免提取的用于Y染色体微缺失快速检测的冻干PCR试剂和试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及免提取的用于Y染色体微缺失快速检测的冻干PCR试剂和试剂盒。

背景技术

据世界卫生组织统计，全世界约有15％的夫妇患有不育症，其中，男性不育约占一半左右。引起男性不育的因素有很多，其中30％以上的患者是由于遗传异常引起的，包括：Y染色体微缺失、染色体结构和数目异常、基因突变等。Y染色体微缺失在无精症或少精症患者中约占10-15％，是居于第二位的遗传因素。目前，Y染色体微缺失已成为男性不育患者的常规检查项目。

Y染色体微缺失指的是Y染色体长臂上存在与精子生成密切相关的无精子因子(Azoospermiafactor，AZF)发生微小的DNA片段缺失，会引起精子生成障碍，导致少、弱、畸形精子症甚至无精子症。AZF区包含AZFa、AZFb、AZFc区，任何一个区域的微缺失均可能导致少精或无精。其中，AZFa区域的缺失几率较低，但其整段缺失通常导致唯支持细胞综合征(sertoli cell only syndrome,SCOS)，临床表现为无精子症，若想从睾丸中获得精子进行辅助生育技术已不大可能。AZFb区域缺失的患者表现为生精阻滞，精子生成被阻滞在精母细胞阶段，导致没有精子生成。AZFc区缺失较为常见，是精子形成障碍的重要原因之一，该区域缺失的患者尚存精子生成能力，因此可以通过辅助生育手段进行治疗，但会将AZFc区域缺失遗传给男性后代，导致子代男性不育。对于AZFa、AZFb和AZFc三个区域全部缺失的患者，100％表现为无精子症，不可能通过任何手段从睾丸中获得精子，对该类患者进行辅助生育获得精子的机会几乎为零。可见，Y染色体微缺失检测对男性不育患者查明病因，避免不必要的药物和手术治疗，并为临床辅助生殖提供指导和依据以及开展胚胎植入前的遗传学诊断均具有重要意义。

欧洲男科协会和欧洲分子遗传质控网(EAA/EMQN)先后联合发布了3版《Y染色体微缺失分子诊断指导意见》均建议使用多重PCR-琼脂糖凝胶电泳方法对AZFa区的sY84和sY86、AZFb区的sY127和sY134、AZFc区的sY254和sY255共6个序列标签位点(STS)检测，进而诊断Y染色体的微缺失状况。若每个区域的2个STS同时发生缺失时，则代表该区域发生缺失。并指出以上6个STS位点可以检测出超过95％的AZF微缺失，足以满足常规诊断。

目前检测Y染色体微缺失的方法有多种，主要有多重PCR-凝胶电泳法、多重PCR-毛细管电泳法、多重荧光PCR法、基因芯片法等。多重PCR-凝胶电泳法容易污染导致假阳性、特异性和灵敏度不高、对DNA模板要求较高、自动化程度低、不适合大规模筛查；多重PCR-毛细管电泳法和基因芯片法虽然具有高通量、高精确性等特点，但技术要求高，仪器设备昂贵，不利于推广；而多重荧光PCR法自动化程度高、不需要电泳检测和杂交等步骤，能够有效减少污染问题所致的结果误判，同时由于荧光变化非常灵敏，因此比传统的PCR更加灵敏，另外，操作简单，只需一步实验即可得到结果，具有简便、快速、准确的特点。

目前，已有多重荧光定量PCR检测Y染色体微缺失，例如中国专利申请CN201510141295公布了一种诊断Y染色体微缺失的试剂盒，CN201620789823公开了一种Y染色体微缺失检测试剂盒，均是从外周血样本中提取DNA进行检测，采集量大，会造成患者采血痛苦，且样本需要提取核酸，操作繁琐，耗时较长。CN201510023696虽然采用微量血免提取扩增检测，但还是采集的外周血，采血量大，会造成患者采血痛苦，且用凝胶电泳法容易污染导致假阳性、特异性和灵敏度不高。以上方法的检测时间均为1h以上，检测时间长，不利于快速得到检测结果，延误诊断治疗时间。另外以上方法均采用液体型试剂，含有对温度敏感的Taq酶、引物、探针等成分，需要低温运输和保存以避免其性状发生变化而失效，且使用时配置繁琐，产品储存及运输的成本较高。

