一种东方百合高效遗传转化的方法

技术领域

本发明属于植物组织培养及遗传转化技术领域，具体涉及一种东方百合高效遗传转化的方法。

背景技术

百合是百合科百合属的多年生球根植物。目前国内百合切花品种基本依赖进口，其中东方百合因其花朵大型、色彩丰富、气味芳香而成为市场主流。经过十几年新产品的不断更迭，东方百合市场份额依然保持绝对优势，足见市场对其认可，因此在其基础上进行的品种改良成为主要的育种方向。随着现代分子生物学的发展，利用转基因技术克服传统育种中的自交不亲和性，定向修饰目的性状已成为新的百合育种手段。

目前，百合主要是利用农杆菌介导的方法进行遗传转化，由于单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，农杆菌介导百合等单子叶植物基因转化虽已经获得成功，但仍存在转化效率低、材料不易获得、对农杆菌敏感等问题。因此，选择易侵染的受体材料，强化侵染液的导入性、克服农杆菌带来的细胞伤害是百合遗传转化的关键。同时，因百合多年生地下鳞茎的属性，其鳞片消毒困难，无法直接作为受体材料，而一代无菌苗建立周期长，后期内生菌频发，诱导的愈伤在分化过程中易出现嵌合体，且外植体从诱导、膨大到生根，历时长，操作复杂，这些都进一步阻碍了百合遗传转化的发展。因此，构建百合的高效遗传转化体系，对东方百合定向育种和品种改良技术的发展有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于东方百合分子育种过程中的高效遗传转化方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种东方百合高效遗传转化的方法，其包括以下步骤：

1）取无菌百合花丝，用解剖刀将其横切成长0.5-1cm的小段作为外植体，在超净工作台上吹风干燥处理30min；

2）将步骤1）制备好的外植体放入农杆菌侵染液中侵染10-15min，使花丝与农杆菌充分接触后，再转入干燥共培养基中，22-25℃暗培养2-3d；

3）将步骤2）培养好的花丝置于250mg/L的羧苄青霉素钠溶液中浸泡6-10min，然后用无菌水清洗3遍，置于无菌滤纸上吹干后，再转入一体化筛选培养基中，于22-25℃暗环境下进行培养，使花丝直接分化成小鳞茎并生根。

步骤1）所述无菌百合花丝是将采摘下的百合花苞用质量浓度为75%的酒精溶液浸泡30-60s后，用无菌水清洗1次，再放入含2wt%次氯酸钠和0.01vol%吐温的水溶液中消毒处理20-30min，期间不断进行摇动，然后无菌水清洗3-5次，置于无菌滤纸上吹干，之后用解剖刀切开花苞，取出内部无菌花丝。

步骤2）所述农杆菌侵染液是利用农杆菌菌种在添加有50mg/L Rif的LB固体培养基上划线，28℃暗培养3d后挑取单菌落，接入到含50mg/L Rif的LB液体培养基中，黑暗条件下28℃、180-220rpm振荡培养16h，再将培养后的菌液置于灭菌的离心管中，5000rpm离心5min收集菌体，用改良重悬液重悬菌体，调整至OD600值为0.3-0.5制得。其中所述改良重悬液为10mmol/L MES +100μmol/L AS+10 mmol/L MgCl

步骤2）所述干燥共培养基为MS+0.1mg/L TDZ+1mg/L NAA+1%肌醇母液+60g/L蔗糖+100μmol/L AS+10mg/L LA+7g/L琼脂，pH5.8，且培养基表面铺一层高压灭菌后的滤纸。

步骤3）所述一体化筛选培养基为MS+0.1mg/L TDZ+1mg/L NAA+1%肌醇母液+75mg/L Kan+250mg/L Cef+60g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8。

上述肌醇母液是将10g肌醇、0.2g甘氨酸、0.01g盐酸硫胺素（VB1）、0.05g盐酸吡哆醇（VB6）、0.05g烟酸（VB3）加水溶解并定容至1L。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的东方百合高效遗传转化方法包括了外植体的获取、农杆菌侵染与干燥共培养以及直接诱导小鳞茎及生根，其构建了以东方百合花丝为受体的高效遗传转化体系：首先，花丝消毒简便，可以直接用于遗传转化，解决了转化材料不易获得且污染率高的问题；其次，通过培养材料和配方的优化，小鳞茎直接经外植体再生、膨大及生根，诱导途径单一，极大简化了操作并克服了嵌合体的缺陷；另外，侵染能力是百合遗传转化突破的关键，本发明采用干燥共培养处理以及改良的重悬液，显著提高了农杆菌的渗透性和侵染力并在后期控制了农杆菌过度生长，其中LA抗氧化剂的使用解决了农杆菌侵染带来的逆境伤害。

