JEV蛋白酶抑制剂的筛选方法和抑制效果评价方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种JEV蛋白酶抑制剂的筛选方法和抑制效果评价方法。

背景技术

流行性乙型脑炎（Japanese encephalitis）简称乙脑，是由流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起的人畜共患自然疫源性疾病。其发病和病死率高，约30%的患者治愈后会留有不同程度的后遗症。JEV属于黄病毒科黄病毒属，是一种单股正链RNA病毒，基因全长为11 kb，可分为I、II、III、IV和V型5种基因型。JEV基因组有一个开放阅读框，编码一条多聚蛋白，此多聚蛋白被切割成3个结构蛋白：衣壳蛋白(C)，前体膜(prM)、包膜蛋白(E)和7个非结构蛋白：NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5。其中NS3的C端具有NTP酶活性和解旋酶活性，N端与NS2B结合为异源二聚体具有丝氨酸蛋白酶活性，切割多聚蛋白内的NS2A/NS2B、NS2B/NS3、NS3/NS4A和NS4B/NS5的连接处。

NS2B/NS3蛋白酶在病毒的复制和组装中起到至关重要的作用，缺失该蛋白酶基因会使感染性的病毒粒子无法繁殖，故JEV的NS2B/NS3蛋白酶是抗病毒药物开发的强有力的药物靶点。目前临床上并无治疗乙型脑炎的特效抗病毒药物。治疗主要是对症的支持治疗和使用广谱的抗病毒药物。因此相应抗病毒药物的开发以及抗病毒药物的筛选评价显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种JEV蛋白酶抑制剂的筛选方法和抑制效果评价方法，无需使用活病毒，安全性好，能够高效、准确、稳定、高通量的进行JEV蛋白酶抑制剂的筛选和抑制效果评价。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种JEV蛋白酶抑制剂的筛选方法，包括以下步骤：

（1）构建共表达改造的GFP和JEV NS2B/NS3蛋白酶的质粒，所述改造的GFP为在野生型GFP上插入JEV NS2B/NS3蛋白酶切割序列而成；

（2）筛选：将待转染细胞铺于多孔板中，然后加入共表达改造的GFP和JEV NS2B/NS3蛋白酶的质粒进行转染，对转染后的细胞进行培养，同时向多孔板中添加不同组的待筛选抑制剂，以不添加待筛选抑制剂的为对照，观察细胞状态及荧光拍照，并检测荧光强度；若与对照相比荧光强度增加，则表示待筛选抑制剂具有抑制效果，荧光强度增加越多则代表待筛选抑制剂的抑制效果越强。

本发明在绿色荧光蛋白（GFP）中插入JEV的NS2B/NS3蛋白酶相关裂解位点的序列，形成改造后的荧光蛋白报告蛋白系统，在该荧光蛋白报告蛋白质粒上，克隆表达JEVNS2B/NS3蛋白酶，可用于筛选蛋白酶抑制剂以及对蛋白酶抑制剂活性的评价，最终形成JEV蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台。本发明能够避免使用JEV活病毒引发的安全性顾虑，对生物安全等级要求低，BSL-1级实验室即可满足实验要求，是高效、准确、稳定、高通量、可重复的用于JEV蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台。

JEV NS2B/NS3蛋白酶切割序列在野生型GFP氨基酸序列上的插入位点包括位点C和位点D；

位点C为野生型GFP氨基酸序列第159~160位氨基酸，或与野生型GFP氨基酸序列相比具有99%以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；

位点D为野生型GFP氨基酸序列第170~171位氨基酸，或与野生型GFP氨基酸序列相比具有99%以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；

所述野生型GFP氨基酸序列见SEQ ID No.1所示。

本发明中，位点C为野生型GFP氨基酸序列第159~160位氨基酸，或与野生型GFP氨基酸序列相比具有99%以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；对应的氨基酸区域指的是与野生型GFP氨基酸序列相比具有99%以上序列一致性的氨基酸序列上与野生型GFP氨基酸序列的第159~160位氨基酸相对应的位置。其它类似表述的地方参考本处释义。

