用于使用磁性隧道结II对脂质层进行免疫传感的方法

本发明涉及诊断学领域。具体地，本发明涉及一种用于确定疑似存在于样品中的分析物的方法，该方法包括使所述样品与包括以下项的传感器元件接触达一定时间并且在一定条件下接触：锚定层，其存在于固体支撑物上；第一结合剂，其能够与分析物特异性结合，并且其被锚定在锚定层中；第二结合剂，其能够在分析物与第一结合剂结合时与分析物特异性结合，并且其被固定在固体支撑物上，所述第二结合剂包括至少一个磁性标记；以及在与第二结合剂功能邻近中的磁性隧道结，该磁性隧道结生成在与第二结合剂的至少一个磁性标记的邻近中引起的信号，时间和条件允许疑似存在于样品中的分析物与第一结合剂的特异性结合，以及第二结合剂与和第一结合剂结合的分析物的特异性结合；以及基于由磁性隧道结生成的改变的信号来检测第一结合剂、分析物和第二结合剂的复合物的形成，由此确定分析物。本发明还涉及一种用于确定疑似存在于样品中的分析物的装置和试剂盒，并且涉及所述装置用于确定疑似存在于样品中的分析物的用途。

免疫测定被广泛用于各种诊断目的。已经开发了几种用于免疫测定的装置。最流行的免疫测定之一是酶联吸附免疫测定(ELISA)。

在ELISA中，将含有目标分析物或疑似含有目标分析物的液体样品施加到由于存在抗体或抗体样分子(诸如适体)而具有特异性结合性质的固定固相上。施加样品后，依次添加、培养和洗去多种试剂，以进行和停止任何检测反应。进行所有这些步骤后，装置中的物理或化学性质(通常是液相)发生了可以检测到的变化。通常，光学变化(例如酶促反应产物的显色)将在最终液相中发生。这些变化与存在于所研究样品中的目标分析物的存在或丰度相关。典型的定量读出通常基于通过分光光度法检测透射光的强度，这涉及穿过液体的某些特定波长的光的透射的定量。检测的灵敏度取决于分析反应期间信号的扩增。由于酶反应是众所周知的扩增过程，因此信号由酶生成，该酶以固定比例连接到检测剂，以允许精确定量。

对于ELISA装置，将分析物结合剂(例如，抗体)固定在固相(诸如固体支撑物结构)上。通常，将抗体包被并干燥到分析多孔板或分析瓶中的孔的透明底部上，有时也包被到孔的侧壁上。然而，纳米粒子或其他珠粒也可以用作ELISA的固相。

对于研究和诊断，ELISA通常以所谓的夹心ELISA的形式使用。在夹心形式中，固定捕获抗体用于捕获，即与存在于施加至所述固定抗体的样品中的分析物特异性结合。捕获抗体与分析物特异性结合后，样品材料被洗去。在后续步骤中，将与固定抗体结合的分析物与特异性结合至分析物的检测抗体或分析物与捕获抗体的复合物一起培养。检测抗体通常包含可检测接头或衔接分子，这允许从溶液中吸引此类可检测标记。

然而，鉴于信号生成所需的脆弱的免疫复合物以及用于此类夹心形式的ELISA的各种组分，存在许多不期望的检测抗体结合的可能性，并因此产生假阳性信号。因此，由于存在假阳性结果的风险，用于研究的夹心ELISA通常需要验证。此外，由于此类脆弱的多组分测定形式的各种缺点，在灵敏度和特异性方面存在限制。

作为本发明的基础的技术问题可以被看作是提供为了满足前述需要的工具和方法。该技术问题通过权利要求书和下文中表征的实施方案来解决。

本发明涉及一种用于确定疑似存在于样品中的分析物的方法，该方法包括：

(a)使所述样品与包括以下项的传感器元件接触达一定时间并且在一定条件下接触：

(i)锚定层，其存在于固体支撑物上；

(ii)第一结合剂，其能够与分析物特异性结合并且其被锚定在锚定层中；

(iii)第二结合剂，其能够在分析物与第一结合剂结合时与分析物特异性地结合，并且其被固定在固体支撑物上，所述第二结合剂包含至少一个磁性标记；以及

(iv)在与第二结合剂的功能邻近中的磁性隧道结，该磁性隧道结生成在与第二结合剂的至少一个磁性标记的邻近中引起的信号；

时间和条件允许疑似存在于样品中的分析物与第一结合剂的特异性结合，以及第二结合剂与和第一结合剂结合的分析物的特异性结合；以及

(b)基于由磁性隧道结生成的改变的信号来检测第一结合剂、分析物和第二结合剂的复合物的形成，由此确定分析物。

应当理解，在说明书和权利要求书中，“一”或“一个”可意指一个或多个，取决于其所用的上下文。因此，例如，对“一个”项目的提及可意指能够利用至少一个项目。

如下文中所用的，术语“具有(have)”、“包括(comprise)”或“包括(include)”旨在具有非限制性含义或限制性含义。因此，具有限制性含义的这些术语可以指这样的情况：除了由这些术语引入的特征之外，在所描述的实施方案中不存在其他特征，即这些术语在“由……组成”或“基本上由……组成”的意义上具有限制性含义。具有非限制性含义，术语是指除了由这些术语引入的特征之外，在所描述的实施方案中还存在一个或多个其他特征的情况。

