一种检测番茄品种纯度的KASP标记引物组及其试剂盒和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种检测番茄品种纯度的KASP标记引物组及其试剂盒和应用。

背景技术

番茄(Solanum lycopersicom)，原产于南美洲，属于茄科草本植物。番茄果实富含多种营养元素，具有抗氧化能力，能够预防多种疾病。番茄在栽培环节，难以达到严格隔离和单品种成片种植要求，容易受到外来花粉的污染，导致种子纯度下降，种子质量难以控制，给生产带来重大损失。种子纯度定义为本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率。目前市场上广泛用的种子均为杂交种，根据国家制定的《农作物种子质量标准》(GB16715.3.2010)的规定，番茄杂交种的纯度不低于96％。所以番茄种子在上市之前进行纯度鉴定是质量控制的要求。

现在番茄品种纯度鉴定主要依赖于传统的田间小区种植鉴定方法(Grow-outTest)和SSR(Simple Sequence Repeat,简单重复序列)标记法。田间种植鉴定把品种种植于田间测试小区，通过观察植株不同生长时期(苗期、生长、花期、成熟期以及种子)的植物学形态特征(如植株的高矮及大小、分蘖、叶色、叶形、种子大小、种皮颜色等)和生物学特性(如植株的生育期、光周期、抗病性、抗旱性、种子落粒性等)的不同来鉴定该番茄品种的纯度。此方法取决于对植物在田间的形态特征和生物学特性的视觉识别，判断标准往往很难精确量化，主观性强，检测灵敏度和分辨力低；易受环境和栽培条件影响，准确性和稳定性差；耗时长、时效性差；需投入大量人力、物力，成本高。

DNA分子标记是直接反应DNA差异(多态性)的一种遗传标记，主要包括SSR(SimpleSequence Repeat,简单重复序列)和SNP(Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性)等。SSR目前已经成为纯度和品种真实性检测的主要方法之一，在多种作物如水稻，番茄、大豆等都有SSR的国标，目前SSR大面积使用有它的优势，包括具有实验室操作简单，成本低，重复性较好，结果真实可靠等。比较起SSR标记法，SNP标记法技术更简单，易于自动化，检测通量高，速度快；单位数据点检测成本低；不同检测实验室的数据结果可以相互比较验证，数据具有普适的可比性；是快速、简便、灵敏、准确、稳定、低成本鉴定品种纯度的最常用方法。但是目前基于SNP标记的番茄纯度检测方法鲜见报道。现在用于番茄纯度检测的SSR标记法所用的SSR标记数目很少，而且用于筛选这些SSR标记的番茄材料少，遗传多样性窄，这些筛选的SSR标记只在特定材料中具有高多态性，只能用于特定品种的纯度检测，不能用于不同遗传来源的番茄品种(系)纯度的普适性精准检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种快速、高效、低成本、精准度高、普适性高的检测番茄品种纯度的KASP标记引物组及其应用，并提供检测番茄品种纯度的方法、筛选检测番茄品种纯度的SNP标记的方法以及检测番茄品种纯度的试剂盒。本发明是基于Douglas Array Tape平台的KASP(KompetitiveAllele Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)检测技术，检测方法简单、自动化程度高、通量高、速度快，试剂用量少，检测成本低。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种检测番茄品种纯度的KASP标记引物组，所述KASP标记引物组用于分别扩增如下的SNP位点组：

SNP位点LY001：位于番茄参考基因组第1染色体第534265581位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为G或A；

SNP位点LY002：位于番茄参考基因组第2染色体第643102010位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为A或C；

SNP位点LY003：位于番茄参考基因组第3染色体第3958512位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为G或A；

SNP位点LY004：位于番茄参考基因组第4染色体第16865489位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为C或T；

SNP位点LY005：位于番茄参考基因组第5染色体第12076633位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为T或G；

SNP位点LY006：位于番茄参考基因组第6染色体第69251621位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为A或G；

SNP位点LY007：位于番茄参考基因组第7染色体第61219689位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为A或C；