发明内容

本发明的目的提供免提取的用于Y染色体微缺失快速检测的冻干PCR试剂和试剂盒，以解决上述技术问题中的至少一个。

本发明解决技术问题的技术方案如下：

在本发明的第一方面，提供了免提取的用于Y染色体微缺失快速检测的冻干PCR试剂。

所述冻干PCR试剂包括独立包装的冻干PCR试剂Ⅰ和Ⅱ；

所述冻干PCR试剂Ⅰ包括Taq DNA聚合酶、dNTP、冻干成型剂，还包括：

特异性扩增AZFa区sY84的寡聚核苷酸上游引物(SEQ ID NO：1)、寡聚核苷酸下游引物(SEQ ID NO：2)和寡聚核苷酸荧光探针(SEQ ID NO：3)；

特异性扩增AZFb区sY134的寡聚核苷酸上游引物(SEQ ID NO：4)、寡聚核苷酸下游引物(SEQ ID NO：5)和寡聚核苷酸荧光探针(SEQ ID NO：6)；

特异性扩增AZFc区sY254的寡聚核苷酸上游引物(SEQ ID NO：7)、寡聚核苷酸下游引物(SEQ ID NO：8)和寡聚核苷酸荧光探针(SEQ ID NO：9)；

特异性扩增SRY的寡聚核苷酸上游引物(SEQ ID NO：10)、寡聚核苷酸下游引物(SEQ ID NO：11)和寡聚核苷酸荧光探针(SEQ ID NO：12)；

所述冻干PCR试剂Ⅱ包括Taq DNA聚合酶、dNTP、冻干成型剂，还包括：

特异性扩增AZFa区sY86的寡聚核苷酸上游引物(SEQ ID NO：13)、寡聚核苷酸下游引物(SEQ ID NO：14)和寡聚核苷酸荧光探针(SEQ ID NO：15)；

特异性扩增AZFb区sY127的寡聚核苷酸上游引物(SEQ ID NO：16)、寡聚核苷酸下游引物(SEQ ID NO：17)和寡聚核苷酸荧光探针(SEQ ID NO：18)；

特异性扩增AZFc区sY255的寡聚核苷酸上游引物(SEQ ID NO：19)、寡聚核苷酸下游引物(SEQ ID NO：20)和寡聚核苷酸荧光探针(SEQ ID NO：21)；

特异性扩增ZFX/ZFY的寡聚核苷酸上游引物(SEQ ID NO：22)和寡聚核苷酸下游引物(SEQ ID NO：23)和寡聚核苷酸荧光探针(SEQ ID NO：24)。

进一步地，所述的寡聚核苷酸荧光探针两端分别标记荧光基团和淬灭基团，荧光基团为FAM、VIC、CY5、ROX中的一种或其他具有发光特性的荧光基团，淬灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、MGB中的一种或其他具有荧光淬灭功能的化学基团。

进一步地，所述每管冻干PCR试剂包括：0.1μM～1μM寡聚核苷酸上游引物、0.1μM～1μM寡聚核苷酸下游引物、0.1μM～1μM寡聚核苷酸荧光探针、0.1～1U Taq DNA聚合酶、m/v为1％～10％的冻干成型剂和0.1～1mM dNTP。其中，m/v指质量浓度，表示每单位体积中质量是多少，单位为“kg/L”或“kg/m

