一种测定阿加曲班中杂质C的检测方法

技术领域

本发明属于药物分析检测技术领域。更具体地，涉及一种测定阿加曲班杂质C的检测方法。

背景技术

阿加曲班，是一种白色结晶性粉末的化学品。化学名称(2R,4R)-1-[(2S)-5-(氨基亚氨甲基)氨基-2-[(3-甲基-1,2,3,4-四氢-8-喹啉基)磺酰胺基]-1-氧代戊基]-4-甲基哌啶-2-甲酸一水合物，分子式为C

药物治疗效果不光要看化合物本身活性，药物中杂质对其安全性和有效性也有着重要影响。药物杂质是指药物中存在的无治疗作用或者影响药物的稳定性、疗效、甚至对人体健康有害的物质，在药物生产过程中，杂质的主要来源包括两个方面：1、由于所用原料不纯或者原料反应过程中反应未完全，以及反应的中间产物、反应的副产物等造成药品原料中杂质的存在，被统一称为有关物质；2、由于原料生产过程中反应的溶媒、催化剂等的残留所造成的杂质。药物的杂质与药品安全性的关系是一个受多因素影响的复杂关系，通常药物中的杂质大多具有潜在的生物活性，有的甚至与药物相互作用从而影响药物的效能和安全，严重的可能产生毒性作用。药物中杂质会不同程度地影响药物的稳定和安全，因此在药物的研究、生产、贮存和临床应用等方面，必须保证药物的纯度，降低药物的杂质，才能保证药物的有效和安全。

阿加曲班原料药在合成过程中产生多个副产物杂质(包括杂质A、杂质C、杂质E、杂质G、杂质H、杂质IN2等)及各种降解杂质(包括杂质B、杂质D、杂质F、杂质I、杂质O等)这些有关物质如果过多地引入药物成品中，将会导致严重的用药安全性问题。因此，在原料药合成阶段和制剂阶段都需要对这些有关物质进行严格控制。

阿加曲班通常是21(R)和21(S)阿加曲班的混合物，药用阿加曲班一水合物需要满足：21(R)与21(S)位的含量比例须控制在R/S＝63～67/37～33范围内。结构式如下所示：

阿加曲班分子结构中21位的甲基为混旋，21(R)和21(S)异构体互为非对映异构体，在反相液相条件中经常出双峰且峰宽较大；由于部分阿加曲班杂质与阿加曲班分子结构类似，其分子结构中同样含有四氢喹啉环上的混旋的甲基。因此，常规反相色谱条件下部分杂质与阿加曲班一样会出双峰，导致杂质峰宽较大，使得部分杂质分离效果不佳。常见的阿加曲班有关物质检测方法的液相运行时间较长，才能保证将极性相近的杂质与主成分有效分离。

根据公开报道的关于阿加曲班合成工艺路线可知，反应底物(简称水解物)在高压氢化及钯碳的作用下发生硝基还原并脱除、喹啉环还原等一系列还原反应，最终得到阿加曲班成品，阿加曲班杂质C是合成阿加曲班过程中产生的氢化过程中的中间态副产物，其化学结构与阿加曲班非常类似，仅比阿加曲班分子结构多出一个氨基，其理化性质与阿加曲班成品非常类似，如果样品中残留有杂质C，经甲醇/水、乙醇/水体系进行精制纯化，均无法有效去除该杂质。

邓宇在2021年发表的发表《抗血栓药物阿加曲班的合成》提到了关于阿加曲班有关物质的液相分析方法，色谱柱：Agilent Eclipse XDB C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A：0.1％三氟醋酸+10mmol/L CH

在美国药典USP43中收录的关于检测阿加曲班有关物质的分析方法，色谱柱4.6-mm×25-cm；3-μm packing L1；流动相A:10mM醋酸铵与5mM庚烷磺酸钠水溶液，流动相B：乙腈-甲醇(500:300)；洗脱方式：梯度洗脱；检测波长259nm；流速0.6ml/min；进样量10μl；柱温50℃；运行72min。重现药典方法发现杂质C的双峰与主峰重合，无法准确分离该杂质。因此，美国药典针对杂质C单独列出检测方法，色谱柱4.6-mm×25-cm；3-μm packing L1；流动相A：乙腈-乙醇-缓冲盐(80:240:680)流动相B：10mM乙酸铵和5mM庚烷磺酸钠水溶液；洗脱方式：梯度洗脱；检测波长259nm；流速0.6ml/min；进样量10μl；柱温50℃；运行102min；重现药典方法时发现，杂质C和阿加曲班均出双峰，杂质C的第一个峰可以与阿加曲班有效分离，但杂质C的第二个峰与阿加曲班完全重合，因此只能检测出杂质C的部分含量，检测结果与真实值有较大偏差，导致杂质检出量偏低，影响产品质量的评估，结合USP43药典中关于杂质C的相对保留时间及限度说明可以发现，只规定杂质C相较于阿加曲班第一个峰的相对保留时间为0.94，未提供第二个峰的相对保留时间，说明美国药典关于杂质C的分析方法仅能有效分离第一个峰，与重现结果基本一致。综上，重现美国药典分析方法多个杂质分离度较差，部分杂质与主峰重合，运行时间偏长，流动相中加入了庚烷磺酸钠，对色谱柱有一定的损伤。

