一种基于蔗糖致死基因（SacB）高效筛选蔗糖异构酶突变体的方法

技术领域

本发明涉及一种基于蔗糖致死基因(SacB)高效筛选蔗糖异构酶突变体的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

蔗糖异构酶(sucrose isomerase)，又称α-葡糖基转移酶，能够将蔗糖转化成异麦芽酮糖和海藻酮糖，以及少量的葡萄糖和果糖的一种酶，目前其应用场景是利用蔗糖异构酶转化法生产异麦芽酮糖。

异麦芽酮糖(isomaltulose)又称帕拉金糖，分子式为C

用蔗糖异构酶来实现异麦芽酮糖的高产率，高纯度，低成本的生产始终是蔗糖异构酶研究的方向。在用蔗糖异构酶生产异麦芽酮糖的过程中，酶的利用率低和不可避免生成的副产物是两个重要的不利因素，且因为这两个因素使得异麦芽酮糖的生产成本维持在较高水平，而高成本也限制了异麦芽酮糖替代蔗糖的步伐。更高的异麦芽酮糖转化率意味着在生产过程中，可以使异麦芽酮糖的产率更高，或生产纯度更高的异麦芽酮糖产品。与此同时，提高蔗糖异构酶的酶活，可以提高生产效率，减少生产成本。

为了获得更高效的生物催化剂，筛选新的并且可能具有高效率生成异麦芽酮糖的蔗糖异构酶是当前的关键任务。

sacB基因编码蔗糖果聚糖酶，该酶能催化蔗糖水解并聚合成高分子量的果聚糖，但高分子量果聚糖积累对细胞存在潜在的毒性作用，可造成细胞死亡。在培养基中加入适当浓度的蔗糖，此时蔗糖存在情况下，含有sacB基因的底盘宿主会致死。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于蔗糖致死基因(sacB)高效筛选蔗糖异构酶突变体的方法及应用，在高浓度蔗糖存在时，利用蔗糖异构酶基因来作为底盘宿主的解毒基因，拮抗蔗糖致死基因的致死效应，只有蔗糖异构酶基因高效稳定表达能转化蔗糖时，细胞才得以存活。最终得到了能够高效转化蔗糖为异麦芽酮糖的蔗糖异构酶突变体。

一种基于蔗糖致死基因(SacB)高效筛选蔗糖异构酶突变体的方法，其步骤包括：构建蔗糖异构酶(SIase)和蔗糖致死基因(SacB)在同一质粒上或双质粒系统上共表达，转化到细胞中，复苏繁殖增加细胞的数量和活性后，用诱导剂诱导让蔗糖异构酶基因表达一段时间，然后取适当稀释浓度涂布在含蔗糖致死浓度的抗性平板上对含蔗糖异构酶质粒的底盘宿主进行生死筛选。

所述的蔗糖异构酶(SIase)和蔗糖致死基因(SacB)在同一质粒上或双质粒系统上共表达，其特征在于蔗糖异构酶(SIase)和蔗糖致死基因(SacB)的共表达或形成融合蛋白表达。

所述的蔗糖异构酶(SIase)和蔗糖致死基因(SacB)在同一质粒上或双质粒系统上共表达，其中SacB基因组成型表达，蔗糖异构酶(SIase)基因的组成型或诱导型表达。

上述的方法，采用如下步骤：

(A)从结构出发分析蔗糖异构酶的活性区域对应的碱基序列，对其进行饱和突变、定点突变、随机突变建库获得含多种突变序列的蔗糖异构酶突变体；

(B)根据微生物菌株的生长特性及经验，选择SacB作为筛选基因；

(C)构建野生型蔗糖异构酶(SIase)和蔗糖致死基因(SacB)在同一质粒上的表达系统，确定该表达系统在含蔗糖的抗性平板不能生长时的蔗糖浓度，该浓度作为后续筛选高效突变体的蔗糖致死浓度；