发明人研究发现，在上述两个特定位点（位点C、位点D）插入JEV NS2B/NS3蛋白酶切割序列后，改造的GFP荧光蛋白仍然可以检测到激发荧光。

JEV NS2B/NS3蛋白酶切割序列包括cut1、cut2，cut1氨基酸序列为AGKRSAIS，cut2氨基酸序列为SLKRGRPG。JEV NS2B/NS3蛋白酶切割序列能准确地被JEV NS2B/NS3蛋白酶识别和切割，切割后则会破坏荧光蛋白发光功能，导致荧光淬灭。

位点C上插入的JEV NS2B/NS3蛋白酶切割序列为cut1或cut2；位点D上插入的JEVNS2B/NS3蛋白酶切割序列为 cut2。

一种表达改造的GFP质粒，改造的GFP表达后，仍然可以检测到激发荧光。

改造的GFP质粒的制备方法为：

将野生型GFP的基因序列通过同源重组方式克隆到表达质粒载体的多克隆位点之间构建表达野生型GFP的质粒；

通过同源重组方式，在表达野生型GFP的质粒上的GFP基因序列中插入JEV NS2B/NS3蛋白酶切割序列对应的核苷酸序列，构建表达改造的GFP质粒。

一种共表达改造的GFP和JEV NS2B/NS3蛋白酶的质粒，所述质粒包括表达JEVNS2B/NS3蛋白酶的编码基因序列以及表达改造的GFP的编码基因序列；所述改造的GFP为在野生型GFP上插入JEV NS2B/NS3蛋白酶切割序列而成。改造的GFP荧光蛋白和JEV NS2B/NS3蛋白酶共表达后，JEV NS2B/NS3蛋白酶可以切割改造的GFP荧光蛋白，导致荧光淬灭。若存在有效的蛋白酶抑制剂的情况下，则蛋白酶功能被抑制，无法发挥作用切割JEV NS2B/NS3蛋白酶切割序列，使得荧光蛋白的发光功能得以保留，这便是本发明筛选蛋白酶抑制剂的原理。

一种JEV蛋白酶抑制剂的抑制效果评价方法，包括以下步骤：

（1）构建共表达改造的GFP和JEV NS2B/NS3蛋白酶的质粒，所述改造的GFP为在野生型GFP上插入JEV NS2B/NS3蛋白酶切割序列而成；

（2）评价：将待转染细胞铺于细胞培养皿中，然后加入共表达改造的GFP和JEVNS2B/NS3蛋白酶的质粒进行转染，对转染后的细胞进行培养，同时向细胞培养皿中添加抑制剂，以不添加抑制剂的为对照，观察细胞状态及荧光拍照，并检测荧光强度；荧光强度正向反映抑制剂的抑制效果，荧光强度越高则代表抑制剂的抑制效果越强。

本发明的有益效果是：无需使用活病毒，安全性好，能够高效、准确、稳定、高通量的进行JEV蛋白酶抑制剂的筛选和抑制效果评价。

附图说明

图1是JEV NS2B/NS3蛋白酶切割序列插入野生型GFP三个位点后的荧光图以及共表达改造的GFP和JEV NS2B/NS3蛋白酶的荧光图，GFP15-NS2B/NS3cut1代表在GFP的site15位置插入JEV NS2B/NS3蛋白酶切割序列cut1: SGKRSQIG所形成的改造的GFP，依此类推；pGFP15-NS2B/NS3cut1为表达GFP15-NS2B/NS3cut1的质粒，依此类推；pGFP15-NS2B/NS3cut1-P2A-NS2B/NS3为共表达GFP15-NS2B/NS3cut1和JEV NS2B/NS3蛋白酶的质粒，依此类推。

图2是本发明共表达改造的GFP和JEV NS2B/NS3蛋白酶的质粒示意图。

图3是高通量检测荧光表达情况；01表示pGFP24-NS2B/NS3cut1转染细胞后的三个重复的平均荧光值，02表示pGFP24-NS2B/NS3cut1-P2A-NS2B/NS3转染细胞后三个重复的平均荧光值，03表示pGFP24-NS2B/NS3cut1-P2A-5Xstop-NS2B/NS3转染细胞后的三个重复的平均荧光值。

实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

病毒名称

乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus）；蛋白酶名称：Protease NS2B/NS3；蛋白酶大小750 aa；切割序列大小：8aa。

