衣康酸在抑制大肠杆菌和沙门氏菌中的应用

技术领域

本发明涉及抑菌技术领域，尤其涉及衣康酸在抑制大肠杆菌和沙门氏菌中的应用。

背景技术

大肠杆菌和沙门氏菌是威胁大众生命健康的人畜共患病原菌，其主要通过感染牲畜、污染食物及其表面包装或生产加工线进而感染人类，引发患者发烧、腹泻、呕吐和出血性结肠炎。因此，需要对大肠杆菌和沙门氏菌的感染和传播进行控制，同时还需要对牲畜、食物等进行抑菌控制，对牲畜感染、食物感染等进行控制。

人们目前多用抗生素来进行细菌感染的防治，但在药物制剂、饲料添加剂运用方面，抗生素的副作用日趋严重。同时，随着抗生素的过度使用，细菌的耐药性随之提高，增大了疾病治疗的困难。

因此，本领域亟需寻找一种安全高效的药物，来有效控制病原菌大肠杆菌和沙门氏菌的生长和传播，同时解决耐药性问题。

现有技术中，申请公布号为CN114568432的中国专利公开了香草酸甲酯及其衍生物在制备抗菌剂中的应用。该专利在香草酸甲酯的已有活性的基础上研发其新的抗菌活性，通过大量实验筛选开发出香草酸甲酯在抗革兰氏阴性细菌方面的功能，给香草酸甲酯开发成新型抗菌剂提供了依据。但更多安全高效的药物仍然有待发现。

发明内容

本发明要解决上述技术问题，，从而提供衣康酸在制备抑制大肠杆菌和沙门氏菌的产品中的应用。

本发明的具体技术方案为：

一方面，本发明提供了衣康酸在制备抑制大肠杆菌和/或沙门氏菌的产品中的应用。

衣康酸分子的结构式为：

作为上述技术方案的优选，所述产品为药品、日化用品、食品、食品添加剂、饲料添加剂或动物饲料。

衣康酸的浓度为不小于1.56mg/mL时，可以显著降低细菌群体感应、运动能力、毒力相关基因的表达的浓度，并显著抑制大肠杆菌或沙门氏菌的生物膜形成。进一步地，作为本发明的优选，所述产品为抑菌剂，其中，所述衣康酸的浓度为不小于1.56mg/mL。

衣康酸是由哺乳动物免疫细胞在细菌感染期间大量合成的一种代谢物。衣康酸已被证明对生物体无毒副作用，其在临床治疗炎症性疾病方面具有显著效果。衣康酸属于氟喹诺酮类药物，能够通过抑制细菌DNA减数分裂酶的活性来抗菌。衣康酸目前主要用于治疗人体内的细菌感染，而不用于体外抗菌。体外抗菌是指在体外环境中对细菌进行抑制或杀灭，例如在细菌培养基或试验体系中使用抗菌剂抑制或杀灭细菌。在本发明中，首次发现并证实了衣康酸在体外环境中具有有效抑制细菌生长并减弱其致病性的作用，给出了衣康酸在大肠杆菌和/或沙门氏菌抑菌产品中的应用。

具体地，本发明提供了衣康酸对大肠杆菌和沙门氏菌的最小抑菌浓度(MIC)，为3.125mg/mL；提供了衣康酸明显破坏细胞壁完整性并提高细菌胞内活性氧ROS水平的浓度，为3.125mg/mL；提供了衣康酸显著抑制大肠杆菌生物膜形成的浓度，为1/4×MIC；提供了衣康酸显著抑制沙门氏菌生物膜形成的浓度为，1/2×MIC；提供了衣康酸有效抑制细菌运动性的浓度，为1×MIC；提供了衣康酸显著降低细菌群体感应、运动能力、毒力相关基因的表达的浓度，为1/2×MIC；提供了衣康酸有效抑制细菌有氧呼吸，为1/2×MIC，其中，还提供了衣康酸显著降低琥珀酸脱氢酶活性的浓度，为1×MIC。