SNP位点LY008：位于番茄参考基因组第8染色体第749024987位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为G或A；

SNP位点LY009：位于番茄参考基因组第9染色体第578414376位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为T或C；

SNP位点LY010：位于番茄参考基因组第10染色体第715512695位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为T或C；

SNP位点LY011：位于番茄参考基因组第11染色体第159349087位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为G或A；

SNP位点LY012：位于番茄参考基因组第12染色体第456087457位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为C或T；

其中，所述番茄参考基因组为番茄S_lycopersicum genome参考基因组；每个SNP位点的扩增引物包括等位基因特异性引物X、Y以及通用引物C，每个特异性引物X、Y均连接有荧光基团，且X连接的荧光基团与Y连接的荧光基团不同。

上述的KASP标记引物组，优选的，所述KASP标记引物组的核苷酸序列如下：

(1)SNP位点LY001的扩增引物(如SEQ ID NO:1～3所示)：

LY001-X：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAATTGGTGTTTTTCTGCAT CTCC；

LY001-Y：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGAATTGGTGTTTTTCTG CATCTCT；

LY001-C：AGAACTTTGAAGTGGTGAATCATGC；

(2)SNP位点LY002的扩增引物(如SEQ ID NO:4～6所示)：

LY002-X：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGAGTTTGCTCAGTTATTCA GGACTC；

LY002-Y：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGAGTTTGCTCAGTTATTC AGGACTT；

LY002-C：AAGCTCGTGCAGGTCAATGTG；

(3)SNP位点LY003的扩增引物(如SEQ ID NO:7～9所示)：

LY003-X：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAACCCCACCAATAGTCATTC CAG；

LY003-Y：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAACCCCACCAATAGTCATT CCAC；

LY003-C：CCAAATCCACAGCTTTTTAGCTTCT；

(4)SNP位点LY004的扩增引物(如SEQ ID NO:10～12所示)：

LY004-X：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGTGCCAGATTTACGGTTCT ATA；

LY004-Y：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGTGCCAGATTTACGGTTC TATG；

LY004-C：CCCTCACTAAAATCCTTCACCATGT；

(5)SNP位点LY005的扩增引物(如SEQ ID NO:13～14所示)：

LY005-X：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGAGCAATCACTGCAACC ACTAATA；

LY005-Y：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGAGCAATCACTGCAACCA CTAATC；

LY005-C：TGATTCTTGATCTGGCATAACACTG；

(6)SNP位点LY006的扩增引物(如SEQ ID NO:15～18所示)：

LY006-X：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGAAGAGGAAGGAAGAGA TACAACAGAA；

LY006-Y：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGAAGAGGAAGGAAGA GATACAACAGAG；

LY006-C：GCTATCATACGATCAGAGCATCAGAC；

(7)SNP位点LY007的扩增引物(如SEQ ID NO:19～21所示)：

LY007-X：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAATTTGCTCGACAATGGC A；

LY007-Y：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAATTTGCTCGACAATGGC G；

LY007-C：AGATCTTGGCTTGTTGGATCAGA；

(8)SNP位点LY008的扩增引物(如SEQ ID NO:22～24所示)：

LY008-X：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGCTTCACCAGAAAGGCAT GT；

LY008-Y：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGCTTCACCAGAAAGGCAT GC；

LY008-C：ATGTAATCACCAACTTCCAAGGTCA；

(9)SNP位点LY009的扩增引物(如SEQ ID NO:25～27所示)：

LY009-X：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGTTTCCCTAATTTCTGCTA TGCCT；

LY009-Y：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTTTCCCTAATTTCTGCTAT GCCC；

LY009-C：CCTTCTCAAGCTCTGCAAGTGTAAA；

(10)SNP位点LY010的扩增引物(如SEQ ID NO:28～30所示)：

LY010-X：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGATTTAAAAGGCGAAAACG ACG；

LY010-Y：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGATTTAAAAGGCGAAAAC GACA；