实施例1：

质粒的构建

（1）构建表达改造的GFP质粒，改造的GFP为JEV NS2B/NS3蛋白酶切割序列插入野生型GFP氨基酸序列所形成，改造的GFP荧光蛋白仍然具有激发发光功能；

首先按照Primer Star酶（Takara）说明书对野生型GFP的编码基因和pcDNA3.1(+)载体（市售）进行PCR扩增。将野生型GFP基因序列（SEQ ID No.4）通过同源重组方式（Uniclone One Step Seamless Cloning Kit试剂盒）克隆到pcDNA3.1(+)载体的多克隆位点（MCS）之间构建pGFP质粒，作为后续的模板。

通过同源重组技术（Uniclone One Step Seamless Cloning Kit试剂盒）在野生型GFP氨基酸序列的不同位置（位点A：site15 158~159aa，位点B：site 20 117~118aa, 位点C：site 24 159~160aa，位点D：site 45 170~171aa）中插入JEV NS2B/NS3蛋白酶切割序列cut1: AGKRSAIS（SEQ ID No.2）和cut2: SLKRGRPG（SEQ ID No.3），cut1和cut2对应的核苷酸序列为gcagggaagagatcagccattagc（SEQ ID No.5）和tccttgaaaaggggaaggcccggg（SEQID No.6），构建质粒pGFP15/20/24/45-NS2B/NS3cut1/2（备注：GFP15/20/24/45以及cut1/2中的“/”代表“或”的意思，下同）。

其中，GFP15- NS2B/NS3cut1为乙型脑炎病毒蛋白酶切割序列NS2B/NS3cut1插入在野生型GFP氨基酸序列158~159aa之间（即氨基酸ADKQ和KNG之间）所形成的改造后的荧光蛋白，pGFP15-NS2B/NS3cut1为表达改造后的荧光蛋白GFP15- NS2B/NS3cut1的质粒，依次类推。

对构建好的pGFP15/20/24/45-NS2B/NS3cut1/2质粒转染293T细胞。转染后每隔24 h观察细胞状态及荧光拍照（图1），并检测荧光强度。

荧光强度检测时，将293T细胞铺于96孔板中，37℃ 5% CO2培养箱中培养过夜；每孔转染0.5ug质粒，做三个重复孔，4-6h后换液；37℃ 5%CO2培养箱中培养48h后，于多功能酶标仪（帝肯贸易有限公司）读取荧光值。

（2）构建共表达改造的GFP和JEV NS2B/NS3蛋白酶的质粒（图2）；

在质粒pGFP15/20/24/45-NS2B/NS3cut1/2基础上，通过同源重组方式，将JEVNS2B/NS3蛋白酶的编码基因序列（SEQ ID No.7）与GFP15/20/24/45-NS2B/NS3cut1/2编码基因序列（改造的GFP）通过2A肽编码基因连接，构建pGFP15/20/24/45-NS2B/NS3cut1/cut2-P2A-NS2B/NS3质粒并转染293T细胞。转染后每隔24 h观察细胞状态及荧光拍照（图1），并检测荧光强度。

荧光强度检测时，将293T细胞铺于96孔板中，37℃ 5% CO2培养箱中培养过夜；每孔转染0.5ug质粒，做三个重复孔，4-6h后换液；37℃ 5%CO2培养箱中培养48h后，于多功能酶标仪（帝肯贸易有限公司）读取荧光值。

