一种靶向肝癌的纳米颗粒的制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种靶向肝癌的纳米颗粒的制备方法和应用。

背景技术

肝脏是一个“沉默”的内脏，没有神经，不会疼痛，很多患者在确诊肝癌(HCC)时已是(中晚期)末期，5年生存期仅为10.1％。在我国，仅20％～30％的肝癌患者可以通过手术切除，但5年内复发率仍高达60％～70％。发病率和致死率高，仍然是肝癌治疗面临的现状。目前，由于传统的诊断方法和治疗方案在肿瘤应用中的局限性，肝癌早期诊断效率低，死亡率高，因此，迫切需要一种有效的、有针对性的HCC诊断和治疗方案。肿瘤诊疗一体化是一种不仅能提供肿瘤位置、类型和大小的精确信息，还能发挥有效的治疗的方法，在肿瘤治疗领域占主导地位。

基因治疗是一种新兴的抗癌治疗方法，可以通过多种机制靶向肿瘤，因此核酸疗法引起了研究人员的广泛兴趣。基因治疗的重点是将治疗性核酸药物输送到靶细胞中以治疗疾病。特别是在癌症治疗方面，治疗性核酸最近引起了极大的关注。在治疗性核酸中，DNAzyme通过调节特定基因的表达而成为一种有前景的治疗癌症的药物。DNAzyme由一个特定的单链DNA序列组成，它可以通过互补碱基配对与靶mRNA结合，在单个可编程位点上切割mRNA。此外，与siRNA和microRNA等其他核酸药物相比，DNAzyme具有更高的稳定性、更低的成本和更低的免疫原性，有利于临床应用。到目前为止，DNAzyme已经被很好地设计并整合到各种用于癌症诊断和治疗的纳米平台中。

据统计，80％以上的原发性肝癌发生在肝硬化的基础上，端粒酶再激活是恶性转化过程中的关键，因此90％的人类HCC具有端粒酶表达增加。在HCC中，端粒酶激活主要是由于体细胞TERT启动子突变激活，导致TERT基因表达升高。TERT作为端粒酶的催化亚单位和限速酶，其表达水平高低决定端粒酶活性。TERT的表达受多种转录因子调控。在这些转录因子中，Myc是TERT转录的重要调节因子。Myc诱导TERT表达独立于细胞增殖和从头蛋白合成，暗示其对TERT启动子的直接作用。Myc/Max二聚体与TERT启动子中存在的两个E-box结合均匀且特异性。据报道Myc和Mad在TERT基因的正调控和负调控中发挥重要作用。Myc和Mad都可以与Max蛋白相互作用。Myc/Max和Mad/Max二聚体在TERT启动子中竞争结合相同的靶DNA序列(E-box，位于转录起始位点上游+22至+27)。然而，在结合后，Myc/Max和Mad/Max二聚体对转录有相反的影响。因此，利用Mad和Myc对TERT启动子的拮抗作用来调节端粒酶的活性是一种可行的方案。为了将调节Myc和Mad表达的DNA电路装载并随后运输到活的癌细胞中，需要一种载体；这种载体应该具有理想的特性，包括生物稳定性、生物安全性、生物相容性、穿透生物屏障的能力和细胞摄取的高效率。(2，3-二烯丙基)-三甲基氯化铵(DOTAP)具有研究基础广泛、成本相对较低、易于合成的特点，更重要的是，研究显示DOTAP在I期临床试验中具有可接受的安全性，表明DOTAP具有良好的临床应用前景。

阳离子脂质通常具有一个带正电的头部基团，后面是不同组成的疏水尾部，它被广泛应用于传递基因药物，包括DNA、siRNA和质粒传递，扩大了核酸药物的灵活性和可用性。但DOTAP也具有阳离子脂质体普遍存在的缺点，研究表明，阳离子脂质体以正电荷依赖的方式引起急性细胞坏死，高正电荷的阳离子纳米颗粒可能破坏血细胞并导致溶血，阳离子纳米载体通过与Na

发明内容

本发明的目的在于提供一种靶向肝癌的纳米颗粒的制备方法和应用，其通过对DOTAP阳离子脂质体表面修饰生物素化海藻酸钠进行电荷翻转，实现对肝癌细胞的双重靶向性，同时结合治疗性核酸探针，在检测肝癌标志物的同时达到靶向杀伤肝癌细胞的目的。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明提供了一种靶向肝癌的纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备生物素化海藻酸钠；