(D)将步骤(A)中的含多种突变序列的蔗糖异构酶基因突变体库与含SacB基因的质粒载体连接，得到用于筛选的质粒，并转化至底盘宿主中；

(E)将转化得到的液体复苏后不涂板，直接接入到含抗性的液体培养基中，待细胞增殖至指数期时加入诱导剂诱导蔗糖异构酶(SIase)的表达，培养时间为3-4小时；

(F)将步骤(E)中的液体菌液以适当的稀释浓度涂布至含蔗糖致死浓度的抗性平板上对含蔗糖异构酶质粒的底盘宿主进行生死筛选。

所述步骤(A)中的突变体为所述随机突变，采用易错PCR方法获得。

所述同一质粒的表达系统为质粒上包括有以下元件：a)蔗糖异构酶表达系统PLlacO1-SIase，启动子为pLlacO1，由异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导驱动SIase的表达，b)蔗糖致死基因表达系统PsacB-sacB；c)高拷贝复制起始位点pBR322；d)抗性筛选PAmpR-AmpR。

筛选高效突变体的蔗糖致死浓度为350g/l。

所述的底盘宿主选自大肠杆菌，酿酒酵母，枯草芽孢杆菌。

诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。

含抗性的液体培养基为含终浓度为100ug/ml的氨苄青霉素的LB液体培养基，

所述LB液体培养基的组成为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L氯化钠，10g/L；

筛选培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂10g/L,蔗糖350g/l；

发酵培养基组成：磷酸盐5－20g/L，氯化铵1－5g/L，葡萄糖40g/L，氯化钠0.1－10g/L，硫酸镁0.3g/L，氯化钙0.015g/L，维生素B1 5－50μg/L。

按照本发明提供的技术方案，一种基于蔗糖致死基因(SacB)高效筛选蔗糖异构酶突变体的方法，详细步骤方法如下：

1)利用在线网站(https://www.jcat.de/)对蔗糖异构酶基因(Pantoea dispersaUQ68J)进行大肠杆菌宿主BL21(DE3)的密码子优化，随后人工合成密码子优化后的碱基序列并测序，随后对其进行易错PCR，建立随机突变库以获得含多种突变序列的蔗糖异构酶突变体；

2)根据微生物菌株的生长特性及经验，选择SacB作为筛选标记基因，合适的蔗糖浓度作为筛选条件；

3)构建野生型蔗糖异构酶(SIase)和蔗糖致死基因(SacB)在同一质粒上的表达系统，确定该表达系统在含蔗糖的抗性平板不能生长时的临界蔗糖浓度(350g/L)，该浓度作为后续筛选高效突变体的蔗糖浓度基准；

4)将步骤1)中的含多种突变序列的蔗糖异构酶基因的突变库与含SacB基因的质粒载体连接，得到用于筛选的质粒，并转化至底盘宿主中；

5)将转化得到的液体复苏后不涂板，直接接入到含Amp抗性(终浓度为100ug/ml的氨苄青霉素)的LB液体培养基中，待细胞增殖至指数期(OD

6)将步骤5)中的液体菌液以适当的稀释浓度涂布至蔗糖致死浓度抗性平板上(指含SacB基因与野生型蔗糖异构酶共表达时菌株的蔗糖致死浓度)对含高效蔗糖异构酶突变体质粒的底盘宿主进行筛选；

7)将步骤6)中存活下来的菌株提取质粒，转化到BL21(DE3)中在300g/l蔗糖的M9培养基中进行摇瓶发酵验证。

LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。

筛选培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂10g/L,蔗糖350g/l。

发酵培养基组成：磷酸盐5－20g/L，氯化铵1－5g/L，葡萄糖40g/L，氯化钠0.1－10g/L，硫酸镁0.3g/L，氯化钙0.015g/L，维生素B1 5－50μg/L。