LY010-C：TCTCCAGAACAAAACCAACAACTTC；

(11)SNP位点LY011的扩增引物(如SEQ ID NO:31～33所示)：

LY011-X：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGTCAAGAAGTGAGCTTAA ACGATAAC；

LY011-Y：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTCAAGAAGTGAGCTT AAACGATAAT；

LY011-C：GATCAATTTTGCCCTTCACTTCTTC；

(12)SNP位点LY012的扩增引物(如SEQ ID NO:34～36所示)：

LY012-X：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCAGGCAAACCAGAGAGA GGG；

LY012-Y：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTCAGGCAAACCAGAGAG AGGA；

LY012-C：CTAAATCATCCTTCACATCCTGCAA。

更优选的，每个特异性引物X均连接有FAM荧光基团，每个特异性引物Y均连接有HEX或VIC荧光基团。

第二方面，本发明提供一种检测番茄品种纯度的试剂盒，包含所述的KAS P标记引物组。

上述的试剂盒，优选的，每个引物组的特异性引物X、特异性引物Y、通用引物C在PCR反应体系中浓度之比为2:2:5，具体用量及浓度可参考实施例1表3的PCR扩增体系。

优选的，所述试剂盒中还包含2×KASP Master Mix和超纯水。

第三方面，本发明提供一种所述的KASP标记引物组或所述试剂盒在检测番茄品种纯度中的应用，也是提供一种检测番茄品种纯度的方法，包括以下步骤：

(1)提取番茄待测样品的总DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用所述的KASP标记引物组进行PCR扩增，然后进行荧光信号扫描、基因型分型；如果样品中只检测到特异性引物X的荧光，则该样品的基因型为纯合等位基因X；如果只检测到特异性引物Y的荧光，则该样品的基因型为纯合等位基因Y；如果同时检测到特异性引物X和Y荧光，则该样品的基因型为杂合；

(3)根据基因型分型结果进行数据分析，得出番茄待测样品的品种纯度。

上述的方法，优选的，所述方法采用Douglas Scientific的Array Tape系统进行；Array Tape基因型分型平台包括用于PCR扩增体系组装的NEXAR、PCR扩增的SOELLEX、荧光信号扫描的ARAYA以及数据分析的INTELLICS。

优选的，PCR扩增体系包括：100μM Primer_C、100μM Primer_X、100μM Primer_Y、2×KASP Master Mix、番茄待测样品的DNA、超纯水；用SOELLEX进行PCR扩增，扩增条件如下：94℃15分钟；94℃20秒，65℃-57℃60秒，10个循环；94℃20秒，57℃60秒，33个循环。

第四方面，本发明提供一种筛选检测番茄品种纯度的SNP标记的方法，包括以下步骤：

步骤S1、收集番茄特异性SNP位点；

步骤S2、对收集到的SNP位点，在已有的番茄参考基因组S_lycopersicum genome上进行位点核对、截取设计序列区间并进行引物设计，对设计的引物进行特异性核查，选出若干SNP位点及设计的引物；

步骤S3、对选出的SNP位点进行合成，并采用现有的番茄材料进行基因分型验证，得到番茄的功能标记连锁标记及资源原始数据；

步骤4、分析所述的功能标记连锁标记及资源原始数据，选出一套标记最少、均匀分布于12条染色体、并能够区分所有番茄材料的标记组合。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明筛选出一套(1SNP/染色体)共12个SNP标记及针对其设计的KASP标记引物组，用于番茄品种纯度的精准鉴定，这12个标记分型质量高、单拷贝、高多态性(在144份现有番茄品种中的PIC值平均高于>＝0.33)、样本数据检出率>98％，可用于来源不同的番茄品种(系)纯度的精准检测，具有广泛的应用普适性。