(2)制备DNA探针；

(3)采用脂质挤出法制备包裹步骤(2)所制得的DNA探针的DOTAP脂质体；

(4)在步骤(3)所制备的DOTAP脂质体中加入步骤(1)所制备的生物素化海藻酸钠，经孵育后制得靶向肝癌的诊疗一体化纳米颗粒。

进一步的，在步骤(1)中，所述生物素化海藻酸钠的制备方法为：

(1)将海藻酸钠溶于去离子水中，得到1-3mg/mL海藻酸钠溶液；

(2)再将Bio和EDC·HCl溶解于5mLDMSO中，得到Bio浓度为1-3mg/mL、DMSO浓度为2-4mg/mL的溶液，20-30℃搅拌30-90min，加入DMAP，使DMAP的浓度为1-2mg/mL，再搅拌30-90min，得到混合物溶液；

(3)将混合物溶液滴入海藻酸钠溶液中，室温反应24-48h，即得生物素化海藻酸钠。

进一步的，在步骤(2)中，所述DNA探针的制备方法为：

(1)将序列分别为SEQ ID NO.1-5的H1，H2，H3，H4和mad干粉探针用DEPC水溶解为50-200μM浓度的液体，置于-20℃避光保存备用；

(2)将H1，H2，H3，H4探针进行梯度退火，以形成发夹结构的探针；

(3)将H1，H2，H3和H4四种形成发夹结构的探针与mad探针分别以1:1-1：3的浓度比例在30-40℃下孵育30-60min，即得。

进一步的，在步骤(3)中，所述包裹DNA探针的DOTAP脂质体的制备方法为：

(1)将DOTAP溶解在不含RNase的超纯水中，使DOTAP的浓度为5-15mg/mL，按DNA探针:DOTAP为1:3-1:4的体积比例配置成混合溶液；

(2)将混合溶液通过挤压法制备包裹DNA探针的DOTAP脂质体，其中在制备过程中所采用的是Avestin聚碳酸酯膜径迹蚀刻膜PC滤膜，挤压次数为3-5次。

进一步的，在步骤(4)中，所述加入的比例为在包裹DNA探针的DOTAP脂质体中按BSA:DOTAP-DNA:为1：3-1:5的体积比加入生物素化海藻酸钠；所述孵育为37℃孵育5-20min。

本发明还提供了一种所述的制备方法所制备得到的纳米颗粒。

本发明还提供了一种所述的纳米颗粒在制备抗癌症药物中的应用。

进一步的，所述癌症为肝癌，包括肝细胞癌、肝内胆管癌、混合型肝癌。

海藻酸钠(SA)是一种广泛使用且易于获得的药用赋形剂，其稳定性、高溶解度、高粘度、安全性和易于生产等优点使其成为一种优良的涂层材料。特别是，研究表明SA可能促进纳米颗粒从溶酶体中逃逸，降低溶酶体中大量的酶对DNA探针稳定性的影响。其次，海藻酸钠由两种异质重复单元组成，β-D-mannuronic acid(M)和α-L-guluronic acid(G)单元，是一种典型的分子链上带有羧基的阴离子聚合物。M单元通过受体-配体相互作用表现出与甘露糖受体的天然免疫和特异性结合能力，G单元的高反应活性，使其可作为生物素的高效键合位点。通过对SA进行生物素修饰后，可实现对肝细胞癌细胞的双重靶向特性，以增强肿瘤累积。

hTR：端粒酶RNA组分，端粒酶利用其自身hTR所携带的RNA为模板，在端粒酶逆转录酶(Telomerase reverse transcriptase，TERT)的逆转录催化下，将端粒重复序列合成到染色体末端，延长或稳定了随着细胞分裂而进行性缩短的端粒，在细胞永生化及恶性肿瘤的发生和发展中起到了重要的作用。hTR在多种肿瘤中均表现出高表达，提示其在致瘤性中的重要作用。因此，hTR的可靠、特异的检测对于癌症的早期诊断具有重要意义。