进一步地，如下文所用的，术语“优选地”、“更优选地”和“最优选地”、“特别地”、“更特别地”、“通常地”和“更通常地”或类似的术语与附加/替代特征结合使用，而不限制替代的可能性。

进一步地，应当理解，如本文所用的术语“至少一个”意指根据本发明可以使用该术语后面提及的项目中的一者或多者。例如，如果该术语指示应当使用至少一个项目，则可以被理解为一个项目或多于一个项目，即两个、三个、四个、五个或任何其他数量。根据该术语所指的项目，本领域技术人员理解该术语可以指的上限(如果有的话)。

根据本发明的方法可以由前述步骤(a)和(b)组成，或者可以包括进一步的步骤，诸如在步骤(a)之前和/或在步骤(b)之后预处理或分离样品，进一步进行一个或多个评估所确定的分析物的步骤，例如，通过将其与参考文献进行比较，以便根据分析物的确定目的提供诊断、预后、环境相关、农业相关或分析相关的结论。

本文所用的术语“确定”涵盖分析物的任何类型的定性或定量确定。定性确定旨在确定样品中是否存在分析物，而定量确定旨在确定分析物的量。定量确定，即量的确定，包括确定绝对量(例如，存在于样品中的分子的重量或数量的总量)或相对量(例如，相对于样品体积(浓度)的量或诸如分数的分类(例如，“高量”、“低量”等)。通常，确定分析物包括确定所述分析物的存在、不存在或量。

本文所指的术语“分析物”涉及适用于通过本发明的方法确定的任何类型的分子或试剂。应当理解，此类分子或试剂可以具有允许本文所指的第一和第二结合剂结合的尺寸和/或结构。此外，如本文别处详细描述的，也可能存在尺寸上限，因为第一和第二结合剂以及交联剂必须能够发挥它们的功能。通常，本文所指的分析物是生物分子，诸如蛋白质；肽；核酸，例如DNA或RNA或小分子(诸如脂质或代谢物)；聚酮化合物，其包括例如类黄酮和异黄酮类；类异戊二烯，其包括例如萜烯、甾醇、类固醇、类胡萝卜素、叶黄素、碳水化合物、苯丙氨酸、生物碱、苯苯环烯醚萜、吲哚、卟啉、激素、维生素、辅因子、木质素、芥子油苷、嘌呤、嘧啶、核苷、核苷酸、醇、烷烃、烯烃、炔烃、芳香族化合物、酮、醛、羧酸、酯、胺、亚胺、酰胺、氰化物、氨基酸、硫醇、硫酯、磷酸酯、硫酸酯、硫醚、亚砜或醚。小分子可以是例如毒素。然而，本发明的方法也可用于确定作为分析物的病毒或者甚至细菌细胞。本发明待确定的分析物也可以是存在于环境样品中并且可用作例如环境污染、农业或其他环境条件的指示剂的分子。通常，所述分析物是蛋白质、肽、病毒、细菌细胞或小分子，优选地是小分子毒素。

本文所用的术语“样品”涉及包含或疑似包含待确定分析物的组合物的任何部分或等分部分。此类样品可以是生物样品，通常从生物体分离，诸如体液或活检样品，或者可以是包括生物体(诸如培养的细胞)的组合物。通常，通过本发明的方法研究所述生物样品用于医学目的，诸如诊断或预测疾病或医学状况。此外，样品可以是环境样品或人工样品。环境样品可以源自任何非生物、天然源，例如环境中存在的溶液(诸如水)或来自组合物(诸如土壤)。人工样品可以是从人工源获得的样品，例如，可以制造的产品组合物或可以在产品的制造过程期间出现的中间组合物。可以研究此类人工样品，例如用于质量控制目的或用于确定特有成分的量。通常，根据本发明的方法的所述样品是生物样品，优选地是体液或活检样品。

根据本发明所用的术语“传感器元件”包括具有被锚定层覆盖的表面的固体支撑物。此外，传感器元件应进一步包括如上所述的分子排列，即第一结合剂，其能够与被锚定在锚定层中的分析物特异性结合，以及第二结合剂，其能够在分析物与第一结合剂结合时与分析物特异性结合，其被固定在固体支撑物上并且包括至少一个磁性标记。此外，磁性隧道结应在与第二结合剂功能邻近中，使得如果第二结合剂的至少一个磁性标记在与所述磁性隧道结功能邻近中，则可以引发信号。

本文所指的术语“锚定层”涵盖能够缔合分子且特别是根据本发明的第一结合剂的任何分子层。根据本发明所指的第一结合剂的缔合应允许第一结合剂或附着于其上的任何锚定分子在锚定层内或其表面上的分子运动。所述锚定层通常是脂质层或脂质双层。本领域技术人员熟知如何用此类锚定层覆盖固体支撑物，以及哪些脂质可以用于产生脂质层或脂质双层。根据本发明适合用作锚定层的典型脂质层或脂质双层可包括例如磷脂层或磷脂双层。所述磷脂层或磷脂双层可特别地包含一种或多种磷脂酰胆碱，诸如1-油酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰胆碱、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱和/或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[(N-(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙酸)琥珀酰]，或一种或多种磷脂酰胆碱和胆固醇的混合物。此外，根据本发明支撑的脂质双层和锚定的磷脂双层膜可用作锚定层。这些是本领域已知的常用的模型脂质膜。