由图1可知，质粒pGFP15-NS2B/NS3-cut1，pGFP15-NS2B/NS3cut2，pGFP20-NS2B/NS3-cut1，pGFP20-NS2B/NS3cut2，pGFP24-NS2B/NS3-cut1，pGFP24-NS2B/NS3cut2，pGFP45-NS2B/NS3cut2在转染细胞后，均可以观测到不同强度的激发绿色荧光，其中，pGFP20-NS2B/NS3cut1转染的细胞绿色荧光强度最弱，pGFP45-NS2B/NS3-cut1转染的细胞观测不到激发绿色荧光。表明WNV NS2B/NS3蛋白酶切割序列在野生型GFP以上特定位点插入后所形成的改造的GFP仍然具有激发光功能。同时，除质粒pGFP15-NS2B/NS3cut1-P2A-NS2B/NS3和pGFP15-NS2B/NS3cut2-P2A-NS2B/NS3外，在转染pGFP20-NS2B/NS3cut2-P2A-NS2B/NS3，pGFP24-NS2B/NS3cut1-P2A-NS2B/NS3，pGFP24-NS2B/NS3cut2-P2A-NS2B/NS3或pGFP45-NS2B/NS3cut2-P2A-NS2B/NS3质粒后，随着NS2B/NS3蛋白酶的表达，共表达改造的GFP和NS2B/NS3蛋白酶的细胞均表现出荧光强度的降低或消失。这表明，在pGFP20-NS2B/NS3cut2-P2A-NS2B/NS3，pGFP24-NS2B/NS3cut1-P2A-NS2B/NS3，pGFP24-NS2B/NS3cut2-P2A-NS2B/NS3和 pGFP45-NS2B/NS3cut2-P2A-NS2B/NS3质粒中，NS2B/NS3蛋白酶的表达可以切割改造后的GFP，导致荧光强度降低。由于，pGFP20-NS2B/NS3cut1转染细胞后荧光较微弱，pGFP20-NS2B/NS3cut2-P2A-NS2B/NS3转染细胞后背景较高，后续研究选择pGFP24-NS2B/NS3cut1-P2A-NS2B/NS3，pGFP24-NS2B/NS3cut2-P2A-NS2B/NS3和 pGFP45-NS2B/NS3cut2-P2A-NS2B/NS3进行进一步研究。

实施例2：

一种JEV蛋白酶抑制剂的筛选方法，包括以下步骤：

（1）构建共表达改造后GFP和NS2B/NS3蛋白酶的质粒，即pGFP24-NS2B/NS3cut1 /cut2-P2A-NS2B/NS3、pGFP45-NS2B/NS3 cut2-P2A-NS2B/NS3（具体构建方法参考实施例1）。

（2）筛选：将待转染细胞铺于多孔板（96孔板）中，然后加入pGFP24-NS2B/NS3cut1/cut2-P2A-NS2B/NS3、pGFP45-NS2B/NS3 cut2-P2A-NS2B/NS3质粒转染细胞，对转染后的细胞进行培养，同时向多孔板中添加不同组的待筛选抑制剂，以不添加待筛选抑制剂的为对照，观察细胞状态及荧光拍照，并检测荧光强度；若与对照相比荧光强度增加，则表示待筛选抑制剂具有抑制效果，荧光强度增加越多则代表待筛选抑制剂的抑制效果越强。