由此说明，衣康酸有望作为抗生素替代品。并基于本发明，给出了衣康酸在药物、抑菌剂、食品、食品添加剂、饲料添加剂或动物饲料等领域的抗菌应用提供了依据。

另一方面，本发明还提供了一种抑菌制品，其活性成分包括衣康酸。作为优选，所述制品的活性成分为衣康酸。

作为本发明的优选，所述抑菌为抑制大肠杆菌和/或沙门氏菌。

作为本发明的优选，所述抑菌制品为药品、日化用品、食品、食品添加剂、饲料添加剂或动物饲料。

进一步地，作为本发明的优选，所述制品为抑菌剂，其中，所述衣康酸的浓度为不小于1.56mg/mL。

衣康酸的浓度为不小于1.56mg/mL时，可以显著降低细菌群体感应、运动能力、毒力相关基因的表达的浓度，并显著抑制大肠杆菌或沙门氏菌的生物膜形成。

本发明证实了衣康酸能有效抑制细菌生长并减弱其致病性，衣康酸作为一种免疫细胞内源代谢产物，在治疗细菌感染方面具有优良的生物安全性，符合药物研发和添加剂使用的基本原则。由此说明，衣康酸有望作为抗生素替代品，在药物、抑菌剂、食品、食品添加剂、饲料添加剂或动物饲料等领域的抗菌应用提供了依据。

具体地，本发明提供了衣康酸在制备用于抑制大肠杆菌生长、生物膜形成和毒力基因表达的微生物添加剂中的应用。

具体地，本发明提供了衣康酸在制备用于抑制沙门氏菌生长、生物膜形成和毒力基因表达的微生物添加剂中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：

本发明提供了衣康酸对大肠杆菌和沙门氏菌的最小抑菌浓度(MIC)，为3.125mg/mL；提供了衣康酸明显破坏细胞壁完整性并提高细菌胞内活性氧ROS水平的浓度，为3.125mg/mL；提供了衣康酸显著抑制大肠杆菌生物膜形成的浓度，为1/4×MIC；提供了显著抑制沙门氏菌生物膜形成的浓度为，1/2×MIC；提供了有效抑制细菌运动性的浓度，为1×MIC；提供了显著降低细菌群体感应、运动能力、毒力相关基因的表达的浓度，为1/2×MIC；提供了有效抑制细菌有氧呼吸，为1/2×MIC，其中，还提供了显著降低琥珀酸脱氢酶活性的浓度，为1×MIC。由此说明，衣康酸可替代抗生素，并给出了用于药物、抑菌剂、食品、食品添加剂、饲料添加剂或动物饲料的抗菌的应用依据。

附图说明

图1为本发明实施例2中牛津杯法测定衣康酸对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌直径结果图；

图2为本发明实施例3中IA对大肠杆菌和沙门氏菌的时间-杀菌曲线；

图3为本发明实施例4中IA处理大肠杆菌和沙门氏菌形态学影响的透射电子显微镜观察图；

图4为本发明实施例5中IA诱导大肠杆菌和沙门氏菌细胞内ROS水平检测结果统计图；

图5为本发明实施例6中Syto 9/PI标记大肠杆菌和沙门氏菌细胞膜状态的观察图；

图6为本发明实施例7中IA处理大肠杆菌和沙门氏菌生物膜形成能力的检测结果统计图；

图7为本发明实施例8中IA处理大肠杆菌和沙门氏菌运动性的检测结果统计图；

图8为本发明实施例9中IA处理大肠杆菌和沙门氏菌致病性相关基因表达的检测结果统计图；

图9为本发明实施例10中IA处理大肠杆菌和沙门氏菌有氧呼谢的检测结果统计图；

图10为本发明实施例11中IA处理大肠杆菌和沙门氏菌琥珀酸脱氢酶活性、富马酸水平的检测结果统计图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步的描述。

实施例中所涉及的培养基如下：

LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，pH调节至7.4，121℃高温高压灭菌20min。

实施例1制备衣康酸(IA)溶液

IA以含2％ DMSO的PBS溶解，40℃，100W超声1.5h，制成200mg/mL母液，MCE滤膜过滤除菌后37℃保存。

实施例2测定IA对大肠杆菌和沙门氏菌的最低抑菌浓度(MIC)和抑菌直径鼠伤寒沙门氏菌SL1344和从鸡肠道中分离得到的野生型肠出血性大肠杆菌，均由浙江大学动物科学学院兽医系和预防兽医科学研究所提供。将冻存的大肠杆菌和沙门氏菌按2％(v/v)接种到灭菌LB液体培养基中，于37℃下培养12h获得菌液，连续接种培养3次以活化菌株。

根据微量肉汤稀释法测定IA的MIC，用LB进行IA二倍梯度稀释(0～50mg/mL)，将200μL梯度稀释液添加到96孔板中。调节对数期的大肠杆菌和沙门氏菌至10

