长和富集。首先，将装有玻璃载玻片的架子(长×宽×高＝10cm×3cm×12cm)放置在圆柱形玻璃水槽(直径14cm厘米和高16cm厘米)中。载玻片保持45°倾斜，诱导周丛生物生长和富集。将稻田水作为微生物种源与优化后新的培养基混合得到混合培养液，一并添加到玻璃缸中，其中混合培养液中稻田水和优化后新的培养基体积比为100：5。每5天添加1次优化后新的培养基。

如表1所示，得到优化后的新培养基成分为：硝酸钠500mg，硫酸镁36.6mg，柠檬酸6mg，柠檬酸铁铵6mg，硼酸2.86mg，七水硫酸锌0.22mg，五水硫酸铜0.08mg，磷酸氢二钾40mg，氯化钙27.2mg，乙二胺四乙酸二钠1mg，碳酸钠20mg，四水氯化锰1.81mg，钼酸钠0.39mg，六水合二氯化钴0.0409mg，酵母提取物500mg，葡萄糖1000mg，溶解于1L蒸馏水中。该培养基使得周丛生物生长良好，成熟快。培养21天后，将周丛生物用消毒过的硅胶刮刀将其剥离，得到周丛生物培养液，加水后离心，制备周丛生物悬浮液。周丛生物培养液与水的体积比例为1：10，离心温度为28℃，转速为7500rpm，时间为15min。

表1.周丛生物培养基的优化

A：常规培养基；B：酵母提取物；C：葡萄糖。

如图1所示，得到的周丛生物是包含细菌、真菌和藻类的微生物聚集体。其中优势细菌为Proteobacteria，包含的优势科有：Acetobacteraceae，Rubritaleaceae，Sphingomonasdaceae，Rhizobiaceae和Cyanobiaceae；优势真菌为Ascomycota，包含的优势科有：Nectriaceae和Hypocreales；优势藻类为Chloroplastida，包含的优势科有：Trebouxiophyceae。

实施例2周丛生物和浮游菌对PAHs的去除情况比较

本实施例选用的PAHs为菲、芘、苯并(b)荧蒽和苯并芘的混合溶液，通过将适量的每种化学品溶解在丙酮中来制备PAHs(50mg L

比较周丛生物和浮游菌对PAHs的去除能力，一组添加5ml周丛生物膜溶液，另一组添加等量浮游菌(晃动培养的稻田水，即不成膜的溶液)。实验在20ml灭菌的棕瓶中进行。所有棕瓶在黑暗中保持24小时以允许在接种前蒸发添加的丙酮。将所有棕瓶放置在光照架子上，并于1、3、5、7、10天后取样。所有的实验一式三份进行，在没有任何生物膜的情况下也进行了对照试验。

如图2所示，周丛生物能去除多种PAHs，不仅是低分子量PAHs，尤其对高分子量PAHs去除效果显著。且周丛生物对不同环数PAHs去除率均显著高于浮游菌，约是浮游菌的2倍。周丛生物是一种微生物聚集体，浮游菌是比较分散的微生物，其形成的吸附位点的微孔比较少。因此，可以得出结论，浮游菌去除PAHs主要是生物降解。相反，周丛生物膜则是吸附作用主导了PAHs的去除过程。

实施例3周丛生物对PAHs的去除机制

确定周丛生物对PAHs去除机制，设计两组实验：将大约0.2g稻田周丛生物膜悬浮于各组小棕瓶中，为了抑制周丛生物膜微生物活性，在添加PAHs前，先加入1.0g NaN

如图3(A)所示，10天后，对PAHs去除率为92.85％，主要以吸附和降解为主。由于本实验在光照条件下进行，一部分PAHs会发生光降解，仅占5.33％，可以忽略不计。所以，PAHs总量＝吸附量+降解量。如图3(B)所示，发现周丛生物对不同分子量PAHs去除机制相似，第一天吸附对Phe、Pyr、BbF和BaP的去除率分别为54.05％、50.27％、57.91％和49.95％，降解对Phe、Pyr、BbF和BaP的去除率分别为15.04％、10.18％、2.33％和6.84％。这些结果表明，吸附去除Phe、Pyr、BbF和BaP分别占周丛生物膜第一天内PAHs去除总量的78.23％、83.16％、96.13％和87.96％，尤其是高环PAHs。十天后，通过吸附去除Phe、Pyr、BbF和BaP分别为37.91％、32.10％、37.66％和34.27％。吸附和降解协同作用对Phe、Pyr、BbF和BaP去除率很高，分别为97.39％、87.01％、87.19％和82.09％。因此，可以得出结论，周丛生物对PAHs的去除机制为吸附和降解协同作用。

实施例4稻田上覆水PAHs的浓度变化

本实验构建上覆水-周丛生物-土壤的盆栽实验体系，根据苯环的数量，将来自受污染稻田的PAHs分为3环、4环、5环和6环PAHs。对本发明的周丛生物对稻田PAHs的阻控效果作阐述和验证，包括以下步骤：