通过上述多方面协同作用，本发明可实现东方百合稳定转化阳性率为45%以上，其转化效率高，操作简便，为东方百合高效遗传转化体系建立，提供了新思路和途径。

本发明针对目前百合遗传转化过程中存在的难点，建立了一种以东方百合花丝为外植体的操作简单、高效可靠的东方百合植株遗传转化方法，通过该方法还可以高效、快速地将外源基因转入百合，获得阳性转基因百合植株。

附图说明

图1为实施例1利用东方百合“西伯利亚”转化植株的获得过程；其中，a为刚接的切段花丝；b为采用一体化筛选培养基培养7d后拉长膨大的花丝；c为培养20d后直接分化出芽点的花丝；d-e为直接膨大的小鳞茎及生出的根；

图2为实施例1中所得转基因植株的PCR鉴定图，其中，M为DNA Marker，1为质粒阳性对照，2为野生型株系阴性对照，3-8为抗性株系。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例中所述原料如无特殊说明，即为普通市售产品。实施例中所述的实验方法无特别说明，即按常规分子生物学实验方法操作。试剂：噻苯隆（TDZ）、硫辛酸（LA）、α-萘乙酸（NAA）、利福平（Rif）、2-吗啉乙磺酸（MES）、乙酰丁香酮（AS）、头孢霉素（Cef）、卡纳霉素（Kan）、农杆菌（GV3101，购自上海唯地生物技术有限公司）。

实施例1

一种东方百合高效遗传转化的方法，其步骤如下：

1、东方百合“西伯利亚”外植体的处理：将百合花苞用质量浓度为75%的酒精溶液浸泡30-60s后，用无菌水清洗1次，再放入含2wt%次氯酸钠和0.01vol%吐温的水溶液中消毒处理25min，期间不断进行摇动，然后无菌水清洗3-5次，置于无菌滤纸上吹干，之后用解剖刀切开花苞，取出内部无菌花丝，将其横切成长0.5-1cm的小段，在超净工作台上吹风干燥处理30min；

2、农杆菌侵染液的配制：将农杆菌菌种在添加有50mg/L Rif的LB固体培养基上划线，28℃暗培养3d后挑取单菌落，接入到含50mg/L Rif的LB液体培养基中，黑暗条件下28℃、180-220rpm振荡培养16h，再将培养后的菌液置于灭菌的离心管中，5000rpm离心5min收集菌体，用改良重悬液（10mmol/L MES +100μmol/L AS+10 mmol/L MgCl

3、农杆菌侵染花丝：将干燥后的外植体花丝放入配制好的农杆菌侵染液中侵染10-15min，使花丝与农杆菌充分接触后，再转入干燥共培养基（MS+0.1mg/L TDZ+1mg/L NAA+1%肌醇母液+60g/L蔗糖+100μmol/L AS+10mg/L LA+7g/L琼脂，pH5.8，且培养基表面铺一层高压灭菌后的滤纸）中，25℃暗培养2-3d；所用肌醇母液是将10g肌醇、0.2g甘氨酸、0.01g盐酸硫胺素、0.05g盐酸吡哆醇、0.05g烟酸加水溶解并定容至1L；

4、农杆菌脱菌及抗性筛选：将步骤3共培养后的花丝置于250mg/L的羧苄青霉素钠溶液中浸泡6-10min，然后用无菌水清洗3遍，并置于无菌滤纸上吹干后，再转入一体化筛选培养基（MS+0.1mg/L TDZ+1mg/L NAA+1%肌醇母液+75mg/L Kan+250mg/L Cef+60g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8）中，于22-25℃暗环境下进行培养，期间观察花丝变化，结果表明，花丝在培养7d后拉长膨大，培养20d时不经愈伤阶段直接分化出白色小芽点，之后膨大为小鳞茎。

将得到的小鳞茎的鳞片切成薄片，用CTAB法提取百合DNA进行PCR扩增，结果如图2所示，在随机选取的6个抗性株系中，有4株幼苗都检测到PCR扩增产物，由此确定外源基因已整合到百合基因组中，建立了百合的遗传转化体系。

实施例2

取室外生长良好的东方百合“西伯利亚”鳞茎的鳞片、叶片、花丝分别作为外植体，按实施例1相同步骤进行处理，分别于采用一体化筛选培养基培养30d时统计外植体的污染率、小鳞茎诱导率、转化阳性率，结果如表1所示。

表1 不同外植体对百合遗传转化的影响

对上述数据进行分析可知，鳞片作为外植体的污染率很高，达74%，内生菌严重，后期无法控制，且无法获得阳性植株；叶片作为外植体的污染率为32%，小鳞茎诱导率为12%，阳性率仅8%；而花丝作为外植体，可实现无污染且阳性率达48%。这是由于花丝组织幼嫩、结构简单且中央有一维管束贯穿，更有利于侵染液渗透和吸收，从而可提高转化率。因此以百合花丝作为转化受体，无需建立一代无菌苗，具有不易污染、转化率高的特点。