使用牛津杯法测定IA的抑菌直径。将6个牛津杯均匀地放置在每个板上。在降温后的熔融LB琼脂中加入对数生长期的菌液，调整至10^5～6CFU/mL。待混合物倒入培养皿凝固后，将1/2×、1×和2×MIC的IA加入杯中，PBS作为阴性对照，100μg/mL庆大霉素作为阳性对照。做三个重复。培养皿在4℃下预扩散4h，随后在37℃下孵育16h，用游标卡尺测量抑菌直径。结果如图1及表1所示，其中，A为大肠杆菌，B为沙门氏菌。

由图1及表1可知，在1×MIC处理中，大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌直径分别为15.77±0.67mm和14.2±0.62mm。此外，随着IA浓度的提高而抑菌圈直径不断扩大。

表1IA对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌直径

表1中，数据以均值±标准差形式显示。

实施例3测定IA对大肠杆菌和沙门氏菌的时间-杀菌曲线：

取200μL对数生长期的菌液，分别加入含0、1/4×MIC、1/2×MIC、1×MIC、2×MIC和4×MIC的IA的10mL的LB培养基中。在37℃下孵育2、4、6、8、10和12小时后，酶标仪测定OD

由图2可知，1/2×MIC的IA明显抑制了大肠杆菌和沙门氏菌的生长，而1×MIC则完全抑制了细菌的生长。

实施例4观察透射电子显微镜(TEM)观察IA对大肠杆菌和沙门氏菌形态学的影响细菌悬液加入含1×和2×MIC的IA的LB培养基中，调整至10

由图3可知，对照组细菌表面形态完整，胞质内电子密度均匀。与之相比，1×MIC处理后细胞膜边缘变得模糊，细胞质收缩，甚至出现了中空；2×MIC处理后，细胞破裂，内容物严重损失。

实施例5测定IA处理大肠杆菌和沙门氏菌细胞内的ROS水平

细胞膜破裂与细菌氧化应激有关。

采用DCFH-DA作为指示剂检测细胞中的羟基、过氧化物和其他ROS。细菌悬液加入含1/2×MIC、1×MIC和2×MIC的IA的LB培养基中，调整至10

由图4可知，与对照组相比，1×和2×MIC均显著提高两种菌中的ROS水平。

实施例6检测IA处理大肠杆菌和沙门氏菌的细胞膜完整性

使用Syto 9/PI活力试剂盒测定细菌状态。Syto 9和PI都是标记核酸的探针，Syto9因其高渗透性可同时标记活/死细胞，而PI只能穿透细胞膜严重受损的细胞。因此，活细胞发出绿色荧光，而受损细胞发出红色荧光。将含1/2×、1×和2×MICIA的10

染色结果如图5所示，其中，A～D为大肠杆菌的染色结果，E～H为沙门氏菌的染色结果。

由图5可知，具有完整细胞膜的对照组细菌发出绿色荧光，而随着IA浓度提高，发出红色荧光的细菌的相对丰度明显增加。

实施例7检测IA处理大肠杆菌和沙门氏菌的生物膜形成能力生物膜是细菌群落分泌的胞外聚合物，它帮助细菌定植在固体表面，增强其抵抗外界环境的能力，进而提高其致病性。结晶紫染色测定细菌生物膜形成能力。细菌接种于含有梯度稀释IA的LB中，最终浓度为10

生物膜形成能力如图6所示(*,p≤0.05；**,p≤0.01；***,p≤0.001)，其中，A、B为大肠杆菌，C、D为沙门氏菌。

由图6可知，1/4×MIC的IA显著降低了大肠杆菌35.32％的生物膜；而1/2×MIC的IA显著降低了沙门氏菌41.42％的生物膜。

实施例8检测IA处理大肠杆菌和沙门氏菌的运动性

滑动运动帮助细菌快速定植到营养丰富的环境中，且参与到了生物膜的形成中。检测细菌的滑动运动性。准备含有梯度稀释IA的预干燥0.7％琼脂LB平板，将对数期菌液接种在平板四角上，37℃下孵育48h，用游标卡尺测量各菌落直径。运动测定结果如图7所示(*,p≤0.05；**,p≤0.01；***,p≤0.001)，其中，A～F为大肠杆菌的结果，G～L为沙门氏菌的结果。

