一种生物合成二糖基纳塔霉素工程菌的构建及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生物合成二糖基纳塔霉素工程菌的构建及其应用。

背景技术

纳塔霉素属于多烯大环内酯类抗生素，此大类抗生素具有极好的抗真菌活性，但溶血性和水溶性差极大地限制了其临床应用，因此一些研究者通过制备多烯类抗生素脂质体和化学衍生物的策略解决这一问题，也有研究者将目光投入到了生物合成途径的改造中，希望通过改造PKS(polyketide synthase)后修饰的羧基、糖基、羟基或是大环骨架上的共轭双键来合成综合性质更优的多烯大环内酯类抗生素衍生物。

NPP A

纳塔霉素分子的化学结构可以概括为一个具有疏水区域头部和侧链发色团以及亲水区域尾部和另一侧多元醇区域的大环内酯。其中尾部的半缩酮结构可以维持纳塔霉素分子的立体构型，该构型能够为纳塔霉素的生物活性提供保障，而发色团区域的共轭双键则可以为该分子的立体构型提供刚性，并有利于多元醇区域内羟基和环氧基团的有序排布。烯醇式和酮式的结构特点决定了纳塔霉素水溶性低且在水溶液中容易形成微团聚集物的特性，这导致纳塔霉素在组织器官中分布不均匀且不易代谢，因此在临床应用中纳塔霉素大多是外涂药物而非注射或口服药物。因此合成水溶性高的纳塔霉素衍生物将会大大改善其药用价值。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术存在中纳塔霉素存在的缺点与不足，提供一种纳塔霉素衍生物二糖基纳塔霉素、能够生物合成二糖基纳塔霉素的链霉菌菌株及其构建方法，以及衍生物二糖基纳塔霉素的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种纳塔霉素衍生物，其为结构如下所示的二糖基纳塔霉素。

一种生物合成二糖基纳塔霉素的链霉菌工程菌，为异源表达nppY基因的产纳塔霉素链霉菌。进一步地，所述的产纳塔霉素链霉菌为褐黄孢链霉菌(S.gilvosporeus)。

所述的生物合成二糖基纳塔霉素的链霉菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：构建nppY基因表达质粒，通过接合转移将nppY基因表达质粒转入产纳塔霉素链霉菌，经过抗性筛选获得异源表达nppY基因的产纳塔霉素链霉菌，即得到生物合成二糖基纳塔霉素的链霉菌工程菌。

上述生物合成二糖基纳塔霉素的链霉菌工程菌在生产二糖基纳塔霉素中的应用。

一种生产二糖基纳塔霉素的方法，包括如下步骤：将生物合成二糖基纳塔霉素的链霉菌工程菌种子接种到发酵培养基中进行发酵，得到含二糖基纳塔霉素的发酵产物。所述的发酵的条件优选为28℃发酵102～108h。

进一步地，所述的生产二糖基纳塔霉素的方法还包括二糖基纳塔霉素的分离纯化，所述的分离纯化的方法包括如下步骤：

(1)将发酵产物离心保留上清部分，并用甲醇对沉淀进行萃取。

(2)将沉淀萃取液与步骤(1)收集的上清进行充分混合后再次离心，收集上清液。

(3)将上清液中的甲醇除去。

(4)将剩余溶液充分静置后、离心收集上清液，使用C

本发明的二糖基纳塔霉素的水溶性相对于纳塔霉素提高了107.6倍，溶血毒性下降为纳塔霉素的1/10，抗真菌活性为纳塔霉素的1/2，二糖基纳塔霉素的T值(综合性质评分)要优于纳塔霉素，其可用于制备抗真菌药物。

一种抗真菌药物，包含二糖基纳塔霉素。

本发明的优点和有益效果：本发明成功构建了生物合成二糖基纳塔霉素的链霉菌工程菌，得到了水溶性提高的纳塔霉素衍生物。通过本发明提供的方法能够得到纯度95％以上的二糖基纳塔霉素。二糖基纳塔霉素T值(综合性质评分)优于纳塔霉素，在抗真菌方面有很好的应用前景。

附图说明

图1是pSPU214-nppY质粒构建示意图。

图2是pSET152-nppY质粒构建示意图。

图3是S.gilvosporeus和S.gilvosporeus:nppY的发酵产物HPLC图。A：S.gilvosporeus发酵产物的HPLC分析；B：S.gilvosporeus:nppY发酵产物的HPLC分析；C：S.gilvosporeus:nppY各产物的光谱吸收特征；D：新产物与纳塔霉素的光吸收曲线对比；1为极性大的副产物，2为纳塔霉素，3为新产物。

