同时定性与定量检测雷贝拉唑钠中间体缩合物及八种杂质的反相高效液相色谱方法

技术领域

本发明属于医药中间体及杂质的检测技术领域，具体涉及同时定性与定量检测雷贝拉唑钠中间体缩合物及八种杂质的反相高效液相色谱方法。

背景技术

雷贝拉唑钠，化学名称2-[[4-(3-甲氧基丙氧基)-3-甲基-2-吡啶基]甲基亚硫酰基]-1H-苯并咪唑钠盐，分子式：C

雷贝拉唑钠是一种新型质子泵抑制剂，通过抑制胃壁细胞的H

在《沈阳药科大学学报》，第28卷第6期2011年6月发表的“HPLC-DAD-MS鉴定注射用雷贝拉唑钠杂质及其特征谱研究孔国祥等”公开了利用HPLC-DAD-MS联用技术对注射用雷贝拉唑钠中的杂质2-巯基苯并咪唑、雷贝拉唑砜等进行了定性推断和定量测定。

CN104020239A公开了一种通过高效液相色谱法分离测定雷贝拉唑钠及其杂质的方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以醋酸铵溶液-甲醇为流动相，检测波长210～310nm，柱温20～45℃，流动相速度0.5～2.0mL/min，采用极性溶剂分别配制含雷贝拉唑钠及其杂质各溶液；测定：将溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图并进行分析。所涉及的杂质为雷贝拉唑砜、雷贝拉唑N-氧化物、雷贝拉唑硫醚、2-巯基苯并咪唑等。

CN112834628A公开了一种高效液相色谱法测定雷贝拉唑钠及其杂质的方法，该方法的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为磷酸盐缓冲液，所述流动相B为乙腈，通过采用梯度洗脱方式，可在高效液相色谱图中将雷贝拉唑钠及其九个杂质进行有效分离，且专属性好，灵敏度高。

CN113009029A公开了一种雷贝拉唑钠肠溶制剂有关物质的测定方法，色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，采用磷酸氢二钾溶液为流动相A、甲醇为流动相B、乙腈为流动相C进行梯度洗脱，检测波长为280±2mL，柱温为40～50℃，流动相的流速为0.8～1.2mL/min。

虽然以上现有技术针对雷贝拉唑钠成品杂质进行了测定，但是其均不能同侧测定多种杂质。

中间体缩合物是雷贝拉唑钠生产工艺中最主要的环节，能够直接影响到产品的质量及用药安全。因此对中间体缩合物进行质量控制，有利于进一步控制和提高雷贝拉唑钠产品质量，提高药品疗效、降低药品毒副作用显得尤为重要。

雷贝拉唑钠中间体缩合物及各杂质名称及结构式如表1所示。

表1雷贝拉唑钠中间体缩合物各杂质

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种反相高效液相色谱方法，能够同时定性与定量检测雷贝拉唑钠中间体缩合物及八种杂质，精密度高，稳定性好，重现性好。