当每管冻干PCR试剂中包括多种寡聚核苷酸上游引物时，每种寡聚核苷酸上游引物的终浓度为0.1μM～1μM。

当每管冻干PCR试剂中包括多种寡聚核苷酸下游引物时，每种寡聚核苷酸下游引物的终浓度为0.1μM～1μM。

当每管冻干PCR试剂中包括多种寡聚核苷酸荧光探针时，每种寡聚核苷酸荧光探针的终浓度为0.1μM～1μM。

进一步地，所述每管冻干PCR试剂包括：0.2μM寡聚核苷酸上游引物、0.2μM寡聚核苷酸下游引物、0.1μM寡聚核苷酸荧光探针、0.25U Taq DNA聚合酶、m/v为2％的冻干成型剂和0.5mM dNTP。

当每管冻干PCR试剂中包括多种寡聚核苷酸上游引物时，每种寡聚核苷酸上游引物的终浓度均为0.2μM。

当每管冻干PCR试剂中包括多种寡聚核苷酸下游引物时，每种寡聚核苷酸下游引物的终浓度均为0.2μM。

当每管冻干PCR试剂中包括多种寡聚核苷酸荧光探针时，每种寡聚核苷酸荧光探针的终浓度均为0.2μM。

进一步地，所述Taq DNA聚合酶为突变型的Taq DNA聚合酶，该酶为化学修饰、抗体修饰、配体修饰中的一种。

进一步地，所述Taq DNA聚合酶为突变型的抗体修饰Taq DNA聚合酶。突变型的抗体修饰Taq DNA聚合酶是现有的产品，可以选用如下销售厂商及商品型号：

翌圣生物科技(上海)股份有限公司，货号10717，Hieff 

宝日医生物技术(北京)有限公司，货号R071，MightyAmp

江苏康为世纪生物科技股份有限公司，货号CW3316，SuperFastStar DNAPolymerase

进一步地，所述冻干成型剂为海藻糖、蔗糖、牛血清蛋白、棉子糖、右旋糖酐、甘油、DTT、Proclin 300、甲酰胺、羟丙基-β-环糊精等中的一种或多种的混合。

进一步地，所述冻干成型剂的组分如下：m/v为1％-10％的海藻糖，m/v为1％-10％的棉子糖，m/v为1％-10％的羟丙基-β-环糊精。

进一步地，所述冻干成型剂的组分如下：m/v为2％的海藻糖，m/v为2％的棉子糖，m/v为2％的羟丙基-β-环糊精。

进一步地，所述用于Y染色体微缺失检测的冻干PCR试剂通过如下冻干程序制备：4℃，10min；-45℃，2h；-45℃，0.2mbar，5h；0℃，0.2mbar，1h；10℃，0.2mbar，1h；20℃，0.2mbar，1h；30℃，2h。