图4是不吸水链霉菌ΔnysRIV与表达nppY不吸水链霉菌ΔnysRIV的发酵产物HPLC分析图。上侧对应不吸水链霉菌ΔnysRIV的发酵产物，下侧对应表达nppY基因的不吸水链霉菌ΔnysRIV的发酵产物；2min处紫外吸收峰面积增加说明大极性副产物增加；1为四霉素B产生的紫外吸收峰；2为四霉素A产生的紫外吸收峰。

图5是不吸水链霉菌S91-S与表达nppY不吸水链霉菌S91-S的发酵产物HPLC分析图。上侧对应不吸水链霉菌S91-S的发酵产物，下侧对应表达nppY基因的不吸水链霉菌S91-S的发酵产物；2min处紫外吸收峰面积增加说明大极性副产物增加；1为制霉菌素产生的紫外吸收峰。

图6是纳塔霉素摩尔浓度曲线。

图7是S.gilvosporeus:nppY发酵新产物的纯化步骤和HPLC分析。A：纯化步骤；B：纯化后样品的HPLC分析。

图8是S.gilvosporeus:nppY发酵新产物二糖基纳塔霉素的MS谱。

图9是S.gilvosporeus:nppY发酵新产物的

图10是S.gilvosporeus:nppY发酵新产物二糖基纳塔霉素的结构。

图11是二糖基纳塔霉素和纳塔霉素的抑菌活性。

图12是二糖基纳塔霉素和纳塔霉素的溶血活性。A：被溶解的红细胞上清；B：纳塔霉素的溶血曲线；C：二糖基纳塔霉素的溶血曲线。

图13是S.gilvosporeus:nppY的生长曲线。

图14是S.gilvosporeus:nppY发酵的二糖基纳塔霉素产量与时间和温度之间的关系。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1产二糖基纳塔霉素菌株的构建及二糖基纳塔霉素的纯化、鉴定

(1)构建含有启动子与终止子的nppY质粒载体

委托生工生物工程公司合成nppY基因(序列如SEQ ID NO.1所示)并克隆在pUC57质粒的NcoⅠ和HindⅢ酶切位点之间。在pM1质粒(pM1质粒的构建见文献：Zheng Wu,WenliGao,Shaotong Zhou,Zhaolin Wen,Xianpu Ni,Huanzhang Xia*.Improving gentamicin Band gentamicin C1a production by engineering the glycosyltransferases thattransfer primary metabolites into secondary metabolitesbiosynthesis.Microbiological Research,2017,203:40-46.)中kanM1基因同样克隆在NcoⅠ和HindⅢ酶切位点之间，且与PhrdB启动子和t

如图1所示，利用NcoI和HindⅢ同时酶切含有PhrdB启动子与t

使用NcoI和HindⅢ酶切验证构建的pSPU241-nppY质粒，电泳后可观察到大小为1442bp的nppY基因片段，证明所获得的质粒正确。

(2)位点特异性重组质粒pSET152-nppY构建

使用BglII酶切pSPU241-nppY质粒，回收2300bp左右的PhrdB-nppY-t

使用BamHI酶切质粒pSET152并对回收产物进行去磷酸化处理。再用T4-DNA连接酶将含有nppY基因的片段与pSET152载体连接，获得能将nppY基因以及PhrdB启动子、t

使用NcoI和HindⅢ酶切构建完成的pSET152-nppY质粒，电泳后可观察到1442bp的nppY基因片段，证明质粒构建正确。

(3)构建表达nppY基因的链霉菌

将获得的pSET152-nppY质粒转化入大肠杆菌ET12567(pUZ8002)，筛选Am

以E.coli ET12567(pUZ8002，pSET152-nppY)为供体菌，产纳塔霉素的褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus，S.gilvosporeus)ATCC13326、产四霉素的不吸水链霉菌ΔnysRⅣ(ΔnysRⅣ为在不吸水链霉菌CGMCC 4.7082中敲除制霉菌素生物合成基因簇内正调控基因nysRⅣ，阻断制霉菌素产生，使其产四霉素)、产制霉菌素的不吸水链霉菌S91-S(S91-S的构建见文献：Ren,J.,Cui,Y.,Zhang,F.,Cui,H.,Ni,X.,Chen,F.,Li,L.,&Xia,H.(2014).Enhancement of nystatin production by redirecting precursor fluxesafter disruption of the tetramycin gene from Streptomycesahygroscopicus.Microbiological Research,169(7–8),602-608)为受体菌进行接合转移和Am

