基于MnO2纳米片和7-羟基香豆素的ZEN双模式检测试剂盒和方法

技术领域

本发明属于玉米赤霉烯酮检测技术领域，具体涉及一种基于MnO

背景技术

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)是镰刀菌属真菌产生的一种有毒次生代谢产物，主要污染玉米、高粱、小麦、大麦等粮谷类作物，且在食品及饲料加工过程中也不易被破坏。ZEN广泛存在于谷物及其衍生产品中，影响植物的正常生长状况，同时还会对动物机体产生生殖毒性、免疫毒性以及致癌性等不良影响，严重时会导致动物机体死亡。

为了保障人们的身体健康以及维护食品安全，目前大部分国家对食品、谷物、饲料中的ZEN含量都有十分严格的规定，如GB13078-2017《饲料卫生标准》中规定饲料原料以及饲料产品中ZEN最大检出量不得高于1.5mg/kg，GB2761-2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》中限定ZEN的检出量不得超过60μg/kg。

玉米赤霉烯酮的的国际标准分析方法为液相色谱-质谱联用法(LC-MS)，该方法具有良好的精确度、灵敏度和可重复性，但还具有样品前处理复杂、所需仪器设备昂贵以及对专业操作人员要求高等问题，不足以进行大规模和现场的快速分析。酶联吸附免疫法(ELISA)是建立在抗原与抗体特异性结合基础上的一种方法，具有高灵敏度和高准确性，实验操作相对简单，故被广泛用于生物检测领域中。

发明内容

基于此，本发明旨在开发一种检测ZEN的免疫分析方法，以实现食品、饲料等产品中ZEN含量准确、快速、简便地检测。

为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：

本发明第一方面提供了一种基于MnO

优选地，在上述检测试剂盒中，ZEN抗原为牛血清白蛋白偶联ZEN的完全抗原(记为BSA-ZEN)。

优选地，在上述检测试剂盒中，底物混合液具体为包含MnO

基于上述检测试剂盒，本发明第二方面构建了基于MnO

S1、将ZEN抗原包被在酶标板上；

S2、将待测样品与ZEN单克隆抗体加入S1制备的酶标板中，孵育后洗涤拍干；

S3、加入碱性磷酸酶标记的IgG抗体，孵育后洗涤拍干；

S4、加入底物混合液孵育后，在360nm激发光下测量466nm处的荧光强度，并测量380nm下的吸光度；

S5、根据荧光强度、吸光度和标准曲线计算待测样品中ZEN的浓度。

在上述检测方法中，底物混合液中的MnO

在上述检测方法中，基于底物混合液，可采用棋盘滴定法确定ZEN抗原最佳包被浓度以及ZEN单克隆抗体的最佳加入浓度。实施例数据表明，ZEN抗原的包被浓度优选为0.725μg/mL，ZEN单克隆抗体的浓度优选为6μg/mL。

在上述检测方法中，步骤S4中底物混合液的孵育条件为：常温(20～30℃)下孵育10～20min。

在上述检测方法中，步骤S5中的标准曲线包括荧光法标准曲线和比色法标准曲线，其中：

荧光法标准曲线以ZEN浓度为横坐标，以ΔF为纵坐标，ΔF为存在不同浓度ZEN时的荧光强度值与不存在ZEN时的荧光强度之差；

比色法标准曲线以ZEN浓度为横坐标，以ΔA为纵坐标的，ΔA为存在不同浓度ZEN时的吸光度值与不存在ZEN时的吸光度值之差。

本发明基于间接竞争原理，构建了由MnO

相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明开发的检测试剂盒和检测方法能够对ZEN同时进行荧光和比色双信号检测，双信号之间可以进行相互校准和验证，提高了检测结果的准确性，可以有效避免假阳性或假阴性结果的产生；检测过程简单易行，可用于实际玉米样品中ZEN的检测且样品前处理操作简单，在实际应用中更具有灵活性和广泛性；而且，实施例数据表明，本发明开发的双模式免疫分析法对ZEN的检测具有良好的选择性，特异性高。