在本发明的第二方面，提供含有免提取的用于Y染色体微缺失快速检测的试剂盒，所述的试剂盒包括如第一方面所述的冻干PCR试剂，还包括复溶剂、阳性对照和阴性对照。

所述的复溶剂，包括以下组分：4mM MgCL

进一步地，所述的PCR抑制剂清除剂选用肝素琼脂糖凝胶。

所述的阳性对照，包括以下组分：含六个特定STS位点基因特异性片段的质粒及两个内对照基因特异性片段的质粒混合液。

进一步地，所述的含六个特定STS位点基因特异性片段的质粒及两个内对照基因特异性片段的质粒序列分别为SEQ ID NO：25-32。

进一步地，所述的阳性对照为1ng/μL的上述各位点基因特异性片段的质粒混合液。

所述的阴性对照，包括以下组分：灭菌水。

SEQ ID NO：25-32序列如下：

本发明具有如下技术效果：

1)血液中含有多种抑制PCR反应的物质，主要是各种蛋白质，如血红蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白(IgG)等。本发明采用肝素琼脂糖凝作为PCR抑制剂清除剂，其中肝素是一种含硫酸酯的酸性多糖，能和抗凝血因子Ⅲ、凝血因子、蛋白合成因子、脂蛋白、干扰素、核酸结合蛋白、限制内切酶、凝血酶及类凝血酶等生物大分子结合，将它偶联到活化的琼脂糖凝胶上，肝素琼脂糖凝胶结合蛋白质，快速沉淀去除血液中的PCR抑制剂，从而使血液在无需核酸抽提的情况直接混入反应液，快速简便地检测血液中存在的各种病毒，操作简单方便，缩短了操作时间，避免在分离纯化过程中丢失核酸，同时也降低了样品在核酸抽提过程中发生交叉污染的风险，减少了对环境的化学污染。

2)本发明选用扩增子变短，有利于缩短扩增时间的特定引物，与其他优选组分协同作用，例如特定的Taq DNA聚合酶及含有特定的PCR抑制剂清除剂的复溶剂，制得的试剂盒，能够实现以指尖血制备的血卡为检测样本，样本需求量少，减少患者痛苦；患者居家即可完成采样，不需要专门去医院，也不需专业医护人员采样，真正实现采样与检测的分离，保护患者隐私。

3)本发明采用突变型的抗体修饰Taq DNA聚合酶，该酶具有很强的PCR抑制剂耐受能力，结合优化的复溶剂，能实现血卡的免提取扩增。同时抗体修饰的Taq DNA聚合酶在95℃条件下能快速释放酶活，加上较短的扩增子，可大大缩短检测时间，45min左右即可完成检测。

4)本发明制备的冻干PCR试剂，将寡聚核苷酸引物和探针、Taq DNA聚合酶、dNTP、冻干成型剂等制成常温下稳定共存的组分，检测性能与液体试剂一致，能实现常温运输。大大降低荧光PCR试剂的运输、存储成本，延长保质期，减少使用操作步骤，简化临床检测过程，更方便实际使用和推广。

附图说明

图1为用于Y染色体微缺失检测的冻干PCR试剂Ⅰ和Ⅱ。

图2a为阳性对照和阴性对照用冻干PCR试剂Ⅰ与液体PCR试剂Ⅰ的检测结果。

图2b为阳性对照和阴性对照用冻干PCR试剂Ⅱ与液体PCR试剂Ⅱ的检测结果。

图2c为正常男性血卡用冻干PCR试剂Ⅰ与液体PCR试剂Ⅰ的检测结果。

图2d为正常男性血卡用冻干PCR试剂Ⅱ与液体PCR试剂Ⅱ的检测结果。

图3a为冻干PCR试剂Ⅰ检测正常男性1血卡结果。

图3b为冻干PCR试剂Ⅱ检测正常男性1血卡结果。

图3c为冻干PCR试剂Ⅰ检测正常男性2血卡结果。

图3d为冻干PCR试剂Ⅱ检测正常男性2血卡结果。

图4a为冻干PCR试剂Ⅰ检测样本1的结果。

图4b为冻干PCR试剂Ⅱ检测样本1的结果。

图5a为冻干PCR试剂Ⅰ检测样本3的结果。

图5b为冻干PCR试剂Ⅱ检测样本3的结果。

图6a为冻干PCR试剂Ⅰ检测样本5的结果。

图6b为冻干PCR试剂Ⅱ检测样本5的结果。

图7a为冻干PCR试剂Ⅰ检测样本9的结果。

图7b为冻干PCR试剂Ⅱ检测样本9的结果。

图8a为冻干PCR试剂Ⅰ检测样本10的结果。

图8b为冻干PCR试剂Ⅱ检测样本10的结果。

图9a为用于Y染色体微缺失检测的冻干PCR试剂盒中冻干PCR试剂Ⅰ的稳定性测试结果。

图9b为用于Y染色体微缺失检测的冻干PCR试剂盒中冻干PCR试剂Ⅱ的稳定性测试结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。本发明所用的Taq DNA聚合酶为江苏康为世纪生物科技股份有限公司，货号CW3316，SuperFastStar DNAPolymerase；其余所用试剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

