水稻OsRFI2及其靶基因在调控植物耐盐性方面的应用

技术领域

本发明属于分子生物学、基因工程、植物育种技术领域，涉及水稻

背景技术

水稻是世界性重要的粮食作物。随着全球人口不断增长，到2050年，对粮食的需求量将会增加70%。然而，盐碱、高温、低温和干旱等非生物胁迫严重威胁着农作物的生产安全。随着现代工农业进程加快，土壤盐渍化日益严重。目前，我国遭受盐害的稻田面积约为水稻种植面积的1/5，尤其在沿海地区。因此，如何安全利用盐渍化稻田，扩大水稻种植面积，提高稻谷产量已成为亟待解决的重大课题。

盐胁迫严重影响植物的生长发育，其原因在于：盐胁迫导致土壤结构遭受破坏，增加土壤渗透压，使植物获取土壤水分困难，损害植物的生长；盐胁迫影响植物光吸收，包括降低气孔开度、叶肉对二氧化碳的电导率以及降低叶绿素含量等，因此抑制植物光合作用的发生，限制植物生长的能力；细胞离子稳态遭受破坏，使有害离子积累；植物生物量减少、叶面积和生长受抑制等等。

在盐胁迫下，水稻细胞内会产生大量的活性氧（Reactive oxygen species，ROS），从而对细胞组分如膜脂、核酸、蛋白质等造成氧化损伤，破坏水稻正常的新陈代谢活动。此外，盐胁迫还造成水稻幼苗存活率下降，株高降低，分蘖数减少，抽穗期延长，幼穗分化异常等，最终导致水稻产量和品质下降。因此，挖掘水稻耐盐基因，通过杂交育种或转基因操纵，培育耐盐水稻新品种，对于解决水稻盐害问题，保障水稻安全生产和粮食安全具有重要意义。

尽管目前已克隆了一些水稻盐胁迫应答的重要基因，但植物从感知盐胁迫到耐盐是一个由多基因参与、多途径介导的复杂过程，所以亟待发掘鉴定新的重要调控基因。研究发现，蛋白质翻译后修饰——泛素/26S蛋白酶体途径在植物感知并响应盐胁迫过程中发挥着重要作用。泛素连接酶E3是底物蛋白特异性选择降解过程中最关键的酶，可通过特异性识别并结合逆境响应因子来实现对逆境做出应答。目前已发现多个E3泛素连接酶在植物耐盐过程中发挥重要作用。例如响应盐诱导的OsSIRP1、干旱诱导的OsDIRP1均被鉴定为水稻盐胁迫应答的负调节因子。此外，盐诱导的E3泛素连接酶OsSIRH2-14通过靶向钠离子转运蛋白OsHKT2;1正调控水稻的耐盐性。

虽然前人已鉴定到部分参与调控水稻响应盐胁迫的E3泛素连接酶，但是，水稻基因组中有超过1300个E3泛素连接酶编码基因，而且一个E3泛素连接酶可识别多个底物靶蛋白。这种“E3-底物蛋白”的多样性决定了E3泛素连接酶的生物学功能的多样化。前人研究发现，水稻E3泛素连接酶基因

发明内容

针对上述问题，本发明的目的一在于提供水稻

为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

第一方面，水稻

具体地，所述应用是指在植物中敲除

具体地，所述应用是指在植物中过表达

具体地，所述靶基因为水稻

具体地，所述靶基因为水稻

第二方面，一种提高植物耐盐性的方法，所述方法是通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对目的植物的

其中，所述目的植物为单子叶植物。所述单子叶植物为水稻、玉米、高粱、小麦、大麦、谷子、燕麦和黑麦。

有益效果：本发明提供可以调控水稻耐盐性的基因，通过分子技术手段实现了提高水稻耐盐性的目的。

本发明证实

本发明通过酵母双杂交和体外泛素化实验等，证实OsAPx8和OsZFP是OsRFI2的下游靶蛋白。在水稻中敲除

附图说明

图1.

图2.

图3.