本发明所述的同时定性与定量检测雷贝拉唑钠中间体缩合物及八种杂质的反相高效液相色谱方法，包括以下步骤：

(1)选择色谱条件：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱，

流速：0.95～1.1mL/min，优选为1.0mL/min；

检测器：紫外检测器；

检测波长：244～250nm，优选为247nm；

柱温：28～35℃，优选为30℃；

流动相A：0.05mol/L磷酸二氢钾溶液:甲醇按照体积比(49～50.5):(49.5～51)；流动相B：甲醇；进行梯度洗脱；

(2)配制溶液：

空白溶剂：甲醇；

供试品溶液：精密称定雷贝拉唑钠中间体缩合物，置量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；

杂质贮备溶液：精密称定各杂质，置量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质贮备溶液；

杂质标准溶液：取杂质贮备溶液，加甲醇稀释成，摇匀，作为杂质标准溶液；

(3)测定：

精密量取供试品溶液和杂质标准溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按峰面积外标法计算。

色谱柱的内径：4.0～4.6mm，柱长150～250mm，粒径3.5～5.0μm。

磷酸二氢钾溶液的pH为6.8～7.2。

所述的供试品溶液浓度为1mg/mL。

所述的杂质贮备溶液中各杂质的浓度为20mg/mL。

所述的杂质标准溶液中各杂质的浓度为5μg/mL。

步骤(3)精密量取供试品溶液和杂质标准溶液各20mL分别注入液相色谱仪。

所述的梯度洗脱方式为：

与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：

本发明所述方法能实现多种杂质的有效分离及定量检测，即实现各色谱峰之间的有效分离。能够准确定性及定量雷贝拉唑钠中间体缩合物杂质情况。该方法简便易行，流动相配制简单，采用高效液相色谱仪，检测成本低；各杂质的专属性、线性及范围、回收率、精密度、耐用性等试验均良好，建立了一种可靠有效的检测标准，弥补了对雷贝拉唑钠中间体缩合物研究的缺乏，提高了用药的安全性。

附图说明

图1为实施例1中的分离度测试液的高效液相色谱图。

图2为实施例2的供试品溶液的线性图。

图3为实施例2的杂质Ⅰ溶液的线性图。

图4为实施例2的杂质Ⅱ溶液的线性图。

图5为实施例2的杂质Ⅲ溶液的线性图。

图6为实施例2的杂质IV溶液的线性图。

图7为实施例2的杂质V溶液的线性图。

图8为实施例2的杂质VI溶液的线性图。

图9为实施例2的杂质VII溶液的线性图。

图10为实施例2的杂质VIII溶液的线性图。

具体实施方式

以下实施例用来说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

实施例1

分离度实验：

(1)选择色谱条件：

色谱仪：岛津20A

色谱柱：Thermo Acclaim C18柱，4.6×250mm，5μm；

流速：1.0mL/min；

检测器：紫外检测器；

检测波长：247nm；

柱温：30℃；

流动相A：0.05mol/L、pH7.0磷酸二氢钾溶液：甲醇按照体积比50∶50；流动相B：甲醇；进行梯度洗脱；所述的梯度洗脱方式为：

。

(2)配制溶液：

空白溶剂：甲醇；

供试品溶液：精密称定雷贝拉唑钠中间体缩合物200mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品贮备溶液；

杂质贮备溶液：精密称定各杂质20mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质贮备溶液；

杂质标准溶液：取杂质贮备溶液，加甲醇稀释成，摇匀，作为杂质标准溶液；

各取供试品贮备溶液和杂质贮备溶液，加甲醇稀释成含缩合物1mg/mL，各杂质5μg/mL的混合液，摇匀，作为分离度测试液；

(3)测定：

取20uL分离度测试液注入液相色谱仪，记录色谱图。

如图1所示，出峰结果(按出峰顺序)杂质I：4.439min、杂质III：6.390min、杂质IV：20.159min、杂质II：24.566min、杂质VI：29.293min、杂质V：41.251min、缩合物：41.937min、杂质VII：44.155min、杂质Ⅷ：50.222min。结果缩合物与相邻杂质V峰分离良好，其他杂质均良好分离，符合要求。

实施例2

线性实验：

(1)选择色谱条件：

色谱仪：岛津20A

色谱柱：Thermo Acclaim C18柱，4.6×250mm，5μm；

流速：1.0mL/min；

检测器：紫外检测器；

检测波长：247nm；

柱温：30℃；

流动相A：0.05mol/L、pH7.0磷酸二氢钾溶液：甲醇按照体积比50∶50；流动相B：甲醇；进行梯度洗脱；所述的梯度洗脱方式为：

。

(2)配制溶液：

空白溶剂：甲醇；

线性溶液：取供试品贮备溶液和各杂质贮备溶液用甲醇稀释成至少5个浓度的溶液。

(3)测定：取供试品和杂质线性溶液各20uL分别注入液相色谱仪，结果如图2～9所示。

实施例3

精密度试验：

(1)选择色谱条件：

色谱仪：岛津20A

色谱柱：Thermo Acclaim C18柱，4.6×250mm，5μm；

流速：1.0mL/min；

检测器：紫外检测器；

检测波长：247nm；

柱温：30℃；

流动相A：0.05mol/L、pH7.0磷酸二氢钾溶液：甲醇按照体积比50∶50；流动相B：甲醇；进行梯度洗脱；所述的梯度洗脱方式为：

(2)配制溶液：

空白溶剂：甲醇；

供试品溶液：精密称定雷贝拉唑钠中间体缩合物20mg，置20mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；