本发明基于蔗糖致死基因sacB在基因反向筛选标记中的应用构建了高效蔗糖异构酶的筛选方法。利用蔗糖异构酶基因作为解毒基因，在高浓度的蔗糖存在时，只有蔗糖异构酶基因高效稳定表达时，细胞才得以存活。该种方法能简单有效的从众多含突变蔗糖异构酶的菌株中分离出对应的含高效蔗糖异构酶基因的菌株，最终通过摇瓶发酵实验确定蔗糖浓度和异麦芽酮糖产量，为蔗糖异构酶的筛选方式提供新的方法(如图1)。

附图说明

图1为本发明方法的原理图；

图2为本发明的技术路线示意图；

图3为本发明方法中的筛选优良突变体示意图；

图4为蔗糖浓度初步筛选条件的测试；

图5为蔗糖浓度正式筛选条件的测试；

图6为筛选出来的高效蔗糖异构酶不同时间段测试的转化率；

图7为筛选出来的高效蔗糖异构酶的摇瓶发酵底物与产物产量的HPLC鉴定结果图；

其中A为2.5g/L MIX(两种标准糖溶液各2.5g/l)液相色谱图：蔗糖先出峰，保留时间为10.144min；异麦芽酮糖后出峰，保留时间为10.877min；3.298min为溶剂峰；B为WT菌株96h发酵液反应后液相色谱图，C为F245L菌株96h发酵液反应后液相色谱图；D为F245L+K286V菌株96h发酵液反应后液相色谱图。

图8为质粒pTD-176结构图，

图9为质粒pTD-176B结构图。

具体实施方式

下述实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业突进获取。

以下实施例是对本发明的进一步说明，并不构成对本发明实质内容的限制。

以下将通过具体实施例对本发明做进一步地解释说明。

蔗糖异构酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示(加了6个his标签)，来源于基因(Pantoea dispersa UQ68J)，该基因经密码子优化后的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

pTD176B构建是在商业化载体pUC19上AmpR promoter和pBR322之间插入sacBpromoter+sacB。采用PCR的方法从商业化载体pUC19上用一对引物(pBR322-F:aggggataacgcaggaaag和pBR322-R:ctcaagaagatcctttgatcttttctacactccgctatcgctacg)扩增获得pBR322序列作为片段1和另一对引物(Amp-F:cgtagcgatagcggagtgtgttaccaatgcttaatcagtgagg和Amp-R:cgcggaacccctatttgtt)扩增获得AmpR promoter+AmpR序列作为片段2；随后利用引物对(PSacB+SacB)-F:gACGCGTGCTAGAGGCATAgcacatatacctgccgttcac和(PSacB+SacB)-R:ctttcctgcgttatcccctgatgctatttgttaactgttaattgtccttgttc从实验室的BS168枯草杆菌菌株基因组扩增获得sacB promoter+sacB片段3；分别对3个片段进行胶回收，随后用NanoDrop

第二天利用引物对F:gggtgagcaaaaacaggaa和R:ccacctctgacttgagcgtc进行菌落PCR验证，选择条带大小正确的进行送测，待测序准确无误后保存目标质粒和含目标质粒的菌株。见图9。

pTD176构建过程：pTD176是在前述构建了pTD176B的基础上进行构建的。首先利用引物对pBR322-R:ctcaagaagatcctttgatcttttctgtcaattgttatccgctcacaatt和Amp-F:cgtagcgatagcggagtgtgttaccaatgcttaatcagtgagg从pTD176B上扩增获得骨架backbone；采用两步法基因合成(引物列表如下)的方式合成密码子优化后的SIase野生型基因作为插入片段，分别对其进行胶回收。随后利用一种只切割甲基化位点的内切酶DpnI水浴孵育时间60分钟以处理骨架backbone残留的原质粒，减少假阳性。随后按照标准gibson连接程序进行2个片段的连接，将连接产物转化至感受态细胞，涂布至100ug/ml的氨苄青霉素LB固体平板中，于37℃培养箱中倒置过夜培养。第二天利用引物对F:caagcagcagattacgcgca和R:gttatctacacgacggggag进行菌落PCR验证，选择条带大小正确的进行送测，待测序准确无误后保存目标质粒和含目标质粒的菌株。见图8。