附图说明

图1为本发明开发的基于MnO

图2为实施例1中不同处理组样品的荧光发射光谱和紫外可见光吸收光谱的对比图；

图3为实施例2中不同浓度MnO

图4为实施例2中不同浓度AAP下7-羟基香豆素的荧光强度变化图；

图5为实施例2中不同底物孵育时间下7-羟基香豆素的荧光强度变化图；

图6为实施例2中绘制的比色免疫法测定ZENde标准曲线(A)和荧光免疫法测定ZEN的标准曲线(B)；

图7为实施例3中采用本发明双模式免疫分析法对ZEN和其他真菌毒素的检测结果对比图。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

下述实施例中，若无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

本例提供的检测试剂盒包括酶标板，ZEN-BSA，mAb，IgG-ALP和底物混合液，其中底物混合液具体为含有AAP、7-羟基香豆素、MnO

利用上述检测试剂盒检测ZEN的原理如图1所示：酶标板上包被的ZEN-BSA与待测样品中的ZEN竞争结合mAb，形成复合物BSA-ZEN-mAb和ZEN-mAb，除去ZEN-mAb后向酶标板加入IgG-ALP，生成免疫复合物BSA-ZEN-mAb-IgG-ALP；该免疫复合物中的ALP催化AAP生成AA，AA将MnO

本例通过以下试验进一步验证了上述检测原理的可行性：

准备四组样品，分别为：(a)50μM 7-羟基香豆素，(b)500μg/mLMnO

结果如图2所示，其中2-A为7-羟基香豆素的激发光谱(曲线③)和发射光谱(曲线②)以及MnO

从图2-A中7-羟基香豆素的激发光谱可知，其最大激发波长为360nm；从图2-A中7-羟基香豆素的发射光谱可知，其最大发射波长为466nm；从图2-A中MnO

由图2-B和图2-C可知，单独存在的7-羟基香豆素具有很强的荧光强度(图2-B中曲线a)，但不存在吸收峰(图2-C中曲线a)；而单独存在的MnO

以上结果表明本发明的检测试剂盒应用到免疫学分析中是可行的。

实施例2

基于实施例1中提供的检测试剂盒，本例在优化底物中MnO

本例包括以下试验过程：

(1)底物液中MnO

根据本发明检测ZEN方法的原理可知，MnO

将不同浓度的MnO

检测结果如图3所示：随着MnO

(2)底物液中AAP浓度的优化。

AAP的浓度直接影响AA生成的含量，故AAP的浓度也是决定ZEN检测效果的关键因素之一。

将不同浓度的AAP水溶液，加入到含有300μg/mLMnO

结果如图4所示：随着AAP浓度的增加，荧光强度逐渐上升，其中浓度为60mM时荧光强度不再继续升高，说明此时AAP水解生成的AA含量已经达到最大，无需更高浓度的AAP进行水解。因此选择60mM为最佳AAP工作浓度。

(3)抗原抗体浓度优化。

采用棋盘法优化最佳抗原抗体浓度。用CBS缓冲液(pH9.6)将BSA-ZEN从浓度为12μg/mL倍比稀释至浓度为0.3625μg/mL，并用PBS缓冲液(10mM,pH7.4)将mAb从24μg/mL倍比稀释至0.3625μg/mL，进行以下检测：

将不同浓度的BSA-ZEN包被在96孔酶标板中，用PBST缓冲液(10mM PBS缓冲液，5％Tween 20)洗涤三次后拍干；加入不同浓度的mAb至酶标板中，室温孵育后，用PBST缓冲液洗涤拍干；随后每孔加入100μL 50mU/mL IgG-ALP，室温孵育后，用PBST缓冲液洗涤拍干；加入200μL底物混合液(含有300μg/mLMnO

棋盘滴定法得到的结果如表1和表2所示，选取荧光强度和吸光度值发生显著性变化的抗原抗体浓度，由此确定BSA-ZEN的最佳包被浓度为0.725μg/mL，ZEN抗体浓度为6μg/mL。

表1比色法确定BSA-ZEN和mAb最适工作浓度

表2荧光法确定BSA-ZEN和mAb的最适工作浓度

(4)IgG-ALP和AAP的反应时间优化。

为了节约时间成本，本例进一步对反应时间进行了优化。设定IgG-ALP与底物混合液的反应时间分别为2、4、6、8、10和12min，测量荧光强度。

结果如图5所示：随着反应时间的增加，荧光强度逐渐上升，当反应时间为10min时，荧光强度不再发生显著性变化，表明此时AAP水解程度达到最大。因此，选择10min作为最佳反应时间。