在日本药典JP17中收录的关于检测有关物质的分析方法，色谱柱4.6-mm×25-cm；5-μm packing L1；缓冲液:0.25％乙酸(氨水调节pH为5.0)，流动相A：缓冲液-甲醇(500:500)，流动相B：缓冲液-甲醇(200:800)，洗脱方式：梯度洗脱；检测波长254nm；流速1.0ml/min；进样量10μl；柱温45℃；运行50min。重现日本药典方法发现杂质C与阿加曲班完全重合，没有区分效果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术无法用HPLC无法有效准确的测定阿加曲班中杂质C的缺陷和不足，提供一种在测定阿加曲班中杂质C的检测方法。

本发明的目的在于为解决上述技术问题，本发明提供一种分离度好、检测效率高、运行时间短的阿加曲班杂质C的检测方法，所述检测方法为高效液相色谱法，包含以下步骤：

(1).供试品阿加曲班溶液的制备；其中所述供试品阿加曲班包括含有阿加曲班的原料药或者含有阿加曲班的药物制剂。

(2).对照品阿加曲班杂质C溶液的制备；

(3).检测，取供试品阿加曲班溶液和对照品阿加曲班杂质C溶液，按照高效液相色谱条件进行进样检测，高效液相色谱条件为：色谱柱：单分散高纯硅胶基球柱，检测波长：259nm；流动相：流动相A：乙酸铵溶液，流动相B：乙腈，进行梯度洗脱，得到色谱图，其中梯度洗脱程序为：

根据色谱图，计算供试品阿加曲班中杂质C的含量。

本发明所述的检测方法，其中，所述色谱柱优选为硅胶柱Nano ChromCore Silica(250×4.6mm，3μm)。

本发明所述的检测方法，其中，所述供试品阿加曲班溶液用乙腈与水的混合溶剂溶解配制，其中混合溶剂中乙腈与水的体积比为80:20。

本发明所述的检测方法，其中，所述供试品阿加曲班溶液配制方法如下：取阿加曲班20mg，置20ml量瓶中，加混合溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。

本发明所述的检测方法，其中，所述对照品阿加曲班杂质C溶液用乙腈与水的混合溶剂溶解配制，其中混合溶剂中乙腈与水的体积比为80:20。

本发明所述的检测方法，其中，所述对照品阿加曲班杂质C溶液，配制方法如下：称取杂质C对照品5mg，置50ml量瓶中，加混合溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，量取对照品储备液3.0ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，量取对照品储备液2.0ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。

本发明所述的检测方法，其中，所述流动相A为含0.05％～0.2％乙酸铵水溶液，用氨水调节pH至6.5～8.5。

本发明所述的检测方法，其中，色谱柱柱温为30℃～50℃，流动相流速为0.2～1.0ml/min，样品进样量为2～10μl。

本发明所述的检测方法，还包括空白溶液、加标供试品溶液、其他杂质定位溶液的配制，并将它们注入高效液相色谱仪的步骤。其中，

空白溶液的配制方法如下：将体积比为80:20乙腈和水混合均匀；

加标供试品溶液的配制方法如下：取阿加曲班20mg，精密称定，置20ml量瓶中，精密加入对照品储备液2.0ml，再加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀；

其他杂质定位溶液的配制方法如下：称取杂质A、B、D、E、F、G、H、I、J、M、N、O、SM3-C、IN2对照品各1mg，分别置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，分别置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。

本发明所提供的阿加曲班有关物质的检测方法，其中所述梯度洗脱程序，优选为：

本发明所提供的阿加曲班有关物质的检测方法，其中所述高效液相色谱条件中，流动相A为含0.05％～0.2％乙酸铵水溶液，用氨水调节pH至6.5～8.5，流动相B为乙腈；优选流动相A为0.05％～0.15％乙酸铵水溶液，用氨水调节pH至7.0～8.0；更优选流动相A为含0.1％乙酸铵水溶液，用氨水调节pH至7.5。