本文所用的术语“固体支撑物”涉及物质的固体组合物，其可以用作固定分子、并且特别是第二结合剂的基础。固体支撑物可以包括无机化合物或有机化合物或两者。通常，用于固体支撑物的合适的无机化合物可以选自由以下项组成的组：二氧化硅、多孔玻璃、铝硅酸盐、硼硅酸盐、金属氧化物(例如氧化铝、氧化铁、氧化镍)和含有这些中的一者或多者的粘土。或者，固体支撑物可包括有机化合物，诸如交联聚合物。合适的交联聚合物的非限制性实例可以选自由以下项组成的组：聚酰胺、聚醚、聚苯乙烯及其混合物。本领域技术人员熟知如何基于待研究的样品的种类、设想用于检测分析物的方法、用于检测分析物的磁性标记的种类和/或用于传感器元件的第二结合剂的种类来选择合适的固体支撑物。固体支撑物还应包括在与固定在所述固体支撑物上的第二结合剂功能邻近中的磁性隧道结。

在“功能邻近”下，应当理解，磁性隧道结相对于第二结合剂位于允许产生由第二结合剂的至少一个磁性标记引发的信号的距离和位置处。如果所述第一结合剂与第二结合剂和如本文别处定义的分析物一起成为复合物的一部分，则可以改变所述信号。

传感器应进一步包括能够与分析物特异性地结合的第一结合剂。所述第一结合剂应锚定在锚定层中。

本文所指的术语“第一结合剂”涉及能够与分析物特异性结合的分子，即不与疑似存在于样品中的分析物以外的其他分子结合从而不与其他分子发生交叉反应的分子。原则上，可以通过本领域众所周知的技术来测试特异性结合，包括用于从包括不同候选试剂的文库中鉴定与分析物特异性结合的试剂的筛选测定。

优选地，可以用作能够与所需分析物特异性结合的第一结合剂的分子可以是抗体。根据本发明，作为结合剂的抗体涵盖优选地与分析物特异性结合的所有类型的抗体。优选地，本发明的抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体或仍然能够与分析物特异性结合的此类抗体的任何片段。本文所用的术语抗体所包括的此类片段涵盖双特异性抗体、合成抗体、Fab、F(ab)2Fv或scFv片段或这些抗体片段中的任一者的化学修饰衍生物。通常与所需分析物特异性结合的抗体或其片段可以通过使用例如在Harlow和Lane“Antibodies，A Laboratory Manual”，CSH Press，Cold Spring Harbor，1988中描述的方法来获得。单克隆抗体可以通过包括将小鼠骨髓瘤细胞与源自免疫哺乳动物并且优选地免疫小鼠的脾细胞融合的技术来制备(

此外，可以优选地用作能够与所需分析物特异性结合的第一结合剂的分子可以是适体。根据本发明的作为结合剂的适体可以是与特异性靶点分析物结合的寡核酸或肽分子(Ellington 1990，Nature 346(6287)：818-22)。Bock 1992，Nature 355(6360)：564-6)。寡核酸适体是通过重复多轮选择或通过指数富集(SELEX技术)对配体进行所谓的系统进化而设计的。肽适体通常由两端部附着到蛋白支架的可变肽环组成。此双重结构约束应将肽适体的结合亲和力增加到纳摩尔范围内。所述可变肽环长度优选地由十至二十个氨基酸组成，并且支架可以是具有改善的溶解度和容量性质的任何蛋白质，诸如硫氧还蛋白-A。可以使用不同的系统进行肽适体选择，包括例如酵母双杂交系统(参见例如，Hoppe-Seyler2000，J Mol Med.78(8)：426-30)。根据本发明还涵盖仍然能够与分析物特异性地结合的所述适体的任何片段。所述片段可以以分离的形式使用，或者可以是融合分子的一部分，即包括所述适体片段以及其他部分(诸如接头部分或衔接分子)的分子。本领域技术人员熟知如何通过本领域众所周知的技术(诸如等离子体表面共振测量)来测试特异性结合。

可以优选地用作能够特异性结合所需分析物的第一结合剂的分子也可以是受体分子。根据本发明所指的作为结合剂的受体分子通常是与配体特异性结合并且在配体结合后被激活以发挥其生物功能的蛋白质。根据本发明此类仍然能够与配体特异性结合的受体分子或其片段也可以用作结合剂，用于作为分析物的配体或源自配体但仍然能够通过受体分子或其片段(诸如配体的拮抗或激动作用变体)结合的分子。优选地，根据本发明设想作为结合剂的受体分子可以是跨膜型受体蛋白，诸如G蛋白偶联受体，例如代谢受体，酶联受体，诸如受体酪氨酸激酶，例如，生长因子受体，免疫受体，诸如病毒受体，细胞表面抗原，T细胞受体，例如CD4、CD3或CD8，或MHC蛋白，细胞粘附分子，诸如整联蛋白、钙粘蛋白、选择素或黏结蛋白聚糖，神经元受体或病原体受体，诸如Toll样受体。受体分子也可以是核受体蛋白，诸如核激素受体，例如糖皮质激素受体、视黄酸受体或甲状腺激素受体。本领域技术人员熟知与待确定分析物或其片段特异性结合的受体分子或其片段。此外，特异性结合可以通过本领域众所周知的技术(诸如等离子体表面共振测量)进行测试。