(3)测定：取6份供试品溶液各20uL分别注入液相色谱仪，结果如表2所附。

表2缩合物测定精密度试验结果

实施例4

定量限和检测限实验：

(1)选择色谱条件：

色谱仪：岛津20A

色谱柱：Thermo Acclaim C18柱，4.6×250mm，5μm；

流速：1.0mL/min；

检测器：紫外检测器；

检测波长：247nm；

柱温：30℃；

流动相A：0.05mol/L、pH7.0磷酸二氢钾溶液：甲醇按照体积比50∶50；流动相B：甲醇；进行梯度洗脱；所述的梯度洗脱方式为：

。

(2)配制溶液：

空白溶剂：甲醇；

供试品溶液：精密称定雷贝拉唑钠中间体缩合物200mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品贮备溶液；

杂质贮备溶液：精密称定各杂质20mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质贮备溶液；

取供试品贮备溶液和杂质贮备液逐级稀释成不同浓度溶液；

(3)测定：

各取20uL不同浓度溶液分别注入液相色谱仪，其结果如表3所示。以信噪比10∶1作为定量限，3∶1作为检测限。

表3定量限与检测限结果

实施例5

稳定性实验：

(1)选择色谱条件：

色谱仪：岛津20A

色谱柱：Thermo Acclaim C18柱，4.6×250mm，5μm；

流速：1.0mL/min；

检测器：紫外检测器；

检测波长：247nm；

柱温：30℃；

流动相A：0.05mol/L、pH7.0磷酸二氢钾溶液：甲醇按照体积比50∶50；流动相B：甲醇；进行梯度洗脱；所述的梯度洗脱方式为：

。

(2)配制溶液：

空白溶剂：甲醇；

供试品溶液：精密称定雷贝拉唑钠中间体缩合物200mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品贮备溶液；

杂质贮备溶液：精密称定各杂质20mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质贮备溶液；

各取供试品贮备溶液和杂质贮备溶液，加甲醇稀释成含缩合物1mg/mL，各杂质5μg/mL的混合液，摇匀，作为稳定性测试液；

(3)测定：

分别于0、2、4、6、8、10、12h，量取20μL稳定性测试注入液相色谱仪，计算峰面积的RSD。结果如表4所示，缩合物及各杂质在甲醇溶液中12h内稳定。

表4缩合物及杂质测定溶液稳定性试验结果

实施例6

(1)选择色谱条件：

色谱仪：岛津20A

色谱柱：Thermo Acclaim C18柱，4.6×250mm，5μm；

流速：0.95mL/min；

检测器：紫外检测器；

检测波长：247nm；

柱温：30℃；

流动相A：0.05mol/L、pH7.0磷酸二氢钾溶液：甲醇按照体积比50∶50；流动相B：甲醇；进行梯度洗脱；所述的梯度洗脱方式为：

。

(2)配制溶液：

空白溶剂：甲醇；

供试品溶液：精密称定雷贝拉唑钠中间体缩合物200mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品贮备溶液；