(5)优化后的ZEN检测过程，具体为：

①先将BSA-ZEN用CBS缓冲液(pH9.6)稀释为0.725μg/mL，于室温条件下包被至酶标板中孵育1.5h，用PBST缓冲液洗涤三次后拍干；

②将待测样品与用PBS缓冲液(10mM,pH7.4)稀释的mAb(6μg/mL)加入至酶标板中，于室温条件下孵育1h，用PBST缓冲液洗涤后拍干；

③每孔加入100μL IgG-ALP(50mU/mL)于室温下孵育1h后，用PBST缓冲液洗涤拍干；

④加入200μL底物混合液(含有300μg/mLMnO

⑤使用酶标仪，在360nm激发光下记录466nm处的荧光强度，并于380nm单波长下测量样品的吸光度值。

(6)灵敏度和线性检测范围的确认。

按照步骤(5)，通过建立标准曲线来确定该比率荧光免疫分析法的灵敏度和线性检测范围。测定得到不同浓度ZEN标准品下的荧光强度和吸光度，计算ΔF和ΔA，其中ΔF为存在不同浓度ZEN时的荧光强度与不存在ZEN时的荧光强度之差，ΔA为存在不同浓度ZEN时的OD值与不存在ZEN时的吸光度值之差。

以ZEN浓度为横坐标，ΔA为纵坐标，建立比色法标准曲线方程。结果如图6-A所示，比色免疫法测定ZEN的曲线方程为y＝0.0299x+0.0605，相关系数(R

以ZEN浓度为横坐标，ΔF为纵坐标，建立荧光法标准曲线方程。结果如图6-B所示，荧光免疫法测定ZEN的曲线方程为y＝9.337x-14.838，相关系数(R

实施例3

根据实施例2构建的检测方法、最佳检测条件以及标准曲线，本例对玉米谷物中可能存在的其他真菌毒素进行特异性实验，以验证该免疫方法对ZEN的选择性。

分别取200ng/mL的五种不同真菌毒素：黄曲霉毒素B1(AFB1)、呕吐毒素(DON)、伏马毒素B1(FB1)、赭曲霉毒素A(OTA)、T-2毒素(T-2)的标准品进行特异性分析。采用上述溶液分别替代5ng/mL ZEN，进行双模式免疫分析。

通过检测五种真菌毒素AFB1、AFM1、FB1、T-2、OTA和ZEN的交叉反应，评估双模式免疫分析法的选择性。结果如图7所示：图7-A显示ZEN的吸光度值远远超过其他真菌毒素的吸光度值，图7-B显示ZEN的荧光强度较其他几种真菌毒素的荧光强度而言明显最小。这说明该建立的双模式免疫分析法对检测ZEN具有极高的选择特异性。

实施例4

本例以实际玉米面样品为例，根据实施例2构建的检测方法、最佳检测条件以及标准曲线进行检测分析。本例检测过程如下：

(1)称取玉米面样品0.2g，分别添加浓度为40、100和160ng/mL ZEN标准品溶液。

(2)加入1mL萃取缓冲液(0.7mL甲醇和0.3mL水)，摇晃5min和超声处理20min后，在4,000g下离心10min取上清液，

(3)将上清液稀释20倍，按照实施例2步骤(5)依次对加标样品进行分析。

(4)通过线性方程计算样品中ZEN含量，并计算回收率(测定ZEN浓度/加入ZEN浓度×100％)和变异系数(CV，标准偏差/平均值×100％)。

结果如表3所示：玉米面样品中ZEN的浓度为未检出，该方法的回收率在96.65％～139.38％之间，符合实验要求，显示本方法可以用于实际样品的检测。

表3玉米面样品中ZEN的回收率

综上所述，本发明提供的检测试剂盒和检测方法能够实现ZEN的双信号检测，而且操作简便，准确度高，特异性高，可以用于谷物及其加工品中ZEN的检测，为谷物中ZEN残留检测提供了一种新方法。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。