然而，可以优选地用作能够与所需分析物特异性结合的第一结合剂的分子也可以是配体分子。如根据本发明所提及的作为结合剂的配体分子通常是与受体分子特异性结合并且在受体与所述受体分子结合后激活的蛋白质或肽。根据本发明此类仍然能够与受体分子特异性结合的配体分子或其片段也可以用作结合剂，用于作为分析物的受体或源自受体分子但仍然能够通过配体分子或其片段(诸如受体的可溶性变体结合)结合的分子。此外，配体也可以是可用于确定在生物体样品中的某种抗体的任何抗原。优选地，根据本发明设想作为结合剂的配体分子可以是肽激素、神经递质、生长因子，诸如血管生成素、BMP、神经营养因子、EGF、表皮蛋白、EPO、FGF、GDNF、GDF、胰岛素或胰岛素样生长因子、TGF、中性粒细胞、VEGF、细胞因子，诸如白细胞介素、干扰素、淋巴因子、单核因子、集落刺激因子或趋化因子、细胞外基质蛋白，诸如纤连蛋白、玻连蛋白、胶原、锚蛋白或层粘连蛋白等。本领域技术人员熟知与待确定分析物或其片段特异性结合的配体分子或其片段。此外，特异性结合可以通过本领域众所周知的技术(诸如等离子体表面共振测量)进行测试。

进一步优选地，第一结合剂可以是设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)。DARPin是基因工程抗体模拟蛋白，可设计用于实现高度特异性和高亲和力的靶蛋白结合。它们源自天然锚蛋白重复蛋白。通常，DARPin包括至少三个重复模块，其中最N末端和最C末端模块(也称为“帽”)保护蛋白质的疏水核心(Binz 2003，Journal of Molecular Biology.332(2)：489-503)。

通常，所述第一结合剂选自由以下项组成的组：抗体或其片段、适体、受体分子或其片段、以及配体分子或其片段。更典型地，它是抗体或其片段或适体。

此外，根据本发明的第一结合剂应锚定在锚定层中。如根据本发明所提及的锚定的第一结合剂通常应与锚定层相关联或在锚定层内。因此，它的运动通常被限制为基本上在空间的二维中。

优选地，所述第一结合剂通过锚定分子，更优选地通过脂质锚定在锚定层中。根据本发明用于锚定第一结合剂的合适的脂质取决于锚定层的性质，并且可以由本领域技术人员毫不费力地选择。锚定分子通常可以经由接头分子连接到至少一个，优选地多个第一结合剂。合适的接头分子允许连接许多第一结合剂和至少一个锚定分子。优选地，合适的接头分子可以是环DNA分子。因此，多个第一结合剂可以经由相同的锚定分子锚定到锚定层。

通常，所述第一结合剂的量超过所述第二结合剂的量10至100、20至80、30至70或40至60倍。

传感器还应包括第二结合剂，该第二结合剂能够在分析物与第一结合剂结合时与分析物特异性结合。所述第二结合剂应被固定在固体支撑物上。此外，如本文别处所述，磁性隧道结与第二结合剂之间应功能邻近。因此，第二结合剂同样应在与磁性隧道结功能邻近中。此外，第二结合剂应包括至少一个磁性标记。

能够与分析物特异性结合的术语“第二结合剂”涉及其能够在分析物与第一结合剂结合时与分析物或分析物特异性结合的分子，即不与疑似存在于样品中的分析物或分析物与第一结合剂的复合物之外的其他分子结合并因此发生交叉反应。通常，所述第二结合剂选自由以下项组成的组：抗体或其片段、适体、受体分子或其片段、以及配体分子或其片段。更典型地，它是抗体或其片段或适体。通常，第二结合剂与第一结合剂来自相同的前述分子类别。根据第一结合剂制备的抗体或其片段、适体、受体分子或其片段以及配体分子或其片段的定义经适当修改后适用于第二结合剂。

第二结合剂应被固定在固体支撑物上。优选地，所述第二结合剂的固定是永久固定。用于将第二结合剂固定到固体支撑物上的合适技术取决于固体支撑物的性质和/或第二结合剂的性质，并且是本领域技术人员众所周知的。应当理解，在固定后，第二结合剂不应能够在锚定层之内或之外移动其位置。然而，第二结合剂应能够进行所需的弯曲和其他分子运动或构象变化，以使与分析物结合或第一结合剂与分析物结合。

第二结合剂与分析物和第一结合剂的相互作用应当优选地是可逆的相互作用。设想缔合速率通常大于解离速率，使得第一结合剂、分析物和第二结合剂的复合物在一定时间内保持稳定，从而允许在所述时间窗口期间通过检测在第二结合剂的位置附近内的至少一个磁性标记的存在或丰度或发生率来确定它们。