杂质贮备溶液：精密称定各杂质20mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质贮备溶液；

杂质标准溶液：取杂质贮备溶液，加甲醇稀释成，摇匀，作为杂质标准溶液；

各取供试品贮备溶液和杂质贮备溶液，加甲醇稀释成含缩合物1mg/mL，各杂质5μg/mL的混合液，摇匀，作为分离度测试液；

(3)测定：

取20uL分离度测试液注入液相色谱仪，结果缩合物与各杂质分离符合要求。

实施例7

(1)选择色谱条件：

色谱仪：岛津20A

色谱柱：Thermo Acclaim C18柱，4.6×250mm，5μm；

流速：1.1mL/min；

检测器：紫外检测器；

检测波长：247nm；

柱温：30℃；

流动相A：0.05mol/L、pH7.0磷酸二氢钾溶液：甲醇按照体积比50∶50；流动相B：甲醇；进行梯度洗脱；所述的梯度洗脱方式为：

。

(2)配制溶液：

空白溶剂：甲醇；

供试品溶液：精密称定雷贝拉唑钠中间体缩合物200mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品贮备溶液；

杂质贮备溶液：精密称定各杂质20mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质贮备溶液；

杂质标准溶液：取杂质贮备溶液，加甲醇稀释成，摇匀，作为杂质标准溶液；

各取供试品贮备溶液和杂质贮备溶液，加甲醇稀释成含缩合物1mg/mL，各杂质5μg/mL的混合液，摇匀，作为分离度测试液；

(3)测定：

取20uL分离度测试液注入液相色谱仪，结果缩合物与各杂质分离符合要求。

实施例8

(1)选择色谱条件：

色谱仪：岛津20A

色谱柱：Thermo Acclaim C18柱，4.6×250mm，5μm；

流速：1.0mL/min；

检测器：紫外检测器；

检测波长：247nm；

柱温：28℃；

流动相A：0.05mol/L、pH7.0磷酸二氢钾溶液：甲醇按照体积比50∶50；流动相B：甲醇；进行梯度洗脱；所述的梯度洗脱方式为：

。

(2)配制溶液：

空白溶剂：甲醇；

供试品溶液：精密称定雷贝拉唑钠中间体缩合物200mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品贮备溶液；

杂质贮备溶液：精密称定各杂质20mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质贮备溶液；

杂质标准溶液：取杂质贮备溶液，加甲醇稀释成，摇匀，作为杂质标准溶液；

各取供试品贮备溶液和杂质贮备溶液，加甲醇稀释成含缩合物1mg/mL，各杂质5μg/mL的混合液，摇匀，作为分离度测试液；

(3)测定：

取20uL分离度测试液注入液相色谱仪，结果缩合物与各杂质分离符合要求。

实施例9

(1)选择色谱条件：

色谱仪：岛津20A

色谱柱：Thermo Acclaim C18柱，4.6×250mm，5μm；

流速：1.0mL/min；

检测器：紫外检测器；

检测波长：247nm；

柱温：35℃；

流动相A：0.05mol/L、pH7.0磷酸二氢钾溶液：甲醇按照体积比50∶50；流动相B：甲醇；进行梯度洗脱；所述的梯度洗脱方式为：

。

(2)配制溶液：

空白溶剂：甲醇；

供试品溶液：精密称定雷贝拉唑钠中间体缩合物200mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品贮备溶液；

杂质贮备溶液：精密称定各杂质20mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质贮备溶液；

杂质标准溶液：取杂质贮备溶液，加甲醇稀释成，摇匀，作为杂质标准溶液；

各取供试品贮备溶液和杂质贮备溶液，加甲醇稀释成含缩合物1mg/mL，各杂质5μg/mL的混合液，摇匀，作为分离度测试液；

(3)测定：

取20uL分离度测试液注入液相色谱仪，结果缩合物与各杂质分离符合要求。

实施例10

(1)选择色谱条件：

色谱仪：岛津20A

色谱柱：Thermo Acclaim C18柱，4.6×250mm，5μm；

流速：1.0mL/min；

检测器：紫外检测器；

检测波长：247nm；

柱温：30℃；

流动相A：0.05mol/L、pH6.8磷酸二氢钾溶液：甲醇按照体积比50∶50；流动相B：甲醇；进行梯度洗脱；所述的梯度洗脱方式为：

。

(2)配制溶液：

空白溶剂：甲醇；

供试品溶液：精密称定雷贝拉唑钠中间体缩合物200mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品贮备溶液；