(2)本发明提供了一种筛选SNP标记的方法，筛选出的SNP标记及其KASP标记引物组可用于来源不同的番茄品种(系)纯度的精准检测，具有广泛的应用普适性。

(3)本发明提供了一种基于Douglas Array Tape平台的KASP(KompetitiveAllele Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)标记检测方法，用于番茄的纯度检测；该检测方法自动化程度高，可达90％，极大减少了实验室的人力及人为错误；检测通量高、速度快，8小时可获得122,880个数据点，是传统的96孔板SNP基因分型方法的10倍；检测反试剂用量少(仅0.8μL/反应)，检测成本低，与传统的96孔板SNP基因分型方法相比，试剂耗材成本降低70％-90％。且检测方法简单、快捷，适用于不同的检测仪器设备。

(4)本发明提供的番茄纯度检测方法基于SNP标记法，具有SNP标记法的所有固有优点；标记为共显性标记，特异性、灵敏度和分辨力高；标记不受环境条件影响，能够使用种子或任何类型的植物组织，检测结果准确、重复性和稳定性好；不同检测实验室和不同的数据结果可以相互比较验证，数据具有普适的可比性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明的研发技术流程；

图2是KASP标记番茄多样性材料中的基因型分型示意图(图中的红色簇表示样品在这个KASP标记位点含有纯合X等位基因，蓝色簇表示样品在这个KASP标记位点含有纯合Y等位基因型，紫色簇表示样品在这个KASP标记位点含有X和Y杂合等位基因型)。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1：

本实施例基于SNP(Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性)标记法，提供了一种筛选高质量、高多态性以及普适性SNP标记的方法，并用此方法筛选出一套SNP标记和用于番茄品种纯度检测的KASP标记引物组。研发技术流程如图1所示，具体如下：

1、番茄特异性SNP位点的搜集

利用illumina份番茄7.7K芯片以及现有番茄研发成果，查看主要的有关番茄的基因所在区域所涉及的SNP位点进行筛选，最后得到超过8000个SNP位点。

2、番茄SNP位点的设计，筛选及核查

对收集到的8000个SNP的位点，在已有的番茄参考基因组(S_lycopersicumgenome)上进行位点核对截取设计序列区间并进行引物设计，同时对设计的引物进行特异性核查，最后精选出323个SNP位点设计的引物。

3、323个标记的合成及验证

将得到的323个特异性最好的标记位点进行合成，并且选取192份番茄各类资源进行基因分型验证，得到一套番茄的功能标记连锁标记及资源原始数据。

4、12个标记的样品检测、验证及生产应用

通过323个SNP标记构建的核心资源数据库，利用自主构建的生物数据分析软件进行分析，目标为选出一套标记最少，均匀分布于12条染色体，并能够区分所有材料的标记组合，最终挑选出12个用于番茄品种纯度检测的SNP标记：(1个SNP标记/染色体)高质量、单拷贝、高多态性(192份番茄材料中的PIC值都高于>＝0.33)、数据检出率>98％的SNP标记，用于各种不同遗传来源的番茄品种(系)纯度的精准检测。该12个用于番茄品种纯度检测的SNP标记见表1。

表1.12个用于番茄品种纯度检测的SNP位点的信息表

5、12个用于番茄品种纯度检测的KASP标记的序列信息

每个KASP标记由三条引物组成，包括两条等位基因特异性引物X(Allele-Specific Primer X；Primer_X)和Y(Allele-Specific Primer Y；Primer_Y)以及一条通用引物C(Common Primer；Primer_C)。两条等位基因特异性引物分别连接FAM和HEX(或VIC)荧光基团。如果样品中只检测到FAM荧光，则该样品的基因型为纯合等位基因X(Allele_X)；如果只检测到HEX荧光，则该样品的基因型为纯合等位基因Y(Allele_Y)；如果同时检测到FAM和HEX荧光，则该样品的基因型为杂合(同时带有等位基因X和Y)。12个用于番茄品种纯度检测的KASP标记的等位基因型和引物序列见表2，各引物序列依次如SEQ ID NO:1～36所示。