表1拼接法中的合成引物

表2：引物“搭桥”PCR第一步体系

表3：引物“搭桥”第二步PCR体系

实施例1蔗糖异构酶突变体F245L/F245L+K286V的高效筛选，其制备方法的具体步骤如下：

本发明的技术路线示意图(见图2)，其中筛选优良突变体方法示意图，见图3。

(1)构建蔗糖异构酶的随机突变文库

构建携带蔗糖异构酶基因(SEQ ID NO.1)的载体pTD176，见图8所示。质粒上主要组件：a)蔗糖异构酶表达系统P

表5：易错PCR反应体系

上引物(F:CGAATTCATTAAAGAGGAGAAAGGTACCATGTTCCTGAACGGTTTCAAAACC)，

下引物(R:ACACTCCGCTATCGCTACGTTAGTGATGGTGGTGGTGATG)。

表6：10×dNTPs不平衡混合液配方

表7：易错PCR反应程序

表8：易错突变率

(2)蔗糖浓度筛选条件的测试和验证：

a)以带有pTD-176B质粒(见图9所示，质粒上主要组件：P

结果显示：含有SacB基因表达系统的底盘宿主对异麦芽酮糖不敏感，即无致死作用能正常生长；而含有SacB基因表达系统的底盘宿主对蔗糖敏感，即蔗糖有致死效应，因此可用SacB表达体系筛选高效的蔗糖异构酶(2组+3组+4组)。表格中显示野生型SIase(Wild-type)是效果较好的酶，可以帮助原先不能生长的菌落在蔗糖平板上正常存活，即SIase(Wild-type)有利于蔗糖的转化，使得蔗糖致死效应减弱。突变库SIase*(mut-lib)中也有效果较好的酶，其可以帮助菌落在蔗糖平板上正常存活(6组+8组)，但不清楚突变库里的SIase*与野生型SIase(Wild-type)的效果优劣，因此需要进一步提高蔗糖浓度进行验证比较。

备注：“-”表示未添加；“+”表示添加

SIase(Wild-type)是野生型SIase，；SIase*(mut-lib)表示突变库里SIase*的合集。

b)在a)的基础上以带有pTD176质粒(质粒上主要组件：P

(3)将(1)中得到的SIase*质粒突变文库转化入大肠杆菌BL21(DE3)，复苏后直接37℃培养OD

用引物TD1189(gcggataacaagatactgagc)和引物TD1220(acactccgctatcgctacg)进行菌落PCR，选择P

(4)通过350g/l蔗糖抗性琼脂平板共筛选获得10个菌株，其中3个为F245L+K286V突变序列，5个为F245L序列，剩余2个为蔗糖异构酶的截断序列(共598个氨基酸，573位氨基酸突变为终止密码子)。

(5)挑取(3)平板上的3种单菌落和带pTD176(SIase(WT))质粒的菌落，分别接种到液体培养基中，37℃过夜培养作为种子液，第二天以1：100的比例接入到含300g/L蔗糖的M9培养基中进行摇瓶发酵，然后30℃、220rpm培养，选取合适时间点取样，发酵液于12000rpm离心10min，取上清液过水系滤膜(0.22μm)到液相瓶中，高效液相配备氨基柱安捷伦ZorbaxVC-NH

(6)实验发现与野生型蔗糖异构酶相比，筛选出来的蔗糖异构酶突变体F245L和F245L+K286V的最大转化率均提高了50％以上。两种蔗糖异构酶突变体对异麦芽酮糖的生产也起到了一定的促进作用，说明蔗糖异构酶突变体具有更好的应用性能。见图6所示。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明。任何熟悉本领域此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，这些都属于本专利的保护范围。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。