图4. 野生型日本晴和

图5. OsRFI2与OsAPx8蛋白的互作。（A）酵母双杂交验证OsRFI2与OsAPx8的互作。其中AD/BD-OsAPx8、AD-OsRFI2/BD为阴性对照，AD-WT/BD-WT为阳性对照。（B）BiFC实验验证OsRFI2与OsAPx8的互作。YN-OsRFI2、YC-OsAPx8转化农杆菌感受态，共转染烟草叶片，两者的互作定位于叶绿体。Bar = 1 mm。（C）GST pull-down验证OsRFI2与OsAPx8的互作。

图6. OsRFI2的E3泛素连接酶活性及OsAPx8的泛素化降解分析。（A）OsRFI2体外泛素化检测。加入泛素化试剂盒成分中的E1、E2、Ub与待检测蛋白（OsRFI2-GST）进行体外泛素化反应，然后利用Western blot并使用GST和Ub抗体检测泛素化。（B）OsRFI2体外泛素化降解OsAPx8。加入泛素化试剂盒成分中的E1、E2、Ub与待检测蛋白（OsAPx8-His）进行体外泛素化反应，然后利用Western blot并使用His和Ub抗体检测泛素化。（C）OsRFI2对OsAPx8蛋白水平的影响。在未填加MG132实验中，检测OsAPx8-His随着时间点延长在OE-

图7.

图8. 野生型日本晴、

图9. OsRFI2与OsZFP蛋白的互作。（A）酵母双杂交验证OsRFI2与OsZFP的互作。其中AD/BD-OsRFI2、AD-OsZFP/BD为阴性对照。（B）BiFC实验验证OsRFI2与OsZFP的互作。YN-OsRFI2、YC-OsZFP转化农杆菌感受态，共转染烟草叶片，两者的互作定位于细胞核。Bar =1mm。（C）GST pull-down验证OsRFI2与OsZFP的互作。

图10. OsRFI2介导OsZFP的泛素化降解。（A）OsRFI2体外泛素化降解OsZFP。加入泛素化试剂盒成分中的E1、E2、Ub与待检测蛋白（GST-OsZFP）进行体外泛素化反应，然后利用Western blot并使用GST和Ub抗体检测泛素化。（B）OsRFI2对OsZFP蛋白水平的影响。在未填加MG132实验中，检测GST-OsZFP随着时间点延长在OE-

图11.

具体实施方式

本发明证实来源于水稻

来源于水稻

来源于水稻

上述

本发明涉及的

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

以下实施例中，除特别说明外，所使用的实验方法和技术手段均为本领域技术人员公知的。

以下实施方案是说明性的，并非限制本发明的范围，本发明的实质和范围由权利要求书所限定。本领域技术人员在不离开本发明实质和范围的前提下，对这些实验方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明所用原料及试剂均可通过市购获得。

实施例1、水稻

将粳稻品种日本晴21-d龄幼苗进行120 mM NaCl处理1 h、3 h、6 h、12 h和24 h。定量RT-PCR分析显示，

实施例2、

利用

采用TPS法提取OE-

实施例3、

根据如SEQ ID NO.1所示的水稻

在

实施例4、

将野生型日本晴（WT）、

实施例5、OsRFI2与OsAPx8蛋白的互作及泛素化分析

运用酵母双杂交、双分子荧光互补（BiFC）及GST pull-down实验证实OsRFI2蛋白可与抗坏血酸氧化酶OsAPx8在叶绿体中发生互作（图5）。体外泛素化实验发现，OsRFI2具有E3泛素连接酶活性，而且能够催化OsAPx8蛋白通过26S蛋白酶体途径发生泛素化降解（图6）。

实施例6、

根据水稻

实施例7、

将WT、

实施例8、OsRFI2与OsZFP蛋白的互作及泛素化分析

运用酵母双杂交、双分子荧光互补（BiFC）及GST pull-down实验证实OsRFI2蛋白可与转录因子OsZFP在细胞核中发生互作（图9）。体外泛素化实验发现，OsRFI2能够催化OsZFP蛋白通过26S蛋白酶体途径发生泛素化降解（图10）。

实施例9、水稻

将粳稻日本晴21-d龄幼苗进行120 mM NaCl处理1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h和48 h。定量RT-PCR分析显示，

表1 PCR检测及CRISPR/Cas9基因编辑所用引物