(4)发酵产物的HPLC分析

将上面获得的表达nppY基因的链霉菌在斜面培养基(20g可溶性淀粉，0.5gK

将发酵产物离心10min(3500r/m)分离上清和沉淀，保留上清并使用10mL甲醇对沉淀萃取30min。使用HPLC对发酵液上清和沉淀萃取液进行分析。

与S.gilvosporeus相比，S.gilvosporeus:nppY的发酵产物中包含一个新的紫外吸收峰(图3B，8min处，标号为3)，这说明S.gilvosporeus:nppY可发酵出新产物，且新产物的极性大于纳塔霉素，且新产物的光谱吸收特征与纳塔霉素相同(图3C、D)。而ΔnysRⅣ:nppY的发酵产物与ΔnysRⅣ相比并没有区别，没有发酵出新产物(图4)；S91-S:nppY的发酵产物与S91-S相比并没有区别，没有发酵出新产物(图5)。

新产物的光谱吸收特征与纳塔霉素相同，因此同样物质量的新产物与纳塔霉素在HPLC分析中能显示出大小相同的峰面积，选择使用梯度物质量浓度的纳塔霉素标准品进行HPLC分析，并使用紫外吸收峰面积对物质量浓度作图并拟合(图6)，绘制出对两者都适用的摩尔浓度曲线以方便新产物的后续分析，该曲线适用的峰面积区间为337～37321。

(5)新产物的纯化

对S.gilvosporeus:nppY的发酵液上清与沉淀萃取物进行了几次HPLC分析发现上清液中包含的新产物浓度更高。

第一步，S.gilvosporeus:nppY接种到发酵培养基中于28℃培养96h进行发酵，离心保留上清部分，并使用与沉淀等体积的甲醇对沉淀进行30min萃取。第二步，将沉淀萃取液与第一步收集的上清进行充分混合后再次离心，收集上清液。第三步，旋蒸回收的上清液将溶剂中的甲醇挥尽。第四步，将剩余溶液静止于4℃冰箱过夜。第五步，离心并收集上清液，使用C

新产物通过摇瓶发酵的产量可达0.13g/L，经过上述纯化新产物的浓度至少可达到0.19mg/mL。

(6)新产物的鉴定

收集纯化的新产物，通过旋蒸、冻干的方法除去样品中的水及甲醇，同时对新产物进行了MS分析，结果显示该物质[M+H]

而后使用氘代甲醇(CD

实施例2二糖基纳塔霉素的性质鉴定

(1)水溶性鉴定

配制10mmol/L的Tris-HCl溶液，pH 7；取1mg二糖基纳塔霉素和1mg纳塔霉素分别溶于50μL和500μL的Tris-HCl溶液；充分震荡、超声15min待溶液饱和；离心10min(10000r/min)，取上清，为避浓度过高导致样品没有完全在色谱柱中洗脱或是光吸收信号量超出检测池量程，在上样前对二糖基纳塔霉素进行了50倍的稀释，通过HPLC分析结果并结合绘制的摩尔浓度曲线，计算出纳塔霉素在水中的溶解度(S)为34.4μg/mL，二糖基纳塔霉素在水中的溶解度(S)为3.7mg/mL，根据这一结果可得出二糖基纳塔霉素的水溶性比纳塔霉素提高了107.6倍，说明第二糖基的添加大幅度提高纳塔霉素的水溶性。

(2)抗真菌活性鉴定

将纯化后的二糖基纳塔霉素浓缩至10.7μg/mL并对其进行了梯度稀释，每次将浓度减少至原来的一半，稀释的最低浓度为0.1675μg/mL，在96孔板中使用90μL酵母培养基(2g蛋白胨，2g葡萄糖，1g Yeast extract，加蒸馏水定容至100mL)和10μL经过稀释的抗生素样品接种酿酒酵母，每孔1000CFU；28℃培养，16h后测量490nm处的吸光度；使用产生抑菌的抗生素浓度，与490nm处相对于阳性对照所减少吸光度的数值作散点图并添加对数趋势线和标准方程；对酿酒酵母完全抑菌时对应的最低抗生素浓度为MIC值，从生长抑制曲线的50/90％处估算50/90％酿酒酵母被抑制时的MIC值。同时进行了三组抑菌实验，根据曲线得出二糖基纳塔霉素和纳塔霉素的抑菌数据，计算这些数据的平均值得出，二糖基纳塔霉素的MIC值为2.5μg/mL、MIC