1.盆栽体系构建

本实验在温室中进行。设置有无周丛生物膜的两个处理：Without PP(无周丛生物膜处理的土壤)和With PP(有周丛生物膜处理的土壤)。每个塑料桶(直径×高度＝10×15厘米)包含0.5公斤的水稻土。然后，用稻田水在每个桶中保持约2-3厘米的地表水层，以模拟稻田。对于周丛生物膜的处理，将10毫升等分的周丛生物膜悬液加入每个桶中，同时将10毫升去离子水加入每个桶中用于无周丛生物的处理。为了补偿水分蒸发，定期向桶中加入稻田水以保持水位在2-3cm。每个处理重复三次。为了抑制对照处理中的周丛生物生长，桶用纸板遮蔽。两周后，在周丛生物膜处理的土壤表面形成周丛生物层，而没有添加周丛生物的桶中没有周丛生物。分别于10、30、50天后，对上覆水、周丛生物和土壤进行采样。通过从土壤表面剥离周丛生物层对周丛生物进行取样分析。土壤样品(0-10cm)由岩心取样器收集。周丛生物和土壤样品均干燥至恒重，然后粉碎研磨进行后续分析。使用注射器对桶中的地表水进行取样。

2.实验组和对照组中上覆水PAHs浓度变化情况比较

如图4所示，周丛生物处理降低了稻田上覆水PAHs浓度。3环、4环和5环PAHs从10天时的17.33±3.50、36.34±1.47和13.16±1.10mg L

实施例5稻田土壤PAHs的浓度变化

1.盆栽体系构建

方法同实施例4。

2.实验组和对照组中土壤中PAHs浓度变化情况比较

如图5所示，周丛生物处理加速了土壤中PAHs的去除。稻田土壤中3环、4环、5环和6环PAHs从10天时的88.53±14.42、104.38±5.62、61.52±4.61和93.72±2.73mg kg

实施例6周丛生物膜内PAHs的浓度变化

1.盆栽体系构建

方法同实施例4。

2.周丛生物膜内PAHs浓度变化情况比较

如图6所示，更多的PAHs存在于周丛生物膜中。3环、4环、5环和6环PAHs从10天时的83.34±2.29、100.97±14.78、119.23±4.67和64.56±6.02mg kg

实施例7水稻体内PAHs的浓度变化

本实验构建水稻种植的盆栽体系，对本发明的周丛生物对水稻不同部位PAHs的阻控效果作阐述和验证，包括以下步骤：

1.水稻幼苗种植

上覆水-周丛生物膜-土壤盆栽体系构建方法同实施例4。待周丛生物膜培养成熟后，将水稻幼苗(yanfeng 47)种植在上述体系中。分别于10、30、50天后，对水稻进行取样测定。

2.水稻茎叶PAHs的提取

将水稻茎叶进行冷冻干燥，然后研磨并通过2毫米塑料网筛分，最后研磨并通过另一个筛子(<60目)，然后再进一步分析。

3.实验组和对照组中水稻茎叶中PAHs浓度变化情况比较

如图7所示，周丛生物的存在能够明显减少PAHs在水稻茎叶中的积累。50天后，水稻茎叶内的3环、4环、5环和6环PAHs分别为1235.95±54.78、305.04±35.14、115.46±20.05和222.27±34.17μg kg

实施例8水稻根内部PAHs的浓度变化

1.水稻根内部PAHs的提取

将收获的水稻根部用无菌水清洗干净后进行冷冻干燥。后续提取测定方法同实施例7。

2.实验组和对照组中水稻根内部PAHs浓度变化情况比较

如图8所示，周丛生物的存在能够明显减少PAHs在水稻根内部的积累。PAHs在根内部的积累比在茎叶中高。50天后，水稻根部内的3环、4环、5环和6环多环芳烃分别为2987.80±198.01、1692.89±119.95、1038.60±228.41和614.77±129.63μg kg

实施例9周丛生物对水稻的有益效果

1.PAHs对水稻毒性影响

当水稻PAHs高于5ng g

表2.50天后水稻不同采样点的TEQ值

-：没有计算出。

2.周丛生物对水稻的有益作用

在水稻生长的10天、30天和50天后取样，通过直尺测定水稻株高、根长。如图9所示，水稻茎叶长从10天的16.45cm增加到50天的36.84cm，是对照的1.35倍；根长从10天的7.45cm增加到50天的16.54cm，是对照的1.53倍。表明周丛生物具有促生长的作用。总体而言，周丛生物存在，降低了PAHs对水稻的毒性作用。

本发明通过富集载体及培养液的优化，制备出高PAHs富集能力的周丛生物，丰富周丛生物内部微生物群落的多样性，提高对PAHs去除率。该周丛生物还可以定殖在土壤中，可以同时去除多种PAHs，不仅包括低分子量PAHs，而且对高分子量PAHs去除效果显著，可以应用于PAHs污染的稻田修复项目。此外，该周丛生物还可以促进水稻的生长，减轻PAHs对水稻的有害影响，不会对人体健康造成危害，在降低成本的同时环保处理了稻田PAHs污染难题。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。