本发明所提供的阿加曲班有关物质的检测方法，其中所述高效液相色谱条件中，色谱柱柱温为30℃～50℃；优选色谱柱柱温为35℃～45℃；更优选色谱柱柱温为40℃。

本发明所提供的阿加曲班有关物质的检测方法，其中所述高效液相色谱条件中，流动相流速为0.2～1.0ml/min；优选流动相流速为0.4～0.8ml/min；更优选流动相流速为0.6ml/min。

本发明所提供的阿加曲班有关物质的检测方法，其中所述高效液相色谱条件中，样品进样量为2～10μl；优选样品进样量为5μl。

本发明所提供的阿加曲班有关物质的检测方法，其中所述高效液相色谱条件中，所用的检测器为光电二极管阵列检测器，检测波长为259nm。

本发明所提供阿加曲班有关物质的检测方法，其中所述供试品溶液的制备方法为取阿加曲班，精密称定，加适量溶剂溶解并稀释制成每1ml约含1mg的溶液即得。因为样品进样体积相对于流动相体积来说大小极微，上述适量溶剂可以在完全溶解样品且适于色谱分析的溶剂中进行选择，例如水、甲醇、乙腈、甲醇-水、乙腈-水。

本发明进一步提供一种阿加曲班有关物质的检测方法，其包含以下步骤：

(1).供试品溶液的制备：取适量阿加曲班，精密称定，加乙腈与水的混合溶剂溶解并稀释制成每1ml约含0.5～4mg的溶液即得；其中混合溶剂中乙腈与水的体积比为80:20；

(2).色谱条件：色谱柱为Nano ChromCore Silica(250×4.6mm，3μm)；流动相A为含0.05％～0.2％乙酸铵水溶液，用氨水调节pH至6.5～8.5，流动相B为乙腈；采用梯度方式洗脱；流动相流速为0.2～1.0ml/min，色谱柱柱温为30℃～50℃，样品进样量为2～10μl，采用光电二极管阵列检测器，检测波长259nm；其中，梯度洗脱程序为：

(3).测定：吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定。

本发明进一步提供一种测定阿加曲班中杂质C的检测方法，其包含以下优选步骤：

(1).供试品溶液的制备：取适量阿加曲班，精密称定，加乙腈与水的混合溶剂溶解并稀释制成每1ml约含0.1mg的溶液即得；其中混合溶剂中乙腈与水的体积比为80:20；

(2).色谱条件：色谱柱为Nano ChromCore Silica(250×4.6mm，3μm)；流动相A为含0.1％乙酸铵水溶液，用氨水调节pH至7.5，流动相B为乙腈；采用梯度方式洗脱；流动相流速为0.6ml/min，色谱柱柱温为40℃，样品进样量为5μl，采用光电二极管阵列检测器，检测波长259nm；其中，梯度洗脱程序为：

(3).测定：吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定。

本发明具有以下有益效果：

本申请发明人经过大量的试验探索，在兼顾阿加曲班其他杂质能够准确检出的前提下，最终建立可以高效分离与检测阿加曲班杂质C的高效液相色谱方法。该分析方法下阿加曲班拟研究杂质除杂质J外，阿加曲班主成分及其他杂质均出单峰，相较之前的液相检测方法的双峰，其峰宽变窄，峰型和分离度均较为理想，运行时间大幅缩短，能够有效减少耗材的使用，具有良好的经济价值。

该分析检测方法灵敏度高，且具有较高的回收率、精密度和稳定性，重现性好、准确性高，可用于阿加曲班中生产过程中对杂质C的监控，有利于控制、提高阿加曲班的质量；同时操作简单，检测时间短，非常适用于大规模业化生产中对原料药的质量监控。

附图说明

图1为对比例1日本药典JP17方法下阿加曲班对照溶液的HPLC图谱。

图2为对比例1日本药典JP17方法下杂质C定位溶液的HPLC图谱。

图3为对比例1日本药典JP17方法下阿加曲班和杂质C定位溶液叠加图谱。

图4为对比例2美国药典USP43方法下系统适用性溶液的HPLC图谱。

图5为对比例2美国药典USP43方法下杂质C定位溶液的HPLC图谱。

图6为实施例1中杂质C的对照品溶液的HPLC图谱。

图7为实施例1中杂质C与主成分供试品加标溶液的HPLC图谱。

图8为实施例1中主成分与各杂质定位溶液的HPLC叠加图谱。

图9杂质C线性关系图。

具体实施方式

以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。

除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。

对比例1(JP17标准有关物质方法)