实施例1STS和内控的引物、探针设计

根据EAA/EMQN发布的《Y染色体微缺失分子诊断指导意见》上推荐的各STS和内控位点引物序列，在NCBI(NationalCenterofBiotechnologyInformation)上查找各个位点的扩增片段，根据引物和扩增片段的位置关系设计相应的Taqman荧光探针序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。序列合成完毕后进行质检、定量，然后根据需要稀释成所需浓度。本发明所用STS位点的引物、探针序列见下表。

实施例2

制备免提取的用于Y染色体微缺失快速检测的冻干PCR试剂和试剂盒(48人份/盒)

(1)冻干PCR试剂Ⅰ和Ⅱ

配制m/v为20％的冻干成型剂母液：海藻糖+棉子糖+羟丙基-β-环糊精，其中，m/v指质量浓度，表示每单位体积中质量是多少，单位为“kg/L”或“kg/m

用于Y染色体微缺失检测的冻干PCR试剂Ⅰ配制如下：

用于Y染色体微缺失检测的冻干PCR试剂Ⅱ配制如下：

将上述试剂混合，制得终反应体积为25μL的PCR试剂，根据需求配制所需体积混合液(25μL×N)，混合均匀后分装到8联排PCR管中，不盖盖放入冻干机制备冻干PCR试剂，按以下程序进行：4℃，10min；-45℃，2h；-45℃，0.2mbar，5h；0℃，0.2mbar，1h；10℃，0.2mbar，1h；20℃，0.2mbar，1h；30℃，2h。冻干结束后，在封闭环境下封装冻干PCR试剂，制得用于Y染色体微缺失检测的冻干PCR试剂Ⅰ和Ⅱ(如图1所示)。

(2)复溶剂：按照以下配方配制冻干PCR试剂的复溶剂：4mM MgCL

(3)阳性对照：含六个特定STS位点及两个内对照基因的质粒混合液。

所述的阳性对照，包括以下组分：含六个特定STS位点基因特异性片段的质粒及两个内对照基因特异性片段的质粒混合液。含六个特定STS位点基因特异性片段的质粒及两个内对照基因特异性片段的质粒序列分别为SEQ ID NO：25-32。

所述的阳性对照为1ng/μL的上述各位点基因特异性片段的质粒混合液。上述质粒均是由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

(4)阴性对照：灭菌水。

试剂盒(48人份/盒)组分如下表：

实施例3

免提取的用于Y染色体微缺失快速检测的冻干PCR试剂和试剂盒的检测流程：

1)确定总反应数：根据检测样本数计算所需反应数，如样本数为n，则总反应数N＝n+2，取N管冻干PCR试剂Ⅰ和冻干PCR试剂Ⅱ，瞬时离心10秒，确保冻干PCR试剂离至管底，备用。

2)冻干PCR试剂复溶：每管冻干PCR试剂中加5μL复溶剂溶液和18μLddH

3)加样：检测样本为男性不育患者的指尖血制备的血卡，用0.5mm打孔器从血卡(正反均有血迹处)打孔取样，将其放入复溶后体积为23μL的冻干PCR试剂反应管中；分别取2μL阳性对照和阴性对照，加入到复溶后体积为23μL的冻干PCR试剂反应管中，总反应体积25μL。

4)PCR扩增：本发现使用ABI QuantStudio 5检测，在Fast模式下设置PCR程序如下：95℃预变性1min(1个循环)；95℃变性5s，60℃退火延伸5s，如此进行10个循环；95℃变性5s，60℃退火延伸收集荧光20s，如此进行30个循环。每一循环实时采集CY5、FAM、ROX、VIC荧光信号。