JEV NS2B/NS3蛋白酶的编码基因序列（SEQ ID No.7）：

gggtggccagccactgagtttttgtcggcagttggattgatgtttgccatcgtaggtggcttggccgagttggatattgaatccatgtcaatacccttcatgctggcaggtctcatggcagtgtcctacgtggtgtcaggaaaagcaacagatatgtggcttgaacgggccgccgacatcagctgggagatggatgctgcaatcacaggaagtagtcggaggctggatgtgaaactggatgatgacggagattttcacttgattgatgatcccggtgttccatggaaggtctgggtcctgcgcatgtcttgtattggcttagccgccctcacgccttgggccatcgttcccgccgctttcggttattggctcactttaaaaacaacaaaaagagggggcgtgttttgggacacgccatccccaaaaccttgctcaaaaggagacactactacaggagtctaccgaattatggctagagggattcttggcacttaccaggccggcgtcggagtcatgtacgagaatgttttccacacactatggcacacaactagaggagcagccattatgagtggagaaggaaaattgacgccatactggggtagtgtgaaagaagaccgcatagcttacggaggcccatggaggtttgaccgaaaatggaatggaacagatgacgtgcaagtgatcgtggtagaaccggggaaggctgcagtaaacatccagacaaaaccaggagtgtttcggactcccttcggggaggttggggctgttagtctggattacccgcgaggaacatccggctcacccattctggattctaatggagacatcataggcctatacggcaatggagttgagcttggcgatggctcatacgtcagcgccatcgtgcagggtgaccgtcaggaggaaccagtcccagaagcttacaccccaaacatgttgagaaagagacagatgactgtgctagatttgcaccctggctcagggaagaccaggaaaattctgccacagataatcaaggacgccatccagcagcgcctaagaacagctgtgctggcaccgacgcgggtggtagcagcagaaatggcagaagctttgagagggctcccagtgcgatatcaaacttcagcagtgcagagagagcaccaagggaatgaaatagtggatgtgatgtgccacgccactctgacccatagactgatgtcaccgaacagagtgcccaactacaacctatttgtcatggatgaagctcatttcactgacccagccagcatagccgcacgaggatacattgctaccaaggtggaattaggggaggcagcagccatcttcatgacagcgaccccgcctggaaccacggatccttttcctgactcaaatgccccaatccatgatttgcaagatgagataccagacagggcatggagcagtggatacgaatggatcacagaatatgcgggcaaaaccgtgtggtttgtggcgagcgtaaaaatggggaatgagattgcaatgtgcctccaaagagcggggaaaaaggtcatccaactcaaccgcaagtcctatgatacagaatacccaaaatgtaagaatggagactgggactttgtcattaccaccgacatctctgaaatgggggccaacttcggtgcgagcagggtcatcgactgtagaaagagcgtgaaacccaccatcttagaagagggagaaggcagagtcatcctcggaaacccatctcccataaccagtgcaagcgcagctcaacggaggggcagagtaggcagaaaccccaaccaagttggagatgaatatcactatgggggggctaccagtgaagatgacagtaacctagcccattggacagaggcaaagatcatgttagacaacatacacatgcccaatggactggtggcccagctctatggaccagagagggaaaaggcttttacaatggatggtgaataccgtctcagaggtgaagaaaagaaaaacttcttggagctgcttaggacggctgacctcccggtgtggctggcctacaaggtggcgtccaatggcattcagtacaccgacagaaggtggtgttttgatgggccgcgcacgaatgccatactggaggacaacaccgaggtagagatagtcacccggatgggtgagaggaaaatcctcaagccgagatggcttgatgcaagagtttatgcagatcaccaagccctcaagtggttcaaagactttgcagcagggaagaga（SEQ ID No.7）。

GFP的氨基酸序列：

MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK*（SEQ ID No.1）。

GFP基因序列：

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA（SEQ ID NO.4）。

实施例3：

一种JEV蛋白酶抑制剂的抑制效果评价方法，步骤（1）同实施例2，不同之处在于步骤（2）评价：将待转染293T细胞铺于细胞培养皿中，然后加入共表达改造的GFP和JEV NS2B/NS3蛋白酶的质粒转染细胞，对转染后的细胞进行培养，同时向细胞培养皿中添加抑制剂，以不添加抑制剂的为对照，观察细胞状态及荧光拍照，并检测荧光强度；荧光强度正向反映抑制剂的抑制效果，荧光强度越高则代表抑制剂的抑制效果越强。

试验例：模拟JEV NS2B/NS3蛋白酶失活，验证改造后的GFP荧光恢复（定量）在pGFP24/45-NS2B/NS3cut1/cut2-P2A-NS2B/NS3质粒基础上将NS2B/NS3进行破坏构建质粒：

具体操作为利用PCR扩增（Primer Star）及同源重组技术（Uniclone One StepSeamless Cloning Kit试剂盒）在P2A后加入5个连续的终止密码子TGA；对构建好的pGFP15/20/24/45- NS2B/NS3cut1/cut2-P2A-5×STOP -NS2B/NS3 质粒进行转染。转染后每隔24 h观察细胞状态及荧光拍照，并检测荧光强度（图3）。荧光强度检测时，将293T细胞铺于96孔板中，37℃ 5% CO

由图3可知，在细胞中转染共表达NS2B/NS3蛋白酶和GFP24-NS2B/NS3cut1或GFP24-NS2B/NS3cut2或GFP45-NS2B/NS3cut2的质粒后（02处理组），荧光强度相比单表达改造的GFP的质粒显著降低，当破坏NS2B/NS3蛋白酶的功能表达后，激发荧光显著恢复（03处理组）。

可见，质粒pGFP24-NS2B/NS3cut1 -P2A-NS2B/NS3评价蛋白酶抑制剂抗病毒药物的活性灵敏度高，可用于高通量的筛选JEV蛋白酶抑制剂以及高通量的检测JEV蛋白酶抑制剂抗病毒活性，具有开发优秀的抗病毒药物筛选平台及相应蛋白酶抑制剂活性检测产品的广泛前景。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。