由图7可知，IA浓度为1×MIC时，完全抑制细菌运动，此外1/2×MIC可明显降低沙门氏菌的迁移能力。

实施例9检测IA对大肠杆菌和沙门氏菌致病性相关基因表达的影响：AI-2/luxS调节系统是细菌交流的重要机制之一，它有效调节细菌毒力表达、生物膜形成和运动等致病性相关能力。细菌悬液加入含1/2×和1×MIC IA的LB中，调整至10

由图8可知，与对照组相比，IA处理显著抑制了两种细菌的鞭毛运动基因(fliA,motB)、AI-2转运蛋白基因(lsrA)和除hilD外的毒力基因的表达。此外，在大肠杆菌中，鞭毛主要调节基因(flhD)和AI-2结合蛋白基因(lsrB)的转录水平相比对照组没有观察到显著变化，而AI-2合成基因(luxS)上调；在沙门氏菌中，luxS的转录水平相比对照组先显著降低后与对照组相比未见明显差异。

实施例10检测IA对大肠杆菌和沙门氏菌呼吸代谢的影响

刃天青是一种氧化还原指示剂，可用于测量IA处理细菌的有氧呼吸水平，其荧光强度与细菌呼吸速率呈正相关。细菌和梯度稀释的IA的LB培养基37℃孵育30min后，将混合溶液和刃天青(0.1mg/mL)以5:1混合。LB培养基和任天青混合作为对照，37℃下孵育1h，然后在560nm激发/590nm发射下检测荧光强度。

呼吸速率结果如图9所示(*,p≤0.05；**,p≤0.01；***,p≤0.001)，其中，A为大肠杆菌，B为沙门氏菌。

由图9可知，1/2×MIC的IA显著抑制细菌的有氧呼吸，且随着IA浓度的提高，荧光强度显著下降，表明IA可以有效抑制细菌有氧呼吸。

实施例11检测IA处理的细菌琥珀酸脱氢酶(SDH)活性及其代谢物水平三羧酸循环是有氧呼吸的重要能量代谢通路，而SDH是其中的关键功能部分，催化琥珀酸氧化为富马酸。按说明书检测1/2×和1×MIC IA处理8h后的细菌SDH活性及富马酸水平。

检测结果统计如图10所示(*,p≤0.05；**,p≤0.01；***,p≤0.001)，其中，A、C为大肠杆菌的结果，B、D为沙门氏菌的结果。

由图10可知，IA处理后，两种菌的SDH活性均呈下降趋势，并且在1×MIC时被显著抑制。此外，相比1/2×MIC的IA处理，1×MIC的IA处理显著降低了富马酸的代谢水平。综上，1×MIC的IA可抑制SDH活性并降低富马酸水平，表明IA在大肠杆菌和沙门氏菌中发挥SDH抑制剂的作用。

通过上述实施例，本发明提供了衣康酸对大肠杆菌和沙门氏菌的最小抑菌浓度(MIC)，为3.125mg/mL，且1.56mg/mL(1/2×MIC)已明显抑制细菌生长；提供了衣康酸明显破坏细胞壁完整性并提高细菌胞内活性氧ROS水平的浓度，为3.125mg/mL；提供了衣康酸显著抑制大肠杆菌生物膜形成的浓度，为1/4×MIC；提供了显著抑制沙门氏菌生物膜形成的浓度为，1/2×MIC；提供了有效抑制细菌运动性的浓度，为1×MIC；提供了显著降低细菌群体感应、运动能力、毒力相关基因的表达的浓度，为1/2×MIC；提供了有效抑制细菌有氧呼吸，为1/2×MIC，其中，还提供了显著降低琥珀酸脱氢酶活性的浓度，为1×MIC。

由此证实了衣康酸在体外环境中能有效抑制细菌生长并减弱其致病性，衣康酸作为一种免疫细胞内源代谢产物，在治疗细菌感染方面具有优良的生物安全性，符合药物研发和添加剂使用的基本原则。由此说明，衣康酸有望作为抗生素替代品。并基于本发明，给出了衣康酸在药物、药物、抑菌剂、食品、食品添加剂、饲料添加剂或动物饲料等抗菌领域的应用的依据。

实施例中涉及的衣康酸(IA)购自上海麦克林生化科技股份有限公司，胰蛋白胨、酵母粉购自英国OXOID公司，DMSO购自上海生工生物工程有限公司，氯化钠购自国药集团化学试剂有限公司，琼脂购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。琥珀酸脱氢酶(SDH)活性检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，富马酸检测ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。总RNA提取试剂盒，RNA反转试剂盒，RTPCR混合试剂盒均购自宝日医生物技术(北京)有限公司。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。