第二结合剂可包括作为分子的一部分的至少一个磁性标记。或者，至少一个磁性标记可以通过接头连接到第二结合分子。根据本发明设想了永久连接以及可逆连接。可逆连接可以例如通过使用本领域众所周知的基于生物素-链霉亲和素的分子衔接系统来实现。

应当理解，如果第二结合剂处于未结合状态，则至少一个磁性标记通常位于功能邻近之外，并且如果第二结合剂是复合物的一部分，则至少一个磁性标记变为位于功能邻近中。因此，第二结合剂和/或至少一个磁性标记的构象变化应导致所述磁性标记相对于磁性隧道结的位置改变。由磁性隧道结生成的信号的改变，在这种情况下，信号的检测或信号的丰度，应指示复合物的形成，并且因此指示样品中分析物的存在。

同样典型地，如果第二结合剂处于未结合状态，则所述至少一个磁性标记位于锚定层之外，并且如果第二结合剂是复合物的一部分，则所述至少一个磁性标记变为位于锚定层中。在这种情况下，至少一个磁性标记还位于磁性隧道结的功能邻近之外，并且在复合物形成之后变为位于在锚定层内的功能邻近中。因此，由磁性隧道结生成的信号的改变，在这种情况下，信号的检测或信号的丰度，应指示复合物的形成，并因此指示样品中分析物的存在。

应当理解，如果第二结合剂处于未结合状态并且变为在与磁性隧道结功能邻近中，则至少一个磁性标记通常也以第一发生率位于与磁性隧道结的功能邻近中，并且如果第二结合剂是复合物的一部分，则至少一个磁性标记以第二发生率变为位于与磁性隧道结功能邻近中，其中所述第二发生率高于第一发生率。在不希望被理论束缚的情况下，未结合的第二结合剂和作为复合物的一部分的第二结合剂的物理和化学性质不同，因此，分子运动改变，并且在与磁性隧道结功能邻近中的至少一个磁性标记的发生率因此而改变。因此，由磁隧道结生成的信号的改变，在这种情况下，检测到在与磁性隧道结功能邻近中的至少一个磁性标记的改变的发生率应指示复合物形成，并且因此，检测样品中是否存在分析物。

本文所用的术语“磁性标记”涉及可在与磁性隧道结功能邻近中被检测到的分子。因此，根据本发明，磁性标记通常被设想为磁性标记。典型的磁性标记包括铁-铂纳米颗粒、铁纳米颗粒、镍纳米颗粒或钴纳米颗粒。磁性标记可以可逆地或永久地与第二结合剂结合。为此，磁性标记可以是能够与第二结合剂可逆地结合的分子，或者它可以是已经是所述第二结合剂的一部分的分子或部分。通常，所述磁性标记包括接头，该接头可通过交联剂共价连接到固体支撑物。

本文所用的术语“磁性隧道结”是指磁响应检测器，诸如磁性隧道结或磁性自旋阀(参见，例如，US 5,981,297；Fernandes 2020，Nanomedicine：Nanotechnology，Biology，and Medicine 30，102287或Denmark 2019，Journal of Electronic Materials(48)：4749-4761)。

作为传感器元件的检测器的磁性隧道结通常被放置在固体支撑物下方，并且所述检测器能够选择性地检测在与所述第二结合元件功能邻近中的信号。根据磁性标记，可以施加不同的检测技术。此外，根据检测技术，可能需要向磁性隧道结施加磁场。

应当理解，来自磁性标记的检测到的改变的信号可以随后被传输到评估单元。优选地，所述评估单元可以包括数据处理元件，诸如计算机，其具有用于基于检测到的磁性标记的信号来确定样品中分析物的存在、不存在或量的实现算法。

此类实现算法可以评估从第二结合剂、分析物和第一结合剂的复合物中的磁性标记引发的测量信号的信号强度、信号持续时间和其他预定的参数。基于所述评估，可以识别和验证真正的阳性信号，并且可以识别和忽略噪声信号以进行进一步评估。本领域技术人员熟知可以使用什么算法以及如何在本发明的装置中实现这些算法。优选地，通过测量由至少一个磁性标记引发的信号的强度和/或持续时间来检测第一结合剂、分析物和第二结合剂的复合物的形成。更优选地，可以在预定的特征时间段内检测所述信号。真实信号的特征优选地是在取决于包括第一结合剂、分析物和第二结合剂的复合物的一个或多个缔合常数的第一时间窗口内的形成，预定义时间窗口的持续性和在取决于包括第一结合剂、分析物和第二结合剂的复合物的一个或多个解离常数的第二时间窗口内的解离。通常，与由自由移动的第一结合剂包括的至少一个磁性标记引发的信号相比，可以在显着更长的时间内检测到真实信号，该自由移动的第一结合剂随机地穿过邻近固定的第二结合剂的锚定层。后者仅能生成短噪声信号。