5)结果分析：

①质控标准：

阳性对照：FAM、ROX、CY5和VIC通道均有扩增且Ct值≤20。

阴性质控：FAM、ROX、CY5和VIC通道均无扩增。

以上要求需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效。

②结果判定

实施例4比较冻干PCR试剂与液体PCR试剂的检测性能

本实施例采用的冻干PCR试剂为实施例2中制备的用于Y染色体微缺失检测的冻干PCR试剂Ⅰ和Ⅱ，对照试剂为液体PCR试剂(与冻干PCR试剂配方一致)。

1)冻干PCR试剂复溶：每管冻干PCR试剂中加5μL复溶剂溶液和18μLddH

2)液体对照PCR试剂配制：按下表配制液体PCR反应试剂Ⅰ：

按下表配制液体PCR反应试剂Ⅱ：

3)加样：模板为实施例2中制备的阳性对照和阴性对照及正常人的指尖血制备的血卡，复溶的冻干PCR试剂孔和液体对照试剂孔各加2μL阳性对照和阴性对照及0.5mm血卡作为反应模板，总反应体积25μL。

4)PCR扩增：本发现使用ABI QuantStudio 5检测，在Fast模式下设置PCR程序如下：95℃预变性1min(1个循环)；95℃变性5s，60℃退火延伸5s，如此进行10个循环；95℃变性5s，60℃退火延伸收集荧光20s，如此进行30个循环。每一循环实时采集CY5、FAM、ROX、VIC荧光信号。

5)测试结果：如图2a、图2b、图2c、图2d所示：制备的用于Y染色体微缺失检测的冻干PCR试剂Ⅰ和Ⅱ，与冻干PCR试剂配方一致的液体PCR试剂的检测性能基本一致。

实施例5血卡免提取扩增与血卡核酸提取扩增对比

所用试剂为实施例2中组装的免提取的用于Y染色体微缺失快速检测的冻干PCR试剂和试剂盒(48人份/盒)，待测样本为正常男性志愿者的指尖血制备的血卡2份。

用0.5mm打孔器从同一血卡(正反均有血迹)处取相似血卡两片，一片用英芮诚生化科技的磁珠法血斑&血卡基因组DNA提取试剂盒(BSDE-5005)提取对应核酸，另一片用于血卡免提取扩增。

检测方法同实施例3，提取的核酸取2μL作为检测模板。阳性对照和阴性对照符合质控标准，本次检测有效。对比结果如图3a、图3b、图3c和图3d所示：血卡免提取扩增与血卡核酸提取扩增结果基本一致，组装的免提取的用于Y染色体微缺失快速检测的冻干PCR试剂和试剂盒(48人份/盒)用血卡免提取扩增与血卡核酸提取性能一样。

实施例6免提取的用于Y染色体微缺失快速检测的冻干PCR试剂和试剂盒在临床样本中的应用

所用试剂为实施例2中组装的免提取的用于Y染色体微缺失快速检测的冻干PCR试剂和试剂盒(48人份/盒)，待测样本为医院门诊收集的男性不育患者的指尖血制备的血卡10份。

检测方法同实施例3，阳性对照和阴性对照符合质控标准，本次检测有效。缺失样本检测结果如图4a-8b所示，统计如下：

注：“-”表示检出缺失

实施例7免提取的用于Y染色体微缺失快速检测的冻干PCR试剂和试剂盒的稳定性测试

本实施例所用试剂盒为实施例2中制备的免提取的用于Y染色体微缺失快速检测的冻干PCR试剂和试剂盒(48人份/盒)。用阳性对照检测在室温和37℃储存6个月的冻干PCR试剂盒及新制备的冻干PCR试剂盒，检测方法同实施例3。

测试结果如图9a和图9b所示：室温和37℃储存6个月的冻干PCR试剂盒的扩增性能均与对照组新制备冻干PCR试剂盒的扩增性能一致。故实施例2中制备的免提取的用于Y染色体微缺失快速检测的冻干PCR试剂和试剂盒(48人份/盒)可以在室温和37℃储存6个月以上。

以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。