杂质贮备溶液：精密称定各杂质20mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质贮备溶液；

杂质标准溶液：取杂质贮备溶液，加甲醇稀释成，摇匀，作为杂质标准溶液；

各取供试品贮备溶液和杂质贮备溶液，加甲醇稀释成含缩合物1mg/mL，各杂质5μg/mL的混合液，摇匀，作为分离度测试液；

(3)测定：

取20uL分离度测试液注入液相色谱仪，结果缩合物与各杂质分离符合要求。

实施例11

(1)选择色谱条件：

色谱仪：岛津20A

色谱柱：Thermo Acclaim C 18柱，4.6×250mm，5μm；

流速：1.0mL/min；

检测器：紫外检测器；

检测波长：247nm；

柱温：30℃；

流动相A：0.05mol/L、pH7.2磷酸二氢钾溶液：甲醇按照体积比50：50；流动相B：甲醇；进行梯度洗脱；所述的梯度洗脱方式为：

。

(2)配制溶液：

空白溶剂：甲醇；

供试品溶液：精密称定雷贝拉唑钠中间体缩合物200mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品贮备溶液；

杂质贮备溶液：精密称定各杂质20mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质贮备溶液；

杂质标准溶液：取杂质贮备溶液，加甲醇稀释成，摇匀，作为杂质标准溶液；

各取供试品贮备溶液和杂质贮备溶液，加甲醇稀释成含缩合物1mg/mL，各杂质5μg/mL的混合液，摇匀，作为分离度测试液；

(3)测定：

取20uL分离度测试液注入液相色谱仪，结果缩合物与各杂质分离符合要求。

实施例12

(1)选择色谱条件：

色谱仪：岛津20A

色谱柱：Thermo Acclaim C18柱，4.6×250mm，5μm；

流速：1.0mL/min；

检测器：紫外检测器；

检测波长：247nm；

柱温：30℃；

流动相A：0.05mol/L、pH7.0磷酸二氢钾溶液：甲醇按照体积比50.5∶49.5；流动相B：甲醇；进行梯度洗脱；所述的梯度洗脱方式为：

。

(2)配制溶液：

空白溶剂：甲醇；

供试品溶液：精密称定雷贝拉唑钠中间体缩合物200mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品贮备溶液；

杂质贮备溶液：精密称定各杂质20mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质贮备溶液；

杂质标准溶液：取杂质贮备溶液，加甲醇稀释成，摇匀，作为杂质标准溶液；

各取供试品贮备溶液和杂质贮备溶液，加甲醇稀释成含缩合物1mg/mL，各杂质5μg/mL的混合液，摇匀，作为分离度测试液；

(3)测定：

取20uL分离度测试液注入液相色谱仪，结果缩合物与各杂质分离符合要求。

实施例13

(1)选择色谱条件：

色谱仪：岛津20A

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱，4.6×250mm，5μm；

流速：1.0mL/min；

检测器：紫外检测器；

检测波长：247nm；

柱温：30℃；

流动相A：0.05mol/L、pH7.0磷酸二氢钾溶液：甲醇按照体积比49∶51；流动相B：甲醇；进行梯度洗脱；所述的梯度洗脱方式为：

。

(2)配制溶液：

空白溶剂：甲醇；

供试品溶液：精密称定雷贝拉唑钠中间体缩合物200mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品贮备溶液；

杂质贮备溶液：精密称定各杂质20mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质贮备溶液；

杂质标准溶液：取杂质贮备溶液，加甲醇稀释成，摇匀，作为杂质标准溶液；

各取供试品贮备溶液和杂质贮备溶液，加甲醇稀释成含缩合物1mg/mL，各杂质5μg/mL的混合液，摇匀，作为分离度测试液；

(3)测定：

取20uL分离度测试液注入液相色谱仪，结果缩合物与各杂质分离符合要求。

当然，上述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定对本发明的实施例范围。本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的均等变化与改进等，均应归属于本发明的专利涵盖范围内。