本发明有益效果在于：

本发明以生物素化的SA(BSA)为DOTAP脂质体涂层材料，实现电荷翻转，在降低纳米材料对细胞本身毒害作用的同时，可提高细胞对DNA探针体系的摄取效率。同时，结合SA与肝癌细胞膜表面高表达的甘露糖受体固有的受体-配体结合作用，和生物素化修饰后的BSA对癌细胞的双重靶向作用，可提高DNA体系的抗癌效果。BSA可促进纳米颗粒从溶酶体中逃逸，保护DNA探针体系的稳定性。结合SA与肝癌细胞膜表面高表达的甘露糖受体固有的受体-配体结合作用，和生物素化修饰后的BSA对癌细胞的双重靶向作用，可提高肝癌细胞对DNA探针体系的摄取效率。

附图说明

图1为BSA的制备示意图；

图2为DNA纳米体系的制备示意图；

图3为BSA@DOTAP-DNA的制备示意图；

图4为透射电镜图，其中A.DOTAPliposome；B.DOTAP-DNA；C.SA@DOTAP-DNA；D.BSA@DOTAP-DNA；

图5为BSA@DOTAP-DNA用于肝癌细胞诊疗示意图；

图6为DOTAP,DOTAP-DNA,SA,BSA,SA@DOTAP-DNA和BSA@DOTAP-DNA的Zeta电位示意图；

图7为DNA探针体系用于检测hTR可行性验证图；

图8为DNA探针体系用于剪切Myc mRNA从而达到下调Myc的可行性验证图；

图9为BSA@DOTAP-DNA用于胞内检测hTR，时间依赖成像；其中，左图为HepG2细胞的Confocal成像，右图为FAM通道的MFI；

图10为DOTAP-DNA，SA@DOTAP-DNA，BSA@DOTAP-DNA三种纳米颗粒进入肿瘤细胞内进行细胞毒性实验结果图。

具体实施方式

下述实验例和实施例用于进一步说明本发明，但不限于本发明。

实施例1

1.BSA的制备

将80.00mg海藻酸钠(SA)溶于40mL去离子水中(海藻酸钠溶液浓度在1-3mg/mL均可)，将9.70mgBio和15.00mg EDC·HCl溶解于5mLDMSO中(Bio浓度在1-3mg/mL、DMSO浓度在2-4mg/mL均可)，25℃搅拌60min，加入5.00mg DMAP(DMAP的浓度在1-2mg/mL均可)，再搅拌60min，将混合物滴入上述ALG溶液中，室温反应48h，形成生物素化海藻酸钠(BSA)，BSA的制备示意图如图1所示。

2.DNAnanosystem的制备

将mad，H1，H2，H3，H4干粉探针用DEPC水溶解为100μM(50-200μM均可)浓度的液体，置于-20℃避光保存备用。将H1，H2，H3，H4探针通过退火buffer分别稀释为5μM的浓度进行梯度退火，以形成发夹探针；

退火buffer：10mM Tris-HCl，pH 7.4，50mMNaCl，100mMKCl，0.5mM MnCl

退火形成发夹结构的H1，H2，H3，H4探针与mad探针分别以1：1(1:1-1：3均可)的浓度比例在37℃(30-40℃均可)下孵育45min(30-60min均可)，形成mad-DNA复合物，即完成DNAnanosystem的制备。DNA纳米体系的制备示意图如图2所示。

其中，mad，H1，H2，H3，H4探针的序列如下所示：

mad(SEQ ID NO.5)：GGACGU GGACGUAGACGU GGACGUG

H1(SEQ ID NO.1)：ACG TCCACG TCC CTT CTCAG/iBHQ1dT/TAGGG TTAGAC GTG GACGTAGAC GTC TAACCC TAAC/i6FAMdT/CGG TCGAAACCTTGG GGGCC

H2(SEQ ID NO.2)：TTT GAGGATCATC CGAGC GTC TAACCC TAACT CGTAGACGTGGAAGTTAGGG TTAGAC GTCTACG TCCAC

H3(SEQ ID NO.3)：TTT GAGGATCATC CGAGC TCCACGTCTACGAGTTAGGG TTA GACGACGTGGACGTG GTC TAACCC TAACT

H4(SEQ ID NO.4)：GTC TAA CCC TAA CT GAG AAG GG AGTT AGGG TTA GACCACGTCCACGTC CGGTCGAAACCTTGG GGGCC

3.采用脂质挤出法制备空DOTAPliposome

首先，将50mg DOTAP溶解在不含RNase的5ml超纯水中。按DNA：DOTAP为1:3(1:3至1:4均可)的体积比例配置成混合溶液。将溶液通过挤压法制备包裹DNA探针的DOTAP脂质体(DOTAP-DNA)，该处滤膜选择的是Avestin聚碳酸酯膜径迹蚀刻膜PC滤膜；挤压4次(3-5次均可)，制成DOTAP脂质体。