供试品制备中稀释剂为：甲醇

色谱检测条件如下：

色谱柱：

柱温：45℃

流动相：

缓冲液：0.25％乙酸(氨水调节pH为5.0)

A：缓冲液-甲醇(500:500)

B：缓冲液-甲醇(200:800)

梯度程序：

检测波长：254nm

流速：1.0ml/min

进样量：10μl

溶剂：甲醇

定位溶液：取阿加曲班工作对照品及杂质C对照品各适量，用溶剂分别溶解并制成每1ml中约含阿加曲班对照品及杂质C各300μg和10μg的定位溶液。

实验数据：

实验结果：杂质峰分离情况见图1～图3，阿加曲班与杂质C完全重合，没有区分力。

对比例2(USP43有关物质杂质C的检测方法)

供试品制备中稀释剂为：甲醇

色谱检测条件如下：

色谱柱：ODS-3，250×4.6mm，3μm

柱温：50℃

流动相：

A：乙腈-乙醇-缓冲盐(80:240:680)

B：缓冲盐：10mM乙酸铵和5mM庚烷磺酸钠水溶液

梯度程序：

检测波长：259nm

流速：0.6ml/min

进样量：10μl

溶剂：甲醇

杂质C定位溶液：取杂质C对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成每1ml约含4μg的溶液，作为杂质C定位溶液。

系统适用性溶液：取阿加曲班、杂质C适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成每1ml约含阿加曲班10mg、杂质C10μg的溶液。

实验数据：

实验结果：杂质C与阿加曲班分离情况见图4～图5，杂质C的第一个峰与阿加曲班能够有效分离，杂质C的第二个峰与阿加曲班完全重合。

实施例1一种测定阿加曲班中杂质C的检测方法

(1).液相色谱条件

检测波长：259nm

色谱柱：Nano ChromCore Silica(250×4.6mm，3μm)

柱温：40℃

流速：0.6ml/min

进样量：5μl

流动相A：0.1mol/L乙酸铵(用氨水调节pH至7.5)

流动相B：乙腈

梯度程序：

溶剂：乙腈-水(80:20)

(2).供试品及对照品制备

溶液配制：

空白溶液(溶剂)：乙腈-水(80:20)。

对照品储备液：称取杂质C对照品约5mg，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取对照品储备液3.0ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。

对照品溶液：精密量取对照品储备液2.0ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。

供试品溶液：取本品约20mg，精密称定，置20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。

加标供试品溶液(系统适用性溶液)：取本品约20mg，精密称定，置20ml量瓶中，精密加入对照品储备液2.0ml，再加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。

其他杂质定位溶液：称取杂质A、B、D、E、F、G、H、I、J、M、N、O、SM3-C、IN2对照品各约1mg，分别置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，分别置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。

精密量取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液、其他杂质定位溶液各5μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

杂质C与阿加曲班及各杂质的分离情况见图6～图8。

(3).加标供试品溶液和对照品检测及结果

表1阿加曲班及各杂质的检测数据汇总

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(4).检测限和检测限测定

取对照品溶液，用溶剂稀释至峰高的信噪比S/N≥10的溶液，作为定量限浓度溶液，并平行制备6份；继续稀释至信噪比S/N≥3的溶液，作为检测限浓度溶液。精密量取定量限溶液与检测限溶液各5μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。检测结果见表2和表3。

表2检测限试验结果

表3定量限试验结果

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杂质C定量限浓度为0.3013μg/ml，S/N为12.48，约相当于限度浓度的20.1％；6份定量限溶液色谱图中，杂质C峰面积RSD为2.62％，小于20.0％。检测限浓度为0.090μg/ml，S/N为5.33，相当于限度浓度的6.0％。以上结果表明方法灵敏度较高，满足检测要求。

(5).溶液稳定性

取对照品溶液及加标供试品溶液，于室温下放置，并在不同时间分别进样分析，并记录色谱图。检测结果见表4和表5。

表4对照品溶液稳定性结果

表5加标供试品溶液稳定性结果

对照品溶液在室温放置34.5小时，各时间点杂质C峰面积相对0小时百分比均在95.0％～105.0％范围内，表明对照品溶液在室温条件下34.5小时内稳定。加标供试品溶液在室温放置21.5小时，各时间点杂质C峰面积相对0小时百分比均在95.0％～105.0％范围内，表明加标供试品溶液在室温条件下21.5小时内稳定。