实施例3

取东方百合“西伯利亚”无菌花丝为外植体，采用不同浓度的TDZ（0.01 mg/L、0.1mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L）和NAA(0.5 mg/L、1 mg/L)组合处理，30d后观察小鳞茎诱导情况。

表2 不同激素处理对百合花丝小鳞茎诱导的影响

结果表明，不同浓度处理中，当TDZ浓度在0.01mg/L时，无法有效诱导小鳞茎发生，而浓度为1mg/L时，花丝出现褐化死亡，而NAA浓度的提高有利于促进小鳞茎的发生，说明东方百合对TDZ较为敏感。处理中MS+0.1mg/L TDZ+1mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7g/L琼脂，诱导率最高，可达到56%。

实施例4

取东方百合“索蚌”无菌花丝作为外植体，采用不同浓度硝酸银（2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L）、VC（50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L）、LA(2 mg/L、10 mg/L、20 mg/L)进行抗氧化剂的共培养处理，于30d时统计外植体褐化率。

表3 不同浓度抗氧化剂对花丝诱导再生的影响

结果表明，百合花丝对农杆菌较为敏感，侵染后的花丝未经抗氧化剂处理，易发生褐化，褐化率为46.7%；不同种类抗氧化剂中，2mg/L硝酸银处理的褐化率为15%，高浓度则产生一定毒害，褐化率升高。VC对花丝的作用较弱，100mg/L处理时褐化率为18.3%，而10mg/LLA处理下花丝基本无褐化，褐化率仅为1.7%，因此，采用LA可以有效解决花丝转化过程中的组织坏死和褐变，克服农杆菌侵染过程中的逆境伤害。

实施例5

为进一步考察花丝的侵染环节，采用不同重悬液（①重悬液：MS+100mg/L AS，②改良重悬液：10mmol/L MES +100μmol/L AS+10 mmol/L MgCl

表4 不同侵染组合对百合花丝转化的影响

重悬液是农杆菌侵染的关键，从表4处理1、2的对比可以看出，重悬液中去除MS对转化并无影响，而附加表面活性剂MES及离子缓冲剂MgCl

而与共培养相比，经过干燥共培养后的处理4的阳性率达到48.3%，这可能是由于适当的干燥处理可以促使花丝细胞失水，引起轻微质壁分离，促进农杆菌的导入，从而强化农杆菌的效率，且培养面上放一层灭菌滤纸能显著抑制农杆菌后期的过度生长，减少农杆菌污染，并促进受体材料的恢复，从而高了百合花丝的稳定转化阳性率。

实施例6

处理1：取无菌花丝为外植体，先放置于诱导培养基（MS+1 mg/L TDZ+0.5mg/LNAA）中培养30d，至开始出现芽点时转接到一次膨大培养基（MS+1 mg/L TDZ+0.5mg/L NAA+90g/L蔗糖）培养中15d，再转接入生根培养基（MS+1mg/L NAA）中培养。

处理2：取无菌花丝为外植体，先放置于诱导培养基（MS+0.01mg/L TDZ+0.5mg/LNAA）中培养30d，开始出现芽点，继续放置于原培养基，每15d继代一次，待小鳞茎长至2-3cm后，转入生根培养基（1/2MS+0.5mg/L IBA）中培养。

处理3：取无菌花丝为外植体，放置于诱导培养基（MS+0.1mg/L TDZ+1mg/L NAA+60g/L蔗糖）中培养。

处理4：取无菌花丝为外植体，放置于一体化培养基（MS+0.1mg/L TDZ+1mg/L NAA+1%肌醇母液+60 g/L蔗糖）中培养。

表5 不同培养基对小鳞茎分化的影响

百合常规生根一般使用NAA或IBA等生长素，若在诱导时期就添加一定比例的生长素来促进生根，易导致分化异常，无法正常诱导出芽，因此需要分阶段培养。肌醇母液属于有机物，不替代激素发挥功效，但对其发育生根有利。肌醇母液中肌醇对细胞的繁殖、分化有促进作用，硫胺素等B族维生素作为代谢的辅助因子，涉及氨基酸的合成以及离体根的发生，从而可以促进芽的诱导和后期直接生根。另外，蔗糖浓度的升高可加速小鳞茎的膨大，缩短发育周期。因此与常规诱导、膨大、生根的三阶段培养方式相比，采用含1%肌醇母液及60g/L蔗糖的一体化培养基进行不分段培养，可实现花丝不经愈伤阶段直接分化出小鳞茎及生根，极大的简化了操作，且其芽诱导率达90%，并可使培养周期缩短约25d。

最后说明的是，以上所述实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对本发明专利范围的限制，尽管通过上述实例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出若干改进和变形，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。