为了精确评估根据本发明的方法检测到的磁性标记的信号并基于其确定分析物，可以施加计算机实现算法，特别是人工智能算法、机器学习算法等。

根据本发明的方法，在步骤(a)中，将包括待确定的分析物或疑似包括待确定的分析物的样品与如本文别处详细说明的生物传感器接触。

本文所用的术语“接触”涉及使前述组分在物理上邻近，使得第一和/或第二结合剂可以与分析物(如果存在于样品中)结合。应当理解，第一结合剂与分析物的结合以及第二结合剂与分析物的结合或者与第一结合剂和分析物的复合物的结合可能需要时间和施加合适的条件。本领域技术人员熟知实现结合需要多长时间以及需要施加什么条件。例如，可以将样品和结合剂溶解或与调节盐浓度和/或pH值的缓冲液混合。应当理解，可以施加的合适的缓冲液和其他辅助组分取决于待使用的结合剂和待确定的分析物的化学性质。

在本发明的方法的步骤(a)中，还使第一结合剂和分析物与固定在固体支撑物上的第二结合剂接触，该第二结合剂能够在第一结合剂与分析物结合时与分析物或第一结合剂特异性结合。通常，在施加样品之前，提供包括锚定到锚定层的第一结合剂和固定的第二结合剂的传感器元件上的布置，然而，可以使样品与第一结合剂接触，并将样品施加至包括固定在固体支撑物上的第二结合剂的锚定层。

作为在本发明的方法的步骤(a)期间发生的前述活动的结果，分析物将被第一结合剂结合。分析物和第一结合剂的所述复合物应当在锚定层内移动，并且应当被固定在固体支撑物上的第二结合剂结合，使得生成包括第一结合剂、分析物和第二结合剂的复合物(“锁定”)。由于分子结合动力学，此复合物将在邻近固体支撑物上第二结合分子的固定位置持续存在一段特征时间窗口，直到其溶解(“解锁”)。在本发明的方法中施加的第二结合剂应当包括至少一个磁性标记，通常与其永久地或可逆地结合。

在本发明的方法的步骤(b)中，基于从由磁性隧道结生成的至少一个磁性标记引发的信号来检测第一结合剂、分析物和第二结合剂的前述复合物，由此确定分析物。

本文所用的术语“检测”涉及识别磁性标记的存在、不存在和/或量。应当理解，磁性标记通常生成可由磁性隧道结测量的信号。信号强度和/或持续时间通常指示在与磁性隧道结功能邻近中的复合物中存在的磁性标记分子的量。优选地，通过测量由至少一个磁性标记引发的信号的强度和/或持续时间来检测第一结合剂、分析物和第二结合剂的复合物的形成。更优选地，可以在预定的特征时间段内检测所述信号。然而，本文所指的检测可以进一步涵盖检测改变的信号。具体地，如果在第二结合剂中包括的至少一个磁性标记以第一发生率在与磁性隧道结功能邻近中，并且分子运动行为在复合物形成后改变，则可以通过在复合物形成后可观察到的第二发生率来检测复合物形成。因此，本文所用的检测还可以涵盖当在与磁性隧道结功能邻近中时由至少一个磁性标记所引发的信号的改变的发生率的检测。

在本发明的方法中，第一和第二结合剂可用于确定不同的分析物。在此类情况下，应当理解，一旦形成针对此类不同分析物的复合物，每种复合物必须拥有不同的磁性标记，该磁性标记能够在磁性隧道结上生成在至少一种信号特征上不同的信号。

在本发明的方法的一个具体实施方案中，所述固体支撑物是孔或预定的细分检测区域。优选地，已在每个孔或预定的细分检测区域上固定有预定义量的第二结合剂。所述方法对于确定分析物特别有用，包括确定所述分析物的量。通常，通过对其中已形成复合物的孔或预定的细分检测区域进行计数来确定所述量。根据此特定实施方案，针对每个孔或预定的细分区域检测分析物的存在或不存在或量。然后，应确定阳性孔或预定的细分区域的数量。阳性孔或预定的细分区域应当是表现出如本文别处所述的适当复合物形成的特征信号的区域，其具有预定的强度或持续时间，例如，高于预定的强度阈值和/或超过预定的时间窗口的可测量信号。基于阳性孔或预定的细分区域以及固定在每个所述孔或预定的细分区域上的第二结合剂的预定义量，可以例如，通过计算来确定分析物的量。例如，如果每个孔或预定的细分区域理想地含有一种第二结合剂，则存在于样品中的分析物的一种分子将生成一种复合物。因此，如果确定了孔中或预定的细分区域上复合物的存在，则此存在反映了存在于样品中的一种分析物的存在。因此，在诸如孔或任何其他预定的细分区域的分离物品上使用预定义量的第二结合剂，允许定量或半定量确定存在于样品中的分析物分子。此技术也被称为“数字”检测。

在本发明的方法中，特别地，为了数字检测的目的，所述样品与至少100个传感器元件、至少300个传感器元件、至少500个传感器元件、至少1000个传感器元件、至少5000个传感器元件、至少10000个传感器元件、至少50000个传感器元件或者至少100000个传感器元件接触。更优选地，所述分析物的量包括对由磁性隧道结生成的各个测量信号进行计数。