4.SA@DOTAP-DNA和BSA@DOTAP-DNA的制备

SA@DOTAP-DNA：将80.00mg海藻酸钠(SA)溶于40mL去离子水中，制成2mg/mL的SA溶液。在DOTAP-DNA中按1：3(1：3至1：5均可)体积比加入SA溶液(SA：DOTAP-DNA)，37℃孵育5min，制备SA@DOTAP-DNA。

BSA@DOTAP-DNA：将80.00mg海藻酸钠(SA)溶于40mL去离子水中。将9.70mg Bio和15.00mg EDC·HCl溶解于5mLDMSO中，25℃搅拌60min，加入5.00mg DMAP，再搅拌60min，将混合物滴入上述ALG溶液中，室温反应48h(24-48h均可)，形成生物素化海藻酸钠(BSA)。在DOTAP-DNA中按1：3(1：3至1：5均可)体积比加入BSA溶液(BSA：DOTAP-DNA)，37℃孵育5min(5-20min均可)，制备BSA@DOTAP-DNA。BSA@DOTAP-DNA的制备示意图如图3所示。

最终所制备得到的DOTAP liposome；DOTAP-DNA；SA@DOTAP-DNA；BSA@DOTAP-DNA的透射电镜图如图4所示。

5.DNA纳米诊疗部分的构建

DNA纳米诊疗部分由mad和四个发夹探针(H1，H2，H3，H4)通过连续退火过程构建而成。当BSA@DOTAP-DNA纳米颗粒进入肝癌细胞，DNA探针被释放到胞质中。肝癌细胞高表达hTR，hTR通过碱基互补配对与H1探针中的teohold区域结合，从而启动由H1，H2，H3，H4组成的HCR。形成HCR产物的同时，MadmRNA脱落，恢复单链，实现MadmRNA的转染，上调Mad。HCR产物的形成使预先包载在四个发夹中的DNAzyme序列重构，形成完整结构。DNAzyme识别切割肝癌细胞中的Myc mRNA，下调Myc。总得来说，肝癌细胞中高表达的hTR作为启动开关，上调Mad的同时下调Myc，从而达到抗肿瘤的作用。BSA@DOTAP-DNA用于肝癌细胞诊疗示意图如图5所示。

DOTAP，DOTAP-DNA，SA，BSA，SA@DOTAP-DNA和BSA@DOTAP-DNA的Zeta电位图如图6所示，可知，DOTAP脂质体Zeta电位表现为正电，对DOTAP-DNA进行表层修饰SA或BSA后，Zeta电位呈负电，表明对DOTAP阳离子脂质体电荷改性成功。

DNA探针体系用于检测hTR可行性验证图如图7所示，可知修饰有FAM-BHQ1荧光基团-淬灭基团对的H1发夹探针，在无hTR靶标时无明显荧光信号产生，当引入hTR后，H1发夹探针的teohold区域通过碱基互补配对与hTR结合从而打开发夹探针，引发HCR，释放荧光信号。

DNA探针体系用于剪切Myc mRNA从而达到下调Myc的可行性验证图如图8所示，可知，在Myc探针序列(与Myc mRNA序列相同)两端修饰Cy3-BHQ2荧光基团-淬灭基团对，在加入hTR作为触发靶标时，产生的HCR产物剪切Myc探针，从而释放荧光信号，表明该DNA探针体系可用于剪切Myc mRNA。

将HepG2细胞传代培养后，取约2×10

取2mL含10％FBS的DMEM培养基加入上述待测细胞，加入100μLBSA@DOTAP-DNA，于37℃且CO

FAM荧光通道反映胞内hTR的表达情况，通过对FAM通道进行定量分析后，可实现对hTR的检测。

采用CCK-8检测纳米材料的细胞毒性。将HepG2细胞接种到96孔板上，24h后，在每个孔中加入不同量的纳米材料。孵育24h后，每孔中加入10μLCCK-8，37℃孵育4h，采用酶标法测定细胞活力，DOTAP-DNA,SA@DOTAP-DNA,BSA@DOTAP-DNA三种纳米颗粒进入肿瘤细胞内进行细胞毒性实验结果图如图10所示。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。