(3)溶血活性鉴定

在人血浆中提取红细胞后用生理盐水进行溶解，使红细胞的终浓度为2.5％，而后使用终浓度为5～180μg/mL的纳塔霉素和终浓度为78～2500μg/mL的二糖基纳塔霉素分别进行溶血活性测试并使用酶标仪进行吸光度检测，实验方法如下：

收集血液样本，1mL血液加入1～2mL浓度为0.1～0.2mol/L的EDTA抗凝；

将抗凝血离心10min(3000×g)舍去上清；

加入等体积的生理盐水或PBS缓冲液，轻轻搅拌至混匀；

离心10min(3000×g)舍去上清；

重复上一步骤，以完全清除白细胞和血小板，直到上清透明表示红细胞被洗涤干净(类似于DNA提取)，剩余沉淀部分即为所需红细胞；

使用DMSO制备5mg/mL的抗生素母液；

分别稀释到10～2000μg/mL；

取0.1mL与0.9mL含有2.5％(22.5μL)红细胞的生理盐水悬液混合，并在37℃水浴30min(0.1mL的DMSO为阴性对照)；

离心2min(5000r/min)后测量上清液在545nm处的吸光度(含有2.5％红细胞的生理盐水悬浮液为阳性对照)。

根据下述公式计算出相应浓度下抗生素的溶血率。

溶解后的红细胞上清液如图12A所示，表1对应每孔样品的浓度。随后计算出相应浓度下抗生素的溶血率，再利用这些数据绘制出这两种抗生素的溶血率曲线(图12B、C)，并根据标准方程计算出了纳塔霉素的HC

表1溶血实验对应的抗生素浓度

(4)综合评价

在测量了二糖基纳塔霉素在水溶性、抗真菌活性和溶血活性上的变化后，对它们的综合性质进行评估，参考Won等人提到的抗生素体外治疗指数计算公式(MIC/HC

将得到的MIC、HC

综合性质好的抗生素表现为MIC值小、HC

实施例3产二糖基纳塔霉素菌株的分析

(1)菌株生长状态分析

对产二糖基纳塔霉素菌株的种子生长曲线进行了统计，分别接种12瓶S.gilvosporeus:nppY孢子到种子培养基中并在28℃进行长达72h的种子培养，从第12h起每隔6h取样测量种子湿重(S.gilvosporeus)作为对照，结果表明12h以前种子生长速率底下，12～36h为种子的对数生长期细胞量快速增加，36～42h到了种子的平稳生长期细胞数量开始缓慢增长，54h后进入衰亡期细胞数量开始有所下降，因此42～48h的种子质量最优适合用于发酵培养(图13)。与出发菌株相比，虽然生长曲线形态没有变化，但出发菌株的对数生长期为6～30h，平稳增长期为30～36h，在48h后细胞就开始衰亡，其种子最佳状态在36～42h，也就是说S.gilvosporeus:nppY的生长周期相较于出发菌株延后了6h，此外细胞生长活力相对出发菌株较弱，细胞数量要少于出发菌株。

(2)二糖基纳塔霉素转化效率

S.gilvosporeus:nppY完成发酵培养后，取20μL的上清液和沉淀(包含菌体、培养基和代谢物)萃取物分别进行HPLC分析。根据浓度曲线可以计算出二糖基纳塔霉素浓度在发酵上清液中约占总抗生素浓度的41％左右，在沉淀萃取液中约占总抗生素浓度的33％左右，总体而言S.gilvosporeus:nppY可转化的二糖基纳塔霉素浓度占总抗生素浓度的38％左右(转化效率不受发酵温度和时间影响)。

(3)二糖基纳塔霉素分布情况和产量分析

选择S.gilvosporeus:nppY在28℃或30℃下发酵96～120h进行二糖基纳塔霉素产量分析。HPLC分析结果显示温度与发酵时间并不能影响二糖基纳塔霉素在发酵液的上清与沉淀中的分布情况，通过计算发现每瓶培养基的上清中所包含的二糖基纳塔霉素浓度都是沉淀中的2倍左右(图14)。

另外统计不同条件下的二糖基纳塔霉素产量发现，温度对二糖基纳塔霉素的产量影响较大，S.gilvosporeus:nppY在30℃条件下进行发酵时二糖基纳塔霉素的产量都要比28℃条件下少，因此28℃是S.gilvosporeus:nppY的最佳发酵温度。关于发酵终点，两种温度下发酵出的抗生素产量在96～120h的区间内都呈先上升后下降的趋势，且发酵102～108h时产量最高，因此以此区间作为发酵终点。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。