有利地，根据本发明已经发现，使用通过在夹心测定形式中与锚定层(诸如脂质层)关联而将其运动限制为基本二维的第一结合剂改善了灵敏度并抑制了不期望的背景噪声。根据本发明，包括第一结合剂(例如，抗体)、待确定的分析物、第二结合剂(例如，抗体)的免疫复合物以一定的动力学形成、持续一定的时间窗口并且以一定的动力学溶解(“锁定、解锁”原理)。此外，根据所使用的分子构型，可以预期一定强度的信号。因此，在本发明的方法中，确定了复合物形成和复合物溶解的动力学测量，而不是单个形成事件。这允许动态实时测量，甚至可以使洗涤步骤和其他处理变得不必要。由于锚固层的使用，还应减少在固体支撑物上引起噪声的事件。根据检测器的性质，可以将复合物形成事件基本上单一化。根据本发明，使用测量由磁性标记引发的信号的磁响应检测器，该磁响应检测器与在分析物分子存在的情况下引发复合物形成的单个第二结合剂相关联，应当理解，复合物形成应代表存在于样品中的所述分析物分子。在此类数字形式中，由各个检测器接收的信号的数量可用于对存在于样品中的分析物分子进行计数。

由于本发明，可以以改善的灵敏度和特异性来确定在样品中的分析物。此外，甚至可以确定单分子事件。

本发明涉及一种用于确定疑似存在于样品中的分析物的装置，该装置包括传感器元件，该传感器元件包括：

(i)锚定层，其存在于固体支撑物上；

(ii)能够与分析物特异性地结合的第一结合剂，该第一结合剂被锚定在锚定层中；

(iii)第二结合剂，其能够在所述分析物与所述第一结合剂结合时与所述分析物特异性地结合，并且其被固定在所述固体支撑物上，所述第二结合剂包含至少一个磁性标记；以及

(iv)在与第二结合剂的功能邻近中的磁性隧道结，该磁性隧道结生成在与第二结合剂的至少一个磁性标记的邻近中引起的信号。

本文所用的术语“装置”涉及一种系统，该系统包括可操作地彼此连接的前述组分，以允许根据本发明的方法确定分析物。

根据本发明的传感器元件可以位于由该装置所包括的反应区中。反应区可以直接进行样品施加，或者它可以连接到施加样品的上样区。在后一种情况下，样品可以经由上样区和反应区之间的连接主动或被动地输送至反应区。此外，反应区还应连接到检测器。合适的检测器和检测技术在本文别处详细描述。反应区与检测器之间的连接应使得检测器能够检测到磁性标记。合适的连接取决于用于测量磁性标记的存在或量的技术。传感器元件还包括在与第二结合剂的功能邻近中的磁性隧道结，该磁性隧道结生成在与第二结合剂的至少一个磁性标记的邻近中引起的信号。

一般而言，本发明涉及本发明的装置用于确定疑似存在于样品中的分析物的用途。

此外，本发明涉及一种用于确定疑似存在于样品中的分析物的试剂盒，该试剂盒包括本发明的装置。

本文所用的术语“试剂盒”是指进行本发明的方法所需的组分的集合，包括本发明的装置。通常，试剂盒的组分在单独的容器中或单个容器内提供。容器通常还包括用于进行本发明方法的说明。这些说明可以是手册的形式，或者可以由计算机程序代码提供，该计算机程序代码当在计算机或数据处理装置上实现时能够进行或支持在本发明的方法中提及的分析物的确定。计算机程序代码可提供于数据存储介质或装置诸如光学存储介质(例如，光盘)上或直接提供于计算机或数据处理装置上或可以以下载格式提供，诸如链接至可访问的服务器或云。此外，试剂盒通常可以包括具有用于校准或验证的标准化量或其他参考量的分析物溶液。根据本发明的试剂盒还可以包括进行本发明的方法所必需的其他组分，诸如检测磁性标记所需的洗涤溶液、溶剂和/或试剂。此外，其可以部分地或以其整体构成本发明的装置。

以下实施方案是根据本发明设想的特别优选的实施方案。上述术语的所有定义和解释经适当修改后适用。

实施方案1.一种用于确定疑似存在于样品中的分析物的方法，该方法包括：

(a)使所述样品与包括以下项的传感器元件接触达一定时间并且在一定条件下接触：

(i)锚定层，其存在于固体支撑物上；

(ii)能够与所述分析物特异性地结合的第一结合剂，所述第一结合剂被锚定在所述锚定层中；

(iii)第二结合剂，其能够在所述分析物与所述第一结合剂结合时与所述分析物特异性地结合，并且其被固定在所述固体支撑物上，所述第二结合剂包含至少一个磁性标记；以及

(iv)在与第二结合剂的功能邻近中的磁性隧道结，该磁性隧道结生成在与第二结合剂的至少一个磁性标记的邻近中引起的信号；

时间和条件允许疑似存在于样品中的分析物与第一结合剂的特异性结合，以及第二结合剂与和第一结合剂结合的分析物的特异性结合；以及

(b)基于由磁性隧道结生成的改变的信号来检测第一结合剂、分析物和第二结合剂的复合物的形成，由此确定分析物。

实施方案2.根据实施方案1所述的方法，其中第一结合剂、分析物和第二结合剂的复合物的所述形成是通过测量由至少一个磁性标记引发的信号的强度和/或持续时间来检测的。

实施方案3.根据实施方案2所述的方法，其中可以在预定的特征时间段内检测所述信号。

实施方案4.根据实施方案1至3中任一项所述的方法，其中如果第二结合剂处于未结合状态，则所述至少一个磁性标记位于功能邻近之外，并且如果第二结合剂是复合物的一部分，则变为位于功能邻近中。