表2.12个用于番茄品种纯度检测的KASP标记的等位基因型(Allele_X、Allele_Y)和引物序列

实施例2：

实施例1的KASP标记引物组在检测番茄品种纯度中的应用(即检测番茄品种纯度的方法)，具体操作如下：

1、提取番茄待测样品的总DNA。

1)将番茄种子样品单粒加入1.3ml的96孔板中，加入2粒4mm钢珠盖上密封的硅胶盖；

2)在组织研磨仪器上1400转/分进行高速研磨；

3)去掉硅胶盖，在1.3ml的96孔板中加入500μL DNA提取裂解液，并热封膜密封；

4)在水浴锅温浴1小时，拿出3600转/分离心10min；

5)采用半自动移液器转移上清400μL放入新的2ml96孔板；

6)加入等体积磁珠提取液进行磁珠吸附；

7)用磁力棒进行磁珠吸附，并转移到新的装有洗液的96孔板清洗(重复一次)；

8)用洗脱液在65度预热情况下溶解磁珠上DNA5分钟；

9)用磁力棒吸取溶解完的磁珠，完成DNA提取；

10)对样品进行OD值质控，合格后备用。

2、用Douglas Scientific的Array Tape系统进行KASP标记的验证和检测；ArrayTape基因型分型平台包括用于PCR扩增体系组装的NEXAR、PCR扩增的SOELLEX、荧光信号扫描的ARAYA以及数据分析的INTELLICS；

1)将提取合格的DNA样品用移液站从96孔板转移至384的工作板上；

2)用NEXAR1进行DNA模板分板，每个膜加入0.8μL DNA，并进行烘干处理；

3)用NEXAR2进行体系构建，将12个引物反应体系(含引物和master mix以及水)配置在专用的96孔板中，用高精度钢珠吸取后喷在对应膜孔位置，每个孔位喷0.8μL，并进行压力封膜；

4)用SOELLEX进行水浴PCR；

5)完成PCR后，用ARAYA进行膜的扫描；

6)扫描完成，电脑登录INTELLICS网页进行数据的质控和导出分析。

PCR扩增体系：用NEXAR进行PCR扩增体系的自动组装，PCR扩增体系如下表3所示；

表3.KASP标记基因型分型的PCR扩增体系

PCR扩增：PCR用SOELLEX进行PCR扩增，扩增条件如下：94℃15分钟；94℃20秒，65℃-57℃(每个循环退火温度降低0.8℃)60秒，10个循环；94℃20秒，57℃60秒，33个循环。

3、信号扫描和基因型分型：PCR反应完成后用ARAYA进行反应体系荧光信号扫描；然后用INTELLICS进行基因型分型和数据分析。在KASP标记基因型分型检测中，样品的基因型分成3簇，分别为X簇、Y簇以及杂合基因型簇(见图2)。其中X簇表示样品在这个KASP标记位点含有纯合X等位基因(分型图中标为红色，位于图形左上角)，Y簇表示样品在这个KASP标记位点含有纯合Y等位基因型(分型图中标为蓝色，位于图形右下角)，杂合基因型簇表示样品在这个KASP标记位点含有X和Y杂合等位基因型(分型图中标为紫色)。典型的KASP标记基因型分型图见图2。

12个用于番茄品种纯度检测的KASP标记的基因型分型质量验证：用21个市场上的番茄品种用12个KASP标记进行验证。经验证，每个KASP标记的二个纯合和杂合簇分型好、紧凑，位点为单拷贝且检出率都高于98％，12个KASP标记的基因型分型质量完全能满足番茄品种纯度的精准检测。典型的KASP标记基因型分型图见图2。

基于Douglas Array Tape平台的KASP标记检测优点：基于Douglas Array Tape平台的KASP标记自动化程度达90％，极大减少了实验室的人力及人为错误。检测通量高，8小时可获得122,880个数据点，是传统的96孔板SNP基因分型方法的10倍。检测反应体积低少(仅0.8μL/反应)，与传统的96孔板SNP基因分型方法相比，试剂耗材成本降低70％-90％。