(6).线性与范围

线性储备液：精密量取杂质C储备液适量，加溶剂稀释制成每1ml约含15μg的溶液。

25％线性溶液：精密量取线性储备液2.5ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。

50％线性溶液：精密量取线性储备液1ml，置20ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。

100％线性溶液：精密量取线性储备液2ml，置20ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。

150％线性溶液：精密量取线性储备液3ml，置20ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。

200％线性溶液：精密量取线性储备液4ml，置20ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。

精密量取各线性溶液各5μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，检测结果见表6。

表6杂质C线性与范围

杂质C在0.3013～3.0133μg/ml浓度范围内，浓度与峰面积呈线性关系，线性方程为y＝6021.8x-200.57，相关系数r为0.9999，大于0.995，Y轴截距绝对值与100％浓度响应值之比为2.3％，小于10.0％；各浓度响应因子RSD为5.0％，小于10％。表明方法线性关系良好。

实施例2一种测定阿加曲班中杂质C的检测方法

实施例2的检测方法与实施例1不同之处在于，将实施例1(1)液相色谱条件中柱温40℃调整至35℃和45℃，其余参数参考实施例1。加标供试品溶液分离度结果参见表7。

表7加标供试品溶液分离度结果

由表7可见，杂质C与阿加曲班分离度均符合要求。

实施例3一种测定阿加曲班中杂质C的检测方法

实施例3检测方法与实施例1不同之处在于，将实施例1(1)流动相中缓冲盐浓度0.01mol/L调整至0.09mol/L和0.11mol/L，其余参数参考实施例1。加标供试品溶液分离度结果参见表8。

表8加标供试品溶液分离度结果

由表8可见，杂质C与阿加曲班分离度均符合要求。

实施例4一种测定阿加曲班中杂质C的检测方法

实施例4检测方法与实施例1不同之处在于，将实施例1(1)液相色谱条件中的流动相pH值7.5调整至7.3和7.7，其余参数参考实施例1。加标供试品溶液分离度结果参见表9。

表9加标供试品溶液分离度结果

由表9可见，杂质C与阿加曲班分离度均符合要求。

本发明的色谱条件，如色谱柱，溶剂，流动相等均为本发明人经过筛选得到的，筛选过程如下：

阿加曲班及各杂质均有较大极性且极性相近，导致使用常规的C18色谱柱分离效果较差，需要加入离子对试剂或是延长液相运行时间才能获得较好的分离效果，本发明尝试使用ChromCore Silica系列色谱柱用于分离阿加曲班主成分及各杂质，该色谱柱填料基于单分散硅胶微球，经优化的装填工艺而成，对于极性较大的杂质具有良好的分离效果。

在流动相选择上，通常情况下乙腈的洗脱能力比甲醇强，但分离效果上乙腈不如质子性溶剂甲醇，这是由溶剂本身的化学性质决定的。因此在阿加曲班各国药典分析方法中，日本药典采用甲醇为流动相，运行时间较短，但主成分与杂质几乎无区分力，而美国药典采用乙腈为流动相，且需要加入离子对试剂来改善峰型，运行时间较长，杂质C的分离效果也不理想。本发明采用洗脱能力较强的乙腈作为流动相，乙酸铵溶液作为水相，经过一系列调整，如流动相pH值调整、洗脱梯度程序调整，最终得到本发明中的色谱条件，阿加曲班与杂质C获得良好的分离效果。

以上是结合具体实施例对本发明进一步的描述，但这些实施例仅仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明属于药物分析检测技术领域，具体涉及一种测定阿加曲班中杂质C的检测方法。该方法可以在一个色谱条件下在兼顾阿加曲班其他杂质能够准确检出的前提下，建立可以高效分离与检测阿加曲班杂质C的高效液相色谱方法。该分析方法下阿加曲班拟研究杂质除杂质J外，阿加曲班主成分及其他杂质均出单峰，相较之前的液相检测方法的双峰，其峰宽变窄，峰型和分离度均较为理想，运行时间大幅缩短，能够有效减少耗材的使用，具有良好的经济价值。该分析检测方法灵敏度高，且具有较高的回收率、精密度和稳定性，重现性好、准确性高，可用于阿加曲班中生产过程中对杂质C的监控，有利于控制、提高阿加曲班的质量；同时操作简单，检测时间短，非常适用于大规模业化生产中对原料药的质量监控。