实施方案5.根据实施方案1至4中任一项所述的方法，其中如果第二结合剂处于未结合状态，则所述至少一个磁性标记位于锚定层之外，并且如果第二结合剂是复合物的一部分，则所述至少一个磁性标记变为位于锚定层内。

实施方案6.根据实施方案1至5中任一项所述的方法，其中如果第二结合剂处于未结合状态并且变为在与磁性隧道结功能邻近中，则所述至少一个磁性标记以第一出现率位于与磁性隧道结邻近功能中，如果第二结合剂是复合物的一部分，则所述至少一个磁性标记以第二出现率位于与磁性隧道结邻近功能中，其中所述第二发生率高于第一发生率。

实施方案7.根据实施方案1至6中任一项所述的方法，其中所述分析物是蛋白质、肽、病毒、细菌细胞或小分子。

实施方案8.根据实施方案1至7中任一项所述的方法，其中所述锚定层是脂质层或脂质双层。

实施方案9.根据实施方案1至8中任一项所述的方法，其中所述第一结合剂经由锚定分子被锚定在锚定层中。

实施方案10.根据实施方案9所述的方法，其中所述锚定分子是脂质。

实施方案11.根据实施方案9或10所述的方法，其中所述锚定分子经由接头分子、优选环DNA分子连接到至少一个第一结合剂。

实施方案12.根据实施方案1至11中任一项所述的方法，其中所述第一结合剂选自由以下项组成的组：抗体或其片段、适体、受体分子或其片段、以及配体分子或其片段。

实施方案13.根据实施方案1至12中任一项所述的方法，其中所述第二结合剂选自由以下项组成的组：抗体或其片段、适体、受体分子或其片段、以及配体分子或其片段。

实施方案14.根据实施方案1至13中任一项所述的方法，其中所述第一结合剂的量超过所述第二结合剂的量10至100、20至80、30至70或40至60倍。

实施方案15.根据实施方案1或14中任一项所述的方法，其中所述确定分析物包括确定所述分析物的量。

实施方案16.根据实施方案1至15中任一项所述的方法，其中所述样品与至少100个传感器元件、至少300个传感器元件、至少500个传感器元件、至少1000个传感器元件、至少5000个传感器元件、至少10000个传感器元件、至少50000个传感器元件或者至少100000个传感器元件接触。

实施方案17.根据实施方案16所述的方法，其中所述确定所述分析物的量包括对由磁性隧道结生成的各个测量信号进行计数。

实施方案18.根据实施方案1至17中任一项所述的方法，其中所述样品是生物样品，优选地是体液或活检样品。

实施方案19.一种用于确定疑似存在于样品中的分析物的装置，该装置包括传感器元件，该传感器元件包括：

(i)锚定层，其存在于固体支撑物上；

(ii)能够与所述分析物特异性地结合的第一结合剂，所述第一结合剂被锚定在所述锚定层中；

(iii)第二结合剂，其能够在所述分析物与所述第一结合剂结合时与所述分析物特异性地结合，并且其被固定在所述固体支撑物上，所述第二结合剂包含至少一个磁性标记；以及

(iv)在与所述第二结合剂的功能邻近中的磁性隧道结，所述磁性隧道结生成在与所述第二结合剂的所述至少一个磁性标记的邻近中引起的信号。

实施方案20.实施方案19的装置用于确定疑似存在于样品中的分析物的用途。

实施方案21.一种用于确定疑似存在于样品中的分析物的试剂盒，该试剂盒包括实施方案19的装置。

本说明书中引用的所有参考文献的全部公开内容和在本说明书中特别提及的公开内容均以引用方式并入本文。

附图说明

图1：传感器布置的示意图。左侧显示处于“解锁”阶段的游离的第二结合剂。第二结合剂被固定在固体支撑物上，并且包括锚定层外的磁性标记以及结合域，例如，抗体片段。右侧显示包括第一结合剂(例如，抗体片段)的复合物，其经由脂质锚定物、分析物和第二结合剂被锚定在锚定层中(“锁定”阶段)。由于第二结合剂与分析物的结合，磁性标记被定位在锚定层中，从而在与固体支撑物下方所示的磁性隧道结功能邻近中。结果产生信号或改变的信号，其可用于检测复合物的存在，并因此检测样品中分析物分子的存在。

图2：传感器布置的示意图。(A)游离的第二结合剂显示处于“解锁”阶段。第二结合剂具有结合域，例如，抗体片段，所述第二结合剂被固定在固体支撑物上，并且包括在锚定层内或锚定层外的磁性标记，该磁性标记取决于第二结合剂可以进行的分子运动。在此解锁阶段中，第二结合剂应能够进行大分子运动，使得在与磁性隧道结功能邻近中的磁性标记的发生率较低。因此，在预定义的时间窗口内仅出现有限数量的信号。(B)第二结合剂显示为与分析物和第一结合剂形成复合物，即处于“锁定”阶段。在此锁定阶段中，第二结合剂应能够仅进行微笑的分子运动，使得在与磁性隧道结功能邻近中的磁性标记的发生率较高。因此，与(A)相比，在预定义的时间窗口